CC BY
28
Разработка отечественной живой аттенуированной вакцины против краснухи на основе штамма «Орлов» (экспериментальные исследования)
И.Н. Лаврентьева (pasteur.lawr@mail.ru), А.Б. Жебрун
ФГУН «НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера» Роспотребнадзора, Санкт-Петербург
Резюме
Представлены результаты разработки живой аттенуированной вакцины против краснухи на основе вакцинного штамма «Орлов-В» и диплоидной линии клеток фибробластов эмбриона человека «М-22». Разработаны технологические подходы получения вакцины, обоснована возможность ее промышленного выпуска на данном тканевом субстрате. В доклинических испытаниях на обезьянах макака-резус показаны отсутствие остаточной нейровирулентности, высокая иммуногенная и протективная активность штамма «Орлов-В», не уступающие по этим показателям препарату сравнения - вакцинному штамму Wistar RA 27/3. В результате сравнительного генетического анализа штаммов Wistar RA 27/3 и «Орлов-В» последний идентифицирован как вирус генотипа 2С; установлено, что штамм «Орлов-В» генетически более близок к циркулирующим на территории России изолятам вируса краснухи, чем вакцинный штамм Wistar RA 27/3. Полученные результаты свидетельствуют о возможности создания живой аттенуированной вакцины против краснухи на основе штамма «Орлов-В» и целесообразности ее применения на территории Российской Федерации.
Ключевые слова: краснуха, вакцина, вакцинный штамм, генотип, технология, доклинические испытания, обезьяны макака-резус, специфическая безопасность, специфическая активность
Введение
Штамм «Орлов» был выделен в Ленинграде (1969 г.) от ребенка с манифестной формой краснухи, аттенуирован серийными пассажами в первично трипсинизированной культуре клеток почки кролика (ППК) и депонирован в ГКМВ как вакцинный в 1979 году.
Проведенные в том же году клинические испытания экспериментальных серий вакцины,созданной на основе данного штамма, показали высокую иммуногенную активность (100% серокон-версий в группе серонегативных привитых, СГТ антител - 8,1 ^2), а также низкую реактогенность препарата (1% клинических реакций средней тяжести).
В 1995 году в рамках реализации Федеральной целевой программы «Вакцинопрофилактика» штамм «Орлов» был восстановлен до исходных показателей биологической активности, сертифицирован в ГИСК им. Л.А. Тарасевича как вак-
Elaboration Live Attenuation Rubella Vaccine on the Dasis of «Orlov» Vaccine Strain (Experimental Dates)
I.N. Lavrentieva (pasteur.lawr@mail.ru), A.B. Zhebrun
Pasteur Institute of Epidemiology and Microbiology, St. Petersburg
Abstraot
The results elaboration live attenuation rubella vaccine are presented. There is demonstrated that rubella vaccine with «Orlov» strain and diploid «M-22» cells may be obtain. Preclinical study of rubella vaccine strain «Orlov» was carried out on rhesus monkeys (Macaca rhesus). Neurovirulence of there strain was not found in clinical survey and by histodiagnosis as detected by inoculation of the experimental animals. High specificity and protective activity of the studied rubella virus vaccine strain «Orlov» were demonstrated on the other experimental group of animals being comparable to the specificity for the Wistar RA 27/3 rubella virus vaccine strain. The lack of contigiousness of studied strain was determined in same assay.
Endemic for Russian Federation vaccine strain «Orlov» is the 2C genotype virus and more congenial for the epidemic Russian isolates than Wistar RA 27/3 strain as demonstrated.
The conclusion about fitness of «Orlov» strain for producing domestic vaccine against rubella virus is made.
Key words: rubella, vaccine, vaccine strain, genotype, technology, preclinical study, Macaca rhesus monkeys, specific safety, specific activity
цинный (по лабораторным контролям) и получил наименование «Орлов-В».
Доклинические испытания штамма «Орлов-В»
Лабораторно-экспериментальные серии вакцины, полученные на основе штамма «Орлов-В», испытаны на серонегативных к краснухе обезьянах макака-резус в 2002 - 2004 годах на базе ГУН «НИИ медицинской приматологии» РАМН (г. Адлер-Сочи) в соответствии с действующим нормативным документом «Государственные испытания и регистрация новых иммунобиологических препаратов» (СП 3.3.2.561-96).
В опытах использован препарат сравнения однонаправленного действия - краснушная вакцина Rudivax производства «Санофи-Пастер» (Франция), действующее начало препарата - вакцинный штамм Wistar RA27/3.
Исследование включало определение: специфической безопасности (остаточной нейровирулент-
epid 3 (52).indd 72
7/1/10 3:24:57 PM
ности, контагиозности); специфической активности (иммуногенной и протективной активности); иммунологической безопасности восстановленного штамма «Орлов».
В результате испытания установлены:
1. Специфическая безопасность штамма «Орлов-В» (контроль остаточной нейровирулентности)
Тест на остаточную нейровирулентность проведен на десяти обезьянах, девять из которых были интрацеребрально заражены штаммом «Орлов-В», одна - штаммом Wistar RA27/3. Исследуемый материал вводили в область зрительных бугров обоих полушарий головного мозга. Заражающая доза соответствовала десяти прививочным дозам для человека.
На основе полученных результатов и критериев, изложенных в нормативном документе (СП 3.3.2.561-96) сделано заключение об отсутствии остаточной нейровирулентности штамма «Орлов-В», а именно:
• отсутствии у всех подопытных животных клинических проявлений поражения ЦНС;
• отсутствии вирус-специфических поражений тканей головного мозга в области передней центральной извилины, задней центральной извилины, зрительного бугра, продолговатого мозга; тканей спинного мозга в области шейного и поясничного утолщений;
• а также о выработке вирус-специфических антител (АТ) у 100% интрацеребрально зараженных животных.
2. Специфическая активность штамма «Орлов-В» (по критериям иммуногенной и протективной активности)
Иммуногенную активность штамма «Орлов-В» оценивали в РТГА через 28 суток после однократной иммунизации 20 обезьян (прививочная доза -не менее 1000 ТЦД50 ) по количеству сероконверсий и напряженности поствакцинального иммунитета. Параллельно проводили контроль контагиозных свойств исследуемого вируса. Группа контроля -три обезьяны - была иммунизирована вакциной Rudivax.
Иммунизация сопровождалась 100%-ной серо-конверсией. Напряженность иммунитета характеризовалась высокими показателями: титры АТ регистрировали на уровне 1:160 и выше. При этом СГТ в опытной и контрольной группах привитых совпала и составила 1:388, или 8,57 lg2. В сыворотке крови контактных животных специфические антитела не обнаруживались, что свидетельствует об отсутствии контагиозных свойств у восстановленного штамма «Орлов».
Протективную активность определяли по устойчивости иммунизированных животных к заражению патогенным штаммом вируса краснухи. Наличие инфекционного процесса определяли по развитию у зараженных животных вирусемии, ко-
торую регистрировали в ПЦР в интервале от 4-х до 24 суток после инфицирования.
Иммунизация как штаммом «Орлов-В», так и препаратами сравнения защитила животных от проникновения вируса в кровяное русло, в то время как в контрольной группе обезьян в ответ на заражение патогенным штаммом в 100% случаев регистрировалась вирусемия, свидетельствующая о развитии краснушной инфекции.
3. Иммунологическая безопасность штамма «Орлов-В» Онаопределена по показателям функциональной активности иммунокомпетентных клеток иммунизированных животных и их интерфероново-му (ИНФ) статусу. Спустя 7 - 28 суток после иммунизации у привитых животных определилась тенденция к активации натуральных киллеров, а также маркеров В-клеточного звена иммунитета. Через 14 суток после вакцинации у всех иммунизированных животных отмечали 4 - 8-кратное снижение уровня альфа- и гамма-ИФН. Через 28 - 45 суток после иммунизации количественные показатели активности иммунокомпетентных клеток и уровня ИФН возвращались к исходным величинам и не отличались от них более чем в 1,5 раза. Иммунологические сдвиги в системе врожденного иммунитета в группе плацебо (неиммунизирован-ные обезьяны) не наблюдались.
Заключение об иммунологической безопасности штамма «Орлов-В» сделано на основании полученных результатов и критериев, перечисленных в СП 3.3.2.561-96:
• продолжительность изменений иммунологических показателей не должна превышать 45 дней с момента введения вакцины;
• изменения величины показателей численности и функциональной активности иммунокомпетентных клеток не должны отличаться более чем в 1,5 раза от исходных и аналогичных показателей в группе, получавшей плацебо и обследованной в те же сроки.
Технологические подходы к получению краснушной вакцины
Изучена возможность использования более технологичного тканевого субстрата для получения вакцины против краснухи. Выбор диплоидной линии клеток-фибробластов кожно-мышечного лоскута эмбриона человека «М-22» определен следующим:
1. Чувствительность диплоидной линии «М-22» к вакцинному штамму «Орлов-В» соответствует чувствительности первичной культуры клеток ППК, к которой адаптирован указанный штамм. Средние показатели инфекционной активности вируса в первичной (ППК) и диплоидной («М-22») культурах клеток составляют 3,9 ^ ТЦД50/мл и 4,2 ^ ТЦД50/мл соответственно.
2. Линия клеток «М-22» сертифицирована в ГИСК им. Л.А. Тарасевича как субстрат, пригодный для получения живых противовирусных вакцин.
73
epid 3 (52).indd 73 Ф 7/1/10 3:24:57 PM
3. Имеется банк посевных клеток «М-22». Установлено, что:
• диплоидная линия «М-22» способна поддерживать стабильный уровень инфекционной активности вируса краснухи на протяжении не менее пятнадцати пассажей линии в фазе активного роста;
• клетки «М-22» поддерживают репродукцию вирусов кори (4,0 - 6,0 ^ ТЦД50/0,5 мл) и эпидемического паротита (4,0 - 5,0 ^ ТЦД50/0,5 мл), что создает возможность получения препарата тривакцины (корь-паротит-краснуха) на едином тканевом субстрате;
• клетки «М-22» устойчивы к криоконсервации, культивируются при использовании отечественных питательных сред и реагентов;
• характер репродукции восстановленного штамма «Орлов» в клетках «М-22» позволяет получить удвоенное количество полезных вирусных сборов с существенно меньшим содержанием остаточного белка в конечном продукте, чем при использовании первичной культуры клеток;
• генетическая стабильность штамма «Орлов» (определена по гену Е1) сохраняется на протяжении как минимум пяти пассажей вируса в культуре клеток «М-22»;
• культивируемый на диплоидной линии клеток «М-22» вариант штамма «Орлов» характеризуется стабильными показателями инфекционной активности на протяжении как минимум 15 лет хранения (срок наблюдения) при температуре минус 20 оС.
Устойчивость штамма «Орлов» к длительному хранению и наличие банка посевных клеток «М-22» - эти два фактора определяют возможность многолетнего производства краснушной вакцины в России в необходимых количествах.
Молекулярно-генетические исследования штамма «Орлов-В»
Генотипирование штамма «Орлов-В» и ряда изо-лятов вируса краснухи, выделенных на территории страны (в Пермском крае), проведено в соответствии с рекомендациями ВОЗ (2005 г.). Установлено следующее:
• вакцинный штамм вируса краснухи «Орлов-В» относится к генотипу 2С, эндемичному для России, и генетически более близок к циркулирующим на ее территории изолятам вируса краснухи, чем вакцинный штамм Wistar RА27/3: индекс генетической близости составляет 0,74 и 0,99 соответственно;
• вакцинопрофилактика краснухи вызывает филогенетические изменения возбудителя. Массовая туровая иммунизация вакциной Rudivax детей 1 - 2-го года жизни в г. Перми в течение четырех лет применения при пороге привито-сти, равном 460,0 на 1000 детского населения, привела к достоверному повышению показате-
ля генетической дивергенции с 1,15% в 2000 до 3,14% в 2004 году;
• различие между исследованными штаммами «Орлов-В» и Wistar RA27/3 - в высококонсервативном участке молекулы Е1, ответственном за поливалентность иммуногенной активности вируса. Полученные результаты свидетельствуют о возможном преимуществе применения штамма «Орлов-В» для профилактики краснухи в условиях популяционной изменчивости возбудителя.
Выводы
1. В доклиническом изучении на обезьянах макака-резус выявлено, что штамм «Орлов-В» не обладает остаточной нейровирулентностью, контагиозностью и по параметрам специфической безопасности соответствует требованиям, предъявляемым к штаммам для живых противовирусных вакцин.
2. Однократное введение серонегативным к краснухе обезьянам макака-резус препарата из штамма «Орлов-В» вызывает 100%-ную серокон-версию и формирование вирус-специфических антител в высоких титрах (в РТГА 1:160 -1:1280). Препарат из штамма «Орлов-В» обладает протективностью, защищая иммунизированных животных от заражения патогенным вирусом краснухи (штамм «Лебедев»), и характеризуется иммунологической безопасностью. По изученным параметрам восстановленный штамм «Орлов» не уступает препарату сравнения - вакцинному штамму вируса краснухи Wistar RA27/3.
3. Диплоидная линия клеток «М-22» - тканевой субстрат, пригодный для использования в производственных целях: не требует специальных условий культивирования; устойчива к криоконсервации; характеризуется стабильной чувствительностью к вирусу краснухи, а также к вирусам кори и эпидемического паротита.
4. Культивирование штамма «Орлов» на линии клеток «М-22» не сопровождается мутациями в гене Е1 на протяжении как минимум пяти пассажей вируса в клетках.
5. Лиофилизированный штамм «Орлов-В» характеризуется стабильной биологической активностью (3,5 - 3,8 ^ ТЦД50/0,5 мл) в условиях хранения при температуре - 20 оС на протяжении 15 лет наблюдения. Это обстоятельство, а также наличие банка посевных клеток «М-22» позволяют обеспечить многолетнюю потребность в вакцине против краснухи на территории РФ.
6. Проведенное молекулярно-генетическое исследование выявило возможное преимущество применения штамма «Орлов-В» для профилактики краснухи в нашей стране
7. В целом полученные результаты свидетельствуют о возможности создания живой аттенуированной вакцины против краснухи на основе
— 74
ер1с1 3 (52).тсИ 74 ф 7/1/10 3:24:58 РМ
штамма «Орлов-В» и диплоидной линии клеток «М-22» и о целесообразности ее применения на территории России.
Перспективы внедрения препарата:
1. Ориентировочная расчетная стоимость одной дозы вакцины - 27 рублей в ценах 2007 года. Применение отечественной вакцины против краснухи позволит снизить расходы только на проведение плановой иммунизации на 62 млн рублей ежегодно.
2. Получение моновакцины против краснухи даст
возможность приступить к получению трехкомпонентной вакцины: корь-паротит-краснуха.
Использование ассоциированной вакцины будет способствовать повышению охвата прививками всех декретированных контингентов, совершенствованию вакцинопрофилактики названных детских вирусных инфекций.
4. Время, необходимое для внедрения вакцинного штамма в производство вакцины, - три - пять лет.
Заключение
Характерной особенностью вируса краснухи является высокое антигенное родство различных штаммов, выделенных в разных регионах мира.
В целом можно говорить о наличии одного серо-типа вируса, что облегчает разработку вакцин для
профилактики краснухи. Пример тому - успешное использование в России зарубежных краснушных вакцин на основе штамма Wistar RA27/3.
В то же время опыт разработки и практического применения живых противовирусных вакцин дал примеры создания препаратов с существенными различиями в отношении основополагающих свойств - иммуногенности и безвредности, а также определил возможность использовать разные вакцинные штаммы, составляя из них композицию моно- и ассоциированных препаратов.
Так, в настоящее время для получения ассоциированной трехкомпонентной вакцины «корь-паротит-краснуха» используются восемь вакцинных штаммов вируса кори (Эдмонстон В, Шварц, Моратен, Эдмонстон-Загреб, Л-16, Шанхай-191, САМ-70, ТД-97) и четыре вакцинных штамма вируса эпидемического паротита (Джерил-Линн, Л-3, Урабе, Ленинград-Загреб). Этот факт предполагает возможность дальнейшей оптимизации, совершенствования вакцинных препаратов; получения препаратов для профилактики краснухи на основе штаммов, эндемичных для территории Российской Федерации. Наличие зарубежных вакцин для профилактики краснухи, на наш взгляд, не снимает актуальности такого рода разработок. ш
Иммунопрофилактика гепатита А в организованных коллективах военнослужащих
В.Г. Акимкин1, 4 (vgakimkin@yandex.ru), П.И. Огарков2, С.И. Коротченко1,
А.В. Алимов1, В.А. Шевцов3, А.В. Смирнов2, В.С. Токмаков2, Л.Ю. Калабухова3
1 Главное военно-медицинское управление Минобороны РФ, Москва
2 Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова, Санкт-Петербург
3 Главный центр государственного санитарно-эпидемиологического надзора Минобороны РФ, Москва
4 ФГУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, Москва (info@crie.ru)
Резюме
Показана высокая военно-эпидемиологическая значимость гепатита А для организованных коллективов военнослужащих. Выявлена выраженная взаимосвязь увеличения уровня заболеваемости военнослужащих гепатитом А с периодом участия Вооруженных Сил страны в активных боевых действиях. Установлена основная роль вакцинации в системе профилактики гепатита А среди военнослужащих. Показана высокая иммунологическая эффективность и приоритетность использования отечественной вакцины Геп-А-ин-Вак производства ЗАО «Вектор-БиАльгам» для плановой профилактики гепатита А среди военнослужащих.
Immunoprophylaxis of Hepatitis A in Organized Groups of Troops
V.G. Akimkin14 (vgakimkin@yandex.ru), P.I. Ogarkov2,
S.I. Korotchenko1 A.V. Alimov1, V.A. Shevtsov3, A.V. Smirnov2,
V.S. Tokmakov2, L.Y. Kalabuhova3
1 Main Military Medical Management Defense Ministry, Moscow
2 Military Medical Academy, St. Petersburg
3 Main Center of State Sanitary and Epidemiological Surveillance Ministry of Defense, Moscow
4 Central Research Institute of Epidemiology of Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human WellBeing, Moscow (info@crie.ru)
75
epid 3 (52).indd 75 7/1/10 3:24:58 PM
