CC BY
50
Информация от фармацевтической компании
А.Н. Миронов1, А.А. Цаан1, Д.С. Бушменков1, А.А. Романова1, В.А. Меркулов2, Н.Н. Степанов2
1 Федеральное государственное унитарное предприятие «Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препаратам «Микроген» МЗ РФ
2
Филиал ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России — ВЦ»
Результаты изучения нейровирулентных свойств культуральной живой вакцины против краснухи
Контактная информация:
Цаан Андрей Александрович, главный специалист отдела клинических исследований ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ Адрес: 115088, Москва, ул. 1-я Дубровская, д. 15, тел.: (495) 790-77-73, e-mail: a.a.tsaan@microgen.ru Статья поступила: 02.02.2010 г., принята к печати: 26.07.2010 г.
Специалистами ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ разработан новый отечественный препарат для профилактики краснухи — вакцина против краснухи культуральная живая, на основе вакцинного штамма RA 27/3. В рамках доклинических исследований изучены нейровирулентные свойства посевного вируса (П. В. 30 пассаж) и производственного штамма RA 27/3 вируса краснухи (П. Ш. — 30 пассаж) на серонегативных к вирусу краснухи яванских макаках. Исследование проведено на лабораторной базе филиала «48 ЦНИИ Минобороны России — ВЦ» в соответствии с требованиями 43 доклада Комитета экспертов ВОЗ по стандартизации биологических препаратов. В ходе проведения эксперимента изучены следующие показатели: нейровирулентность производственного штамма; нейровирулентность посевного вируса; иммуногенные свойства посевного вируса и производственного штамма; контагиозность посевного вируса и производственного штамма. Результаты, полученные в исследовании, свидетельствуют об отсутствии нейровирулентных свойств и контагиозности у посевного вируса и производственного штамма, а также о высоких иммуноген-ных свойствах разработанной вакцины.
Ключевые слова: вакцина против краснухи, посевной вирус, производственный штамм, нейровирулентность, контагиозность, иммуногенность.
125
ВВЕДЕНИЕ
Краснуха — острая вирусная болезнь, характеризующаяся мелкопятнистой экзантемой, генерализованной лимфаденопатией, умеренно выраженной лихорадкой и поражением плода у беременных. Вирус краснухи относится к тогавирусам (семейство Togaviridae, род Rubivirus).
Особую опасность краснуха представляет для беременных женщин вследствие внутриутробного инфицирования плода. Вирус краснухи выделяется во внешнюю среду за неделю до появления сыпи и в течение недели после высыпаний. Заражение происходит воздушно-капельным путем (у плода — трансплацентарно) [1, 2].
A.N. Mironov1, А.А. Tsaan1, D.S. Bushmenkov1, А.А. Romanova1, V.A. Merkulov2, N.N. Stepanov2
1 Federal State Unitary Enterprise R&D Centre for Medical Immunobiological Drugs Microgen of the RF Healthcare Ministry
2 Branch of Federal State Institution «48 Central Research Institute of Russia's Defense Ministry — Virologic Centre»
Study of neurovirulent properties of vaccine against cultural live rubella
Experts at FSUE R&D Centre Microgen of the RF’s Healthcare Ministry have developed a national drug designed to prevent rubella — Cultural live vaccine against rubella on the basis of vaccinal strain RA 27/3. A pre-clinical study was conducted to examine neurovirulent properties of the seed virus (S. V. 30 passage) and production strain RA 27/3 of rubella virus (P. S. — 30 passage) on rubella virus-antibody negative cynomolgus monkeys. The study was conducted at the laboratory of the Branch of Federal State Institution «48 Central Research Institute of Russia’s Defense Ministry — Virologic Centre» pursuant to requirements of 43 of the report issued by WHO Expert Committee on biological standardization. During the experiment, the following indicators were examined: neurovirulency of the production strain; neurovirulency of the seed virus; immunogenic properties of the seed virus and production strain; contagiousness of the seed virus and production strain. Results obtained in the study indicate that the seed virus and production strain have no neurovirulent properties and contagiousness, and that the developed vaccine has high immunogenic properties.
Key words: vaccine against rubella, seed virus, production strain, neurovirulency, contagiousness, immunogenicity.
■■■ 1_С
г
о
х
>8
О
X
О
Щ
т
со
V
3
и
г
а
(О
н
о
ОС
га
г
а
о
■©
Наибольшую социальную значимость представляет синдром врожденной краснухи (СВК), частота которого среди детей с врожденной патологией может достигать 15-35% [3, 4]. Показано, что СВК обусловливает 27-35% всей внутриутробной патологии [5].
Вирус краснухи обладает тропностью к эмбриональной ткани, значительно нарушает развитие плода. Частота поражений плода зависит от сроков беременности. Заболевание краснухой на 3-4-й неделе беременности обусловливает врожденные уродства в 60% случаев, на 9-12-й неделе — в 15% и на 13-16-й неделе — в 7% случаев. Детерминирование тех или иных дефектов развития, возникающих при краснухе на разных сроках беременности, зависит от периода развития эмбриона: мозга — на 3-11 неделях, органов зрения и сердца — на 4-7-й неделях, органа слуха — на 7-13 неделях, неба — на 10-12 неделях [6].
Неблагоприятное влияние краснушной инфекции на плод проявляется также спонтанными абортами (10-40%), мертворождением (20%), смертью в неонатальном периоде (10-25%). Частота мертворождений составляет около 10% при заболевании женщины в первом триместре, 5% — во втором и 2% — в третьем триместре. По нашим данным, врожденная краснуха является причиной смерти в 20% случаев от числа всех умерших от внутриутробных инфекций [7].
При заболевании беременных женщин краснухой вирус попадает в плаценту во время вирусемии, где размножается, а затем инфицирует плод. Инфекция вызывает нарушения митотической активности, хромосомные изменения, что приводит к отставанию в физическом и умственном развитии. При врожденной краснухе, несмотря на наличие в сыворотке крови антител к вирусу краснухи, возбудитель длительное время (до 31 мес) сохраняется в организме ребенка. Ребенок в течение всего этого времени может быть источником инфекции для других детей [1, 2, 8, 9].
В нашей стране краснуха всегда являлась социально значимой инфекцией из-за высокого уровня заболеваемости населения и ее повсеместного распространения. Вакцинация против краснухи в России была введена в Национальный календарь профилактических прививок лишь в 1997 г. [10]. Однако, по причине нехватки закупаемой за рубежом вакцины, охват прививками был недостаточным для формирования иммунной прослойки среди населения. В период с 1997 по 2000 гг. охват вакцинацией против краснухи детей в возрасте 24 месяцев составлял всего 12,7% [11].
В настоящее время Министерство здравоохранения и социального развития России в целях профилактики краснухи продолжает закупать импортные препараты.
По данным Роспотребнадзора, уровень заболеваемости краснухой за последнее время неуклонно снижается. В 2009 г. в Российской Федерации заболеваемость краснухой составила 1,14 на 100 тыс. населения, что ниже этого показателя за 2008 г. в 5,9 раза [12]. Снижение уровня заболеваемости краснухой было достигнуто благодаря усилению эпидемиологического надзора за этой инфекцией в стране и более широкому охвату профилактическими прививками групп населения, обозначенных в Национальном календаре профилактических прививок. Наиболее эффективным путем защиты от приобретенной и врожденной краснухи признается иммунизация населения живыми аттенуированными вакцинами против краснухи [13].
Ввиду отсутствия в Российской Федерации отечественного препарата для профилактики краснухи, специалистами
Московского подразделения по производству бактерийных препаратов ФГУП «НПО «Микроген» Минздравсоцраз-вития РФ была разработана вакцина против краснухи культуральная живая, на основе штамма RA — 27/3.
В целях предупреждения поствакцинальных осложнений была изучена безопасность разработанной вакцины на различных моделях экспериментальных животных.
Как известно, одно из наиболее часто встречающихся поствакцинальных осложнений — неврологический синдром, который проявляется почти в два раза чаще, чем аллергический [14].
Согласно требованиям 43-го доклада Комитета экспертов ВОЗ по стандартизации биологических препаратов, было проведено исследование по изучению нейровирулентности посевного вируса (П. В. 30 пассаж) и производственного штамма (ПШ-30). Кроме того, в рамках данного исследования оценили контагиозность и иммуногенные свойства препаратов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
При оценке нейровирулентных свойств вакцины были использованы следующие препараты:
• производственный штамм RA27/3 вируса краснухи (ПШ-30) № 2, биологическая активность — 4,87 1ёТЦД50 • (0,5 мл)-1;
• посевной вирус краснухи, штамм RA27/3 (П. В. 30 пассаж), биологическая активность — 4,7 £ ТЦД50 • (0,5 мл)-1.
Исследование проводили на 24 приматах — яванских макаках (Macacus fasciculans) средним весом 2,5 кг. Животные были доставлены из Института медицинской приматологии РАМН (село Веселое Адлерского района города Сочи), где проводили медицинское обследование каждого животного. Перед включением в исследование приматы находились в режиме карантина 30 суток, в течение всего времени проводилось ежедневное наблюдение за состоянием и поведением животных. До введения исследуемых препаратов у животных забирали кровь из паховой вены для выявления серонегативных к вирусу краснухи особей. Взятие проб крови проводили под наркозом.
Экспериментальные животные были распределены на две группы — по 10 животных в каждой. Яванским макакам I группы вводили производственный штамм вируса краснухи, II группе был введен посевной вирус. Препараты вводили под наркозом интрацеребрально в область зрительных бугров. Двух обезьян иммунизировали путем подкожного введения препаратов. Двух приматов использовали для изучения контагиозных свойств производственного штамма и посевного вируса вакцины против краснухи. Эти животные были помещены под одну вытяжку с привитыми приматами.
Клинический осмотр каждого животного проводили до начала введения препаратов и ежедневно в течение всего периода наблюдения. Всех животных взвешивали до начала исследования и в последний день наблюдения. Период наблюдения за приматами, привитыми интрацеребрально, составил 21 сутки. Далее проводили патоморфологические и гистологические исследования головного мозга и внутренних органов. За животными, которым препараты вводили подкожно, наблюдали в течение 28 суток. В период наблюдения контролировали любые отклонения в соматическом и неврологическом статусе обезьян. В целях изучения динамики нарастания величины титра антител к вирусу краснухи, у животных забирали кровь на 7, 14, 21, 28-е сутки после подкожной иммунизации. Для приматов, используемых при опреде-
126
Рис. 1. Сохраненные нейроны таламуса
.. . ■ Г,. ** • *• ’ »* * •■ , 1
А • : ’
„ д * .
\ ’ • 4
-:/:Л '' ■ •. £ :.
. .. *'/ ,* , • * *• її ’(•, ‘ - , А
Ч; ’**
•- .
Рис. 2. Нейроны инъекционной зоны
Рис. 3. Неповрежденное сосудистое сплетение желудочков мозга
лении контагиозности препаратов, период наблюдения составил 50 суток, после чего производили забор крови для серологического исследования.
Основные правила содержания и ухода за экспериментальными животными соответствовали «Санитарным правилам по содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)», утвержденным МЗ СССР 06.07.1973 г. и Приказу МЗ СССР № 755 от 12.08.1977. Серологические исследования проводились с использованием иммуноферментной тест-системы «ВектоРубелла-^-стрип» для выявления иммуноглобулинов класса G к вирусу краснухи.
Результаты, полученные в исследовании, подвергали статистической обработке, используя Г-критерий Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В результате проведенных исследований установлено, что в течение всего периода наблюдения за животными, иммунизированными посевным вирусом и производственным штаммом вакцины против краснухи, каких-либо отклонений в соматическом и неврологическом статусе не обнаружено.
Отмечена положительная динамика увеличения массы тела животных, температура тела приматов в течение срока наблюдения оставалась в пределах нормы.
В результате патоморфологических и гистологических исследований головного мозга обезьян после интраце-ребрального введения препаратов каких-либо патологических явлений не обнаружено (рис. 1-3).
ФГУП "НПО "МИКРОГЕН"
ЛИДЕР ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ
Разработчик и производитель высокоэффективных вакцин, в том числе входящих в Национальный календарь профилактических прививок
гриппозные (живая, инактивированная и субъединичная), паротитная, коревая, паротитно-коревая, БЦЖ, БЦЖ-М, АКДС, АКДС-Геп В, краснушная, антирабическая, бруцеллезная, сыпнотифозная, гонококковая, против гепатита В, клещевого энцефалита (ЭнцеВир®), АДС, АДС-М, АД и АС анатоксины
Современная научно-исследовательская база и производственные мощности
13 филиалов
3 академика, 13 профессоров, 26 докторов наук и 166 кандидатов наук более 15 оригинальных препаратов в стадии выхода на рынок
Единственный в России разработчик и производитель вакцин против гриппа птиц
Лидер рынка по объему производства среди российских фармацевтических компаний
Производитель более 400 наименований иммунобиологических препаратов и готовых лекарственных средств
Вакцины и анатоксины Сыворотки
Пробиотики и бактериофаги Препараты крови, иммуноглобулины Питательные среды Аллергены и аллергоиды Тест-системы и диагностикумы Готовые лекарственные средства
ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ г. Москва, 115114,ул. Летниковская д.10 стр.4.
тел.: (495)790-77-73 факс: (495)783-88-04 www.microgen.ru
Лицензия № 99-04-000097
■■■ Œ
Таблица. Характеристика иммунного ответа при подкожном введении препаратов
Время от момента введения препарата, сутки Титр антител в ТФ ИФА, при Х х/. 2 Величина концентрации IgG к вирусу краснухи, МЕ/мл
ПШ-30 П.В. 30 пассаж
7 1:80 x/: 2 1:80 x/: 2 16,45
16,53
14 1:160 x/: 2 1:160 x/: 2 22,93
21,13
21 1:320 x/: 2 1:320 x/: 2 24,25
24,68
28 1:640 x/: 2 1:640 x/: 2 32,21
33,68
s
о
*
>5
О
*
и
ф
У
са
о
з
я
г
а
ш
О
н
о
ОС
л
г
а
о
О
Анализ динамики образования антител в крови обезьян, представленный в таблице, свидетельствует о том, что в течение 28 суток отмечалась положительная динамика величины титра антител к вирусу краснухи. На 28-е сутки после вакцинации титр антител к вирусу краснухи в сыворотке крови обезьян составил 1:640, что свидетельствует о высокой потенциальной иммуногенности новой отечественной вакцины против краснухи.
При изучении сывороток крови обезьян из контрольной группы антител к вирусу краснухи не обнаружено. Результаты, полученные при изучении нейровирулентных свойств посевного вируса и производственного штамма, свидетельствуют об отсутствии негативного влияния изучаемых препаратов на центральную и переферическую нервную систему животных, то есть они не проявляют нейровирулентных свойств.
Патоморфологические и гистологические исследования внутренних органов животных выявили незначительные лимфогистиоцитарные инфильтраты в местах введения препаратов. Результаты гистологического изучения головного и спинного мозга обезьян свидетельствуют об отсутствии патологического влияния вакцины на ткани
нервной системы. Нейроны головного мозга приматов изменений не претерпели.
Расширение зон размножения лимфатических фолликулов в селезенке и лимфатических узлах, обнаруженное в ходе гистологического исследования, свидетельствует об активации иммунных процессов, что подтверждает наличие выраженных иммуногенных свойств препарата.
Отсутствие антител к вирусу краснухи в образцах крови, взятой у приматов контрольной группы на 50 сутки после введения препаратов, доказывает отсутствие контагиоз-ности у посевного вируса и производственного штамма вакцины против краснухи. Кроме того, изучение сывороток обезьян, привитых подкожно, показало высокие иммуногенные свойства препаратов.
Таким образом, показано, что посевной вирус и производственный штамм новой отечественной вакцины против краснухи безопасен для экспериментальных животных и обладает выраженной иммуногенностью, что доказывает перспективность использования данных препаратов в производстве новой отечественной вакцины против краснухи.
128
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ющук Н. Д., Венгеров Ю. Я. Лекции по инфекционным болезням. Т. 1. — М., ВУНМЦ, 1999.
2. Медицинская вирусология. Часть 2-я / под ред. А. М. Коро-люка, В. Б. Сбойчакова. — СПб.: ЭЛБИ-СПб, 2002. — 164 с.
3. Семериков В. В., Попов В. Ф., Седельникова Т. А. и др. Краснуха в России: выявление врожденной краснухи, стратегия и тактика вакцинации // Микробиология. — 1998; 1: 46-49.
4. Ясинский А. А., Михеева И. В., Лыткина И. Н. и др. Проблемы профилактики краснухи в России // Детские инфекции. — 2004; 2: 11-13.
5. Нисевич Л. Л., Бахмут Е. В., Талалаев А. Г. и др. Врожденная краснуха и ее роль в развитии внутриутробной патологии. Краснуха. Синдром врожденной краснухи. Инф. сборник. — М.-СПб., 1997: 31-39.
6. MacCallum F. O. // Proc. Roy. Soc. Med. — 1972; 65 (7): 585-587.
7. Учайкин В. Ф. Почему надо прививать против краснухи // Инф. бюллетень «Вакцинация». — 1999; 1: 4.
8. Руководство по инфекционным болезням / под ред. Ю. В. Лобзина. — С-Пб.: Фолиант, 2000. — 932 с.
9. Лаврентьева И. Н., Семериков В. В., Жебрун А. Б. и др. Краснуха в России: Изменчивость возбудителя в период вакци-нопрофилактики инфекции // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2008; 3: 26-31.
10. Селезнева Т. С., Зраргарьянц А. И., Яковлева И. В. и др. // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. — 2009; 5: 9-19.
11. Данные заболеваемости Роспотребнадзора. URL: http: // www.rospotrebnadzor.ru/
12. Horstmann D. M. Rubella: the challenge of its control // Rev. Infect. Dis. — 1971; 123: 640-654.
13. Медуницын Н. В. Вакцинология. — М., 1998.
14. URL: http: // www.who.ru
