CC BY
44
ВАКиИНОПРОФИААКТИКА
Доклиническое исследование Вакцины против краснухи культуральной живой, производства ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ
А. Н. Миронов, А. А. Цаан, Д. С. Бушменков, А. А. Романова, В. А. Меркулов, Н. Н. Степанов, Е. С. Сидоренко, Л. Л. Суханова, О. К. Шаров
ФГУП Научно-производственное объединение
по медицинским иммунобиологическим препаратам «Микроген» Министерства здравоохранения РФ
Специалистами ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ разработан новый отечественный препарат для профилактики краснухи — Вакцина против краснухи культуральная живая, на основе вакцинного штамма RA 27/3.
В результате исследований показано, что после введения препарата гибели экспериментальных животных не наблюдали, отмечена положительная динамика массы тела животных, отсутствие дистрофических и некробиотических изменений во внутренних органах, отсутствие негативного влияния на гематологические и биохимические показатели крови. Установлено, что изучаемая вакцина не оказывает токсического, аллергизирующего, местного и местно-раздражающего действия, не проявляет нейрови-рулентных, иммунотоксических свойств, неконтагиозна и вызывает у иммунизированных животных индуцирование гуморального ответа.
Ключевые слова: краснуха, вакцина, доклинические исследования УДК 616.916.1
Контактная информация: Цаан Андрей Александрович — главный специалист отдела клинических исследований ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ; 115088, Москва, ул.1-ая Дубровская, 15; (495) 790-77-73, доб. 22-16
PrecunicaL Testing of Rubeua Vaccine CuLture Live Manufactured
by Federal State Unitary Enterprise «Scientific-Production Association «Microgen»
of Ministry of PubLic HeaLth of Russian Federation
A. N. Mironov, A. A. Tsaan, D. S. Bushmenkov, A. A. Romanova, V. A. Merkulov, N. N. Stepanov, E. S. Sidorenko, L. L. Sukhanova, O. K. Sharov
Federal State Unitary Enterprise of Medical Immunobiological Preparations «Scientific-Production Association «Microgen» of Ministry of Public Health of Russian Federation
Specialists of «Scientific-Production Association «Microgen» developed a new domestic preparation for rubella prophylaxis — rubella vaccine culture live, based on vaccine strain RA 27/3.
Testing of the vaccine proved that no death of experimental animals was observed after injection of the preparation. Positive dynamics of body mass was registered. Dystrophic and necrobiotic changes of internals were not present. Negative effects on hematological and biochemical measurements of blood were absent. It was determined that the tested vaccine does not have any toxic, allergenic, local or rubefacient actions. It does not reveal neurovirulent, immunotoxic features. It is not contagious and it induces antibody response in immunized animals. Key words: rubella, vaccine, preclinical testing
Краснуха — острая инфекционная болезнь, вызываемая РНК-вирусом рода ^Ь'тгив, характеризуется лихорадкой, розовой мелкопятнистой сыпью, катаральными явлениями, затылочным лимфаденитом. Выраженные терратогенные свойства вируса краснухи, способные формировать врожденные дефекты развития и повсеместное распространение инфекции определяют актуальность проводимых противоэпидемических мероприятий в отношении этой инфекции [1]. До недавнего времени уровень заболеваемости этой инфекцией вызывал беспокойство органов здравоохранения не только в России, но и в странах европейского региона. До разработки вакцин для предупреждения СВК (синдром врожденной краснухи) широко применялись гипериммунные или нормальные иммуноглобулины, которые содержат специфические антитела [2]. В настоящее время специфические иммуноглобулины вводят беременным женщинам, которые не желают прерывать беременность после подтверждения инфицирования краснухой. Основным средством предупреждения заболевания краснухой и СВК служит вакцина [2]. На сегодняшний день в мировой практике
здравоохранения (кроме Китая и Японии) для профилактики краснухи используют вакцины, приготовленные на основе штамма RA 27/3 [3].
В нашей стране краснуха всегда являлась социально значимой инфекцией из-за высокого уровня заболеваемости населения и повсеместного распространения этой инфекции. Вакцинация против краснухи в России была введена в Национальный календарь профилактических прививок лишь в 1997 г. [1]. Однако по причине нехватки закупаемой за рубежом вакцины, охват прививками был недостаточным для формирования иммунной прослойки среди населения. Так, за период с 1997—2000 гг. охват вакцинацией против краснухи детей в возрасте 24 месяцев составлял всего 12,7% [4].
В последнее время, по данным Роспотребнадзора, уровень заболеваемости краснухой неуклонно снижается. В 2009 г. заболеваемость краснухой составила 1,14 на 100 тыс. населения, что ниже этого показателя за 2008 г. в 5,9 раза [5]. Снижение уровня заболеваемости краснухой населения России было достигнуто благодаря усилению эпидемиологического надзора за этой инфек-
■ а. Н. Миронов и ДР. ДОКЛИНИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ КРАСНУХИ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИВОЙ, ПРОИЗВОДСТВА ФГУП «НПО «МИКРОТЕН»
цией в стране и более широкому охвату прививками групп населения, обозначенных в Национальном календаре профилактических прививок. Наибольшую социальную опасность представляет синдром врожденной краснухи, частота которого среди детей с врожденной патологией может достигать 15—35% [6, 7]. Показано, что СВК обусловливает 27—35% всей внутриутробной патологии [8]. Трудность ранней диагностики краснухи среди беременных обусловлена тем, что в 75—80% случаев заболевание протекает в бессимптомной форме [9].
Стратегический план Европейского регионального бюро ВОЗ на 2005—2010 гг. определяет борьбу с врожденной краснухой (ВК) в числе приоритетов и предусматривает элиминацию эндемичной краснухи и снижение заболеваемости ВК в странах региона до уровня менее 1 случая на 100 тыс. живых новорожденных [10].
Учитывая широкую распространенность краснухи, и, во многих случаях, невозможность предупреждения возникновения заболевания с помощью карантинных мер, многие страны проводят массовую вакцинацию против этой инфекции. Наиболее эффективным путем защиты от приобретенной и врожденной краснухи признается иммунизация населения живыми аттенуированными вакцинами [11].
Ввиду отсутствия в Российской Федерации отечественного препарата для профилактики краснухи, специалистами Московского подразделения по производству бактерийных препаратов ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ была разработана Вакцина против краснухи культураль-ная живая, на основе штамма RA — 27/3.
На экспериментальных моделях животных была изучена безопасность и эффективность разработанной вакцины.
Материалы и методы исследования
Вакцина против краснухи культуральная живая приготовлена на основе штамма RA — 27/3. Вакцинный штамм RA — 27/3 был представлен ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ по лицензионному соглашению Институтом анатомии и биологии WISTAR (США).
В одной дозе вакцины (0,5 мл) содержится аттенуиро-ванный вакцинный штамм RA — 27/3 вируса краснухи, культивированный на диплоидных клетках человека MRC—5, активностью не менее 1000 ТЦД50.
Доклиническое исследование вакцины было проведено на трех лабораторных базах: ФГУЗ «Волгоград НИПЧИ» Роспотребнадзора; Филиал ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России — ВЦ», ФГУН «Институт токсикологии» ФМБА России.
В рамках проведенного исследования определяли следующие показатели:
— токсичность (острая, хроническая);
— местное и местно-раздражающее действие;
— аллергизирующее действие;
— нейровирулентность посевного вируса (ПВ) и производственного штамма (ПШ);
— иммунногенность;
— контагиозность;
— иммунотоксичность.
При определении токсичности и нейровирулентности проводили паталогоанатомическое и гистологическое изучение внутренних органов животных. Изучение токсических свойств вакцины проведено в сравнительном исследовании. Препаратом сравнения служила вакцина против краснухи, производства SERUM INSTITUTE OF INDIA LTD.
Доклинические исследования Вакцины против краснухи проведены в соответствии с требованиями Федерального закона «О лекарственных средствах» от 22.06.1998 г. № 86-ФЗ и Правилами лабораторной практики в Российской Федерации (Приказ Минздрава РФ от 19.06.2003 № 267). Исследования проводили на основании заключений комиссий по биоэтике в соответствие с протоколами доклинических исследований.
В качестве экспериментальных моделей животных использовали беспородных белых мышей, мышей линии Balb, массой 1 8—22 г, морских свинок массой 260—300 г, кроликов породы Шиншилла массой 2—2,5 кг, яванских макак массой 2—2,5 кг.
Результаты и их обсуждение
В результате проведенных исследований признаков, указывающих на токсичность разработанной Вакцины против краснухи, не обнаружено. За время наблюдения за белыми мышами и морскими свинками при определении токсичности препарата отмечали положительную динамику массы тела животных. При клиническом осмотре белых мышей и морских свинок патологических явлений не выявлено ни в одной из групп животных.
Анализ гематологических и биохимических показателей крови животных, привитых изучаемой вакциной, показал отсутствие достоверного отличия от этих показателей у животных группы сравнения и контрольной группы. Во всех группах экспериментальных животных наблюдали незначительные колебания анализируемых значений крови, какой-либо определенной тенденции изменения показателей крови за наблюдаемый период выявлено не было.
Результаты изучения гиперчувствительности немедленного типа свидетельствуют об отсутствие у изучаемой вакцины способности индуцировать аллергическую реакцию немедленного типа (табл. 1).
Анализ результатов измерений массы тела конечностей животных, используемых для определения гиперчувствительности замедленного типа не выявил значительного прироста массы опытных лапок по отношению к контрольным (индекс реакции составил не более 1,2), что доказывает отсутствие у изучаемого препарата способности индуцировать реакцию гиперчувствительности замедленного типа.
При определении местного действия отмечали воспалительную реакцию в месте введения у одной морской свинки опытной группы, и у двух морских свинок, которым вводили препарат сравнения. Неспецифическая
■ а. Н. Миронов и др. Доклиническое ИССЛЕДОВАНИЕ Вакцины против КРАСНУХИ культ/рольной живой, ПРОИЗВОДСТВА ФГУП «НПО «МИКРОТЕН»
А — редкое почесывание лапами морды, взъерошенность шерсти, понижение температуры более, чем на 1 °С. Б — частое почесывание лапами морды, возможно периодическое чихание, понижение температуры. В — спастический кашлевой синдром, возможное падение на бок, мочеиспускание, дефекация. Г — конвульсивные судороги, резкое нарушение дыхания, гибель животного в течение первых 5—7 мин. Д — реакция отсутствует
Таблица 1. Изучение гиперчувствительности немедленного типа
Группы животных Препарат Сенсибилизирующая доза Разрешающая доза в/ в Тип реакции*
1. Опытная группа Вакцина против краснухи (Россия) 1доза х 3 раза 3 дозы Д
2. Группа сравнения Вакцина против краснухи (Индия) 1доза х 3 раза 3 дозы Д
3. Опытная группа — контроль Вакцина против краснухи (Россия) — вода для инъекций 1доза х 3 раза 0,5 мл вода для инъекций Д
4. Группа сравнения — контроль Вакцина против краснухи (Индия) — вода для инъекций 1доза х 3 раза 0,5 мл вода для инъекций Д
5. Отрицательный контроль Вода для инъекций 0,5 мл х 3 раза 0,5 мл вода для инъекций Д
6. Положительный контроль Сыворотка крупного рогатого скота 0,5 мл х 3 раза 0,5 мл сыворотка крупного рогатого скота Г
местная реакция наблюдалась в течение первых суток и исчезала на вторые сутки после введения препаратов.
Местно-раздражающего действия у вакцины не отмечено.
Патологоанатомические и гистологические исследования выявили незначительные лимфогистиоцитарные инфильтраты во внутренних органах животных как опытных групп, так и групп сравнения, что может быть объяснено высокими дозами введенных вакцин для данных видов животных (белые мыши, морские свинки).
Нейровирулентные, иммуногенные свойства и конта-гиозность изучили на приматах — яванских макаках. За время наблюдения за приматами, каких-либо патологических отклонений в соматическом и неврологическом статусах не отмечено. На 28 сутки после иммунизации величина титра антител к вирусу краснухи составила 1 : 640
(ИФА), что доказывает высокие иммуногенные свойства изученной вакцины.
При определении контагиозности вакцины у приматов, помещенных под одну вытяжку с привитыми обезьянами, антитела к вирусу краснухи не обнаружены, что свидетельствует об отсутствие контагиозных свойств у изученной вакцины.
Проведенные патоморфологические и гистологические исследования головного мозга и внутренних органов обезьян, признаков нейровирулентности производственного штамма и посевного вируса не выявили (рис. 1—3).
Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют об отсутствии нейровирулентных свойств производственного штамма и посевного вируса, приготовленных для производства Вакцины против краснухи куль-
Таблица 2. Количество антителобразующих клеток (АОК) в селезенке мышей после иммунизации вакциной против краснухи
Группа Число АОК на 106 ядросодержащих клеток селезенки Р < Число АОК на весь орган Р <
Физиологический раствор 7,9 (10,2 ± 6,2) 1000 (1230 ± 813)
Вакцина 15,8 (18,2 ± 13,8) 0,05 3162 (3548 ± 2818) 0,01
Таблица 3. Показатели фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов мышей
Экспериментальные группы Пол Количество измерений Оптическая плотность 1-критерий Стьюдента Вероятность (р)
Контроль М 12 0,575 ± 0,014 — —
Р 12 0,606 ± 0,012 — —
Вакцина М 12 0,584 ± 0,011 0,54 > 0,05
Р 12 0,581 ± 0,011 1,53 > 0,05
■ а. Н. МИРОНОВ И ДР. ДОКЛИНИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ КРАСНУХИ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИВОЙ, ПРОИЗВОДСТВА ФГУП «НПО «МИКРОТЕН»
туральной живой, а также о высокой иммуногенности и отсутствии контагиозности исследуемых препаратов.
Отдельным блоком доклинических исследований провели ряд тестов на определение иммунотоксичности новой отечественной вакцины против краснухи.
Результаты определения количества анителобразую-щих клеток (АОК) в селезенке мышей (в рамках изучения гуморального иммунитета) представлены в таблице 2.
Количество АОК в селезенке животных опытной группы в 3 раза превышает этот показатель у животных контрольной группы, что указывает на стимуляцию вакциной развития гуморального иммунного ответа.
При определении влияния вакцины на клеточный иммунитет было показано, что введение изучаемого препарата не вызывает реакции гиперчувствительности замедленного типа, что свидетельствует об отсутствии влияния вакцины на различные звенья клеточного иммунитета.
Фагоцитарная активность фагоцитов у животных опытной группы достоверно не отличалась от этого показателя у животных контрольной группы, что говорит об отсутствии негативного влияния вакцины на фагоцитарную активность фагоцитов (табл. 3).
В результате проведенных доклинических исследований Вакцины против краснухи культуральной живой, производства ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ, показана безопасность и высокие иммуногенные свойства нового отечественного препарата для профилактики краснухи.
Результаты доклинических исследований позволили рекомендовать следующий этап изучения отечественной вакцины для профилактики краснухи — клинические исследования.
Заключение
Новая отечественная вакцина для профилактики краснухи разработана на основе штамма RA — 27/3 на Московском подразделении по производству иммунобиологических препаратов ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ. Проведенные доклинические исследования разработанной вакцины показали отсутствие токсичности препарата как в остром, так и в хроническом опыте. Ал-лергизирующих свойств, местного и местно-раздражаю-щего действия у вакцины не выявлено. Исследования, проведенные на макаках, показали отсутствие нейрови-рулентных свойств и контагиозности у новой отечественной вакцины против краснухи, а также ее высокие имму-ногенные свойства. В тестах на белых мышах линии Ва1Ь доказано отсутствие негативного влияния вакцины на иммунную систему животных.
Таким образом, показано, что Вакцина против краснухи культуральная живая, производства ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ, безопасна и обладает выраженными иммуногенными свойствами, что позволяет рекомендовать проведение клинических исследований.
Литература:
1. Краснуха в России: Изменчивость возбудителя в период вакци-
нопрофилактики инфекции / И. Н. Лаврентьева и др. // Журн.
Рисунок 1. Сохраненные нейроны таламуса
ШШ » 1 ■ • ""ДЛИ^Н
Fi,: ' -JRk
I": ■* ' '^'М'И
IB1Щ Ww йшши
Рисунок 2. Нейроны инъекционной зоны
Рисунок 3. Неповрежденный хориоплексус желудочков мозга
Микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. — 2008. — № 3. — С. 26—31.
2. Бектимиров Т. А. // Биопрепараты. — 2005 — №1. — С. 21 —23.
3. Plotkin S. A., Farkuhar J. D., Katz M., Bauer F. // Am. J. Dis. Child — 1969. — V. 118. — P. 409— 439.
4. Селезнева Т. С., Зраргарьянц А. И., Яковлева И. В., Белевс-кая А. А. // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. —2009. — № 5. — С. 9—19.
5. Данные заболеваемости Роспотребнадзора. http://www.ros-potrebnadzor.ru
6. Краснуха в России: выявление врожденной краснухи, стратегия и тактика вакцинации / В. В. Семериков и др. // Микробиология. — 1998. — № 1. — С. 46—49.
7. Проблемы профилактики краснухи в России / А. А. Ясинский, И. В. Михеева, И. Н. Лыткина, Г. А. Жукова // Детские инфекции. — 2004. — № 2. — С. 11—13.
8. Врожденная краснуха и ее роль в развитии внутриутробной патологии. Краснуха. Синдром врожденной краснухи: Инф.сбор-ник / Л. Л. Нисевич и др. — М. — СПб., 1997.— С. 31—39.
9. Нисевич Л. Л. Современные проблемы диагностики и профилактики врожденной краснухи // Детский доктор. — 2000. — № 5. — С. 26—30.
1 0. Стратегический план Европейского региона ВОЗ 2005—2010 гг.
1 1. Horstmann D. M. Rubella: thechallenge of its control // Rev. Infect. Dis. — 1971. — V. 123. — Р. 640—654.
