CC BY
81
Кириллова Наталья Владимировна - аспирант, ФГБУН Институт молекулярной генетики РАН; e-mail:onix1986@yandex.ru
ЛИТЕРАТУРА
1. Демкин В. В. // Молекул. генетика. - 2010. - № 3. - С. 40-41.
2. CorsaroD., ValassinaM., VendittiD. // Crit. Rev. Microbiol. - 2003. - Vol. 29. - P. 37-78.
3. Demkin V. V., Zimin A. L. // Arch. Microbiol. - 2005. - Vol. 183, N 3. - P. 169-175.
4. Everett K., Bush R., Andersen A. // Int. J. Syst. Bacteriol. - 1999. -Vol. 49. - P. 415-440.
5. Hartley J. C., Kaye S., Stevenson S. et al. // J. Clin. Microbiol. -2001. - Vol. 39. - P. 3072-3079.
6. Herrmann B., Peterson B., Everett K. D. et al. // J. Syst. Evol. Microbiol. - 2000. - Vol. 50, N 1. - P. 149-158.
7. HornM. // Ann. Rev. Microbiol. - 2008. - Vol. 62. - P. 113-131.
8. Laroucau K., Souriau A., Rodolakis A. // Vet. Microbiol. - 2001. -Vol. 82, N 2. - P. 155-164.
9. Pedersen L. N., Herrmann B., Moller J. K. // FEMS Immunol. Med. Microbiol. - 2009. - Vol. 55. - P. 120-130.
Поступила 27.03.12
SPECIFIC MOTIFS IN THE GENOMES OF THE FAMILY CHLAMYDIACEAE
V. V. Demkin and N. V. Kirillova
Institute of Molecular Genetics, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia
Specific motifs in the genomes of the family Chlamydiaceae were discussed. The search for genetic markers of bacteria identification and typing is an urgent problem. The progress in sequencing technology resulted in compilation of the database of genomic nucleotide sequences of bacteria. This raised the problem of the search and selection of genetic targets for identification and typing in bacterial genes based on comparative analysis of complete genomic sequences. The goal of this work was to implement comparative genetic analysis of different species of the family Chlamydiaceae. This analysis was focused to detection of specific motifs capable of serving as genetic marker of this family. The consensus domains were detected using the Visual Basic for Application software for MS Excel. Complete coincidence of segments 25 nucleotide long was used as the test for consensus domain selection. One complete genomic sequence for each of 8 bacterial species was taken for the experiment. The experimental sample did not contain complete sequence of C. suis, because at the moment of this research this species was absence in the database GenBank. Comparative assay of the sequences of the C. trachomatis and other representatives of the family Chlamydiaceae revealed 41 common motifs for 8 Chlamydiaceae species tested in this work. The maximal number of consensus motifs was observed in genes of ribosomal RNA and t-RNA. In addition to genes of r-RNA and t-RNA consensus motifs were observed in 5 genes and 6 intergene segments. The gene CTL0299, CTL0800, dagA, and hctA consensus motifs detected in this work can be regarded as identification domains of the family Chlamydiaceae.
Keywords: chlamydia, Chlamydiaceae, conservative sequences, consensus motifs, comparative genomic
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 578.833.41:578.5].083.3:615:371
Г. В. Дмитриев, Т. К. Борисова, Е. Б. Файзулоев, Ю. И. Забияка, Р. Г. Десятскова, В. В. Зверев
изучение молекулярных механизмов аттенуации вируса краснухи на примере отечественного штамма 077
Лаборатория экспериментальной иммунологии отдела вирусологии им. О. Г. Анджапаридзе НИИВС им. И. И. Мечникова
РАМН, Москва
Для иммунизации населения против краснухи используют живую аттенуированную вакцину. Для большинства вакцинных штаммов вируса краснухи характерно наличие термочувствительного фенотипа. Приобретение термочувствительного фенотипа во время холодовой адаптации всегда сопровождается аттенуацией дикого вируса. Тем не менее молекулярные механизмы аттенуации вируса краснухи изучены не полностью. Поэтому по-прежнему актуальны изучение механизмов ослабления диких вариантов вируса, поиск ключевых мутаций, ведущих к аттенуации, а также выявление характерных фенотипических проявлений, которые могут служить маркерами аттенуации и использоваться наряду с секвенированием для контроля генетической стабильности вакцинных штаммов. В данном исследовании проведено полное секвенирование генома дикого и холодоадаптированного (са) вариантов штамма С-77 вируса краснухи, выделенного в России, и выявлены вероятные генетические детерминанты аттенуации. В результате сравнения геномов вариантов и са штамма С-77 обнаружено 13 нуклеотидных отличий, 6 из которых приводили к заменам аминокислот. 4 отличия из 6, ведущих к таким заменам, практически не встречаются у диких штаммов вируса краснухи. Особого внимания заслуживает замена Туг на Cys в позиции 1042 в протеазном домене штамма С-77, по всей вероятности, играющая ключевую роль в приобретении холодоадаптированного фенотипа штамма С-77.
Ключевые слова: вирус краснухи, аттенуированные штаммы, детерминанты аттенуации, температурная чувствительность
Краснуха - острое вирусное заболевание, характеризующееся пятнисто-папулезными высыпаниями на коже, слабовыраженными катаральными явлениями со стороны дыхательных путей и увеличенными пе-
риферическими лимфатическими узлами, особенно затылочными. Заболевание широко распространено как у детей, так и у взрослых. Актуальность и социальная значимость этой проблемы определяются серьезными тератогенными последствиями краснухи у женщин во время I триместра беременности. По данным разных авторов, риск развития врожденных пороков органов зрения, слуха, сердечно-сосудистой системы и др. составляет 10% от общего количества врожденных аномалий [2].
Заболевание у взрослых людей характеризуется более тяжелым течением, чем у детей, и нередко протекает с длительной лихорадкой, суставным синдромом, а также развитием органной патологии. Среди возможных осложнений встречаются краснушные энцефалиты, серозный менингит, полиневриты, тром-боцитопении и др.
Несмотря на все более широкое применение вакцины против краснухи, среди женщин детородного возраста сохраняется значительная неиммунная прослойка, что и создает угрозу развития синдрома врожденной краснухи.
Вакцинация является наиболее экономичным и доступным средством борьбы с краснухой. В настоящее время в Российской Федерации для иммунизации населения против краснухи используют вакцину зарубежного производства, созданную на основе штамма
Wistar RA27/3 и впервые зарегистрированную в Европе в 1971 г. [10]. Однако для проведения широкомасштабной вакцинации в России требуется создание вакцины, основанной на отечественном вакцинном штамме. В процессе создания вакцинных препаратов из-за возможности реверсии к дикому типу, гиператтенуации, а также возникновения осложнений, связанных с вакцинацией, появляется необходимость контроля генетической стабильности вакцинных штаммов. Так, согласно рекомендациям ВОЗ, в особенности для живых аттену-ированных вакцин следует проводить контроль генетической стабильности, поиск генетических маркеров аттенуации и подтверждение их наличия в вакцинных штаммах [13, 15]. С этой целью могут использоваться молекулярно-генетические методы. Например, для контроля нейровирулентности и генетической стабильности полиовирусной вакцины типа 3 используют MAPREC-тест [5]. Контроль генетической стабильности также предусмотрен для вакцинного штамма холерного вибриона и вируса денге [1, 14].
Механизмы аттенуации вируса краснухи изучены не полностью, поэтому по-прежнему актуальны изучение механизмов ослабления диких вариантов вируса, поиск ключевых мутаций, ведущих к аттенуации, а также выявление характерных фенотипических проявлений, которые могут служить маркерами аттенуации и использоваться наряду с секвенированием для контроля генетической стабильности вакцинных штаммов. Целью настоящей работы было выявление вероятных генетических детерминант аттенуации вируса краснухи.
Материалы и методы
Культура клеток почки африканской зеленой мартышки (Vero) была получена из Российской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург).
Перевиваемую линию клеток Vero культивировали в питательной среде МЕМ "Gibco" (США) в присутствии 10% эмбриональной телячьей сыворотки "Ну Clone" (США), 1 мМ глюта-мина "Gibco" (США) и 100 мкг/мл гентамицина "Gibco" (США) во флаконах 650 мл "Greiner Bio-one» (Германия) при 37°С и 5% ТО2.
Вирусный материал. Отечественный штамм вируса краснухи С-77: дикий вариант (wt) (6-й пассаж) и ослабленный вариант (са) 39-й и 46-й пассаж (са39 и са46).
Вакцинный штамм вируса краснухи Wistar RA 27/3 на 27-м пассаже, полуфабрикат вакцинного препарата, полученный от МПБП ФГУП "НПО Микроген" (титр 3,8-4,0 lg ТЦД50/мл).
Выделение вирусной РНК, реакция обратной транскрипции, амплификация к ДНК. Из исследуемых образцов и образцов калибраторов (образцы с известным титром вируса) выделяли вирусную РНК с помощью набора «Viral RNA Mini Kit" «Qiagen» (Германия) и проводили реакцию обратной транскрипции (ОТ).
При постановке реакции ОТ 2 мкл обратного праймера (15 пмоль/мкл) смешивали с 10 мкл РНК и прогревали в течение 5 мин при 65°С. Далее в 30 мкл реакционной смеси, содержащей помимо праймера и РНК буфер для ОТ, 0,5 мМ дНТФ, 2,5 мМ MgCl2, 4 ед. ингибитора рибонуклеаз, 50 ед. ревертазы вируса лейкоза Молони RevertAid Н Minus М-MuLV, «Fermentas» (Литва), в течение 30 мин при 42°С получали кДНК в амплификаторе Терцик "ДНК-Технология" (Россия). Фермент инактивировали нагреванием при 95°С в течение 5 мин.
Полимеразно-цепную реакцию (ПЦР) проводили в ампли-фикаторе "Циклотемп" (Россия) с использованием "Набора реагентов для проведения ПЦР-РВ" "Синтол" (Россия) в объеме 25 мкл для аналитических целей и 100 мкл для препаративных целей по протоколу, рекомендованному фирмой-производителем.
Длительность циклов денатурации составляла 40 с, отжига - 3060 с. Длительность цикла элонгации определяли в зависимости от длины ожидаемого ПЦР-продукта из расчета 1 мин на 1000 нуклеотидов.
Электрофоретический анализ ПЦР-продуктов проводили в 0,8-2% агарозном геле, содержащем бромистый этидий, в режиме 5 В/см камеры в течение 0,5-1,5 ч. Результаты выявляли и документировали в УФ-свете (312 нм) при помощи гель-документирующей системы «Gel Imager» (Россия).
пробоподготовка ампликонов и секвенирование генома вируса краснухи. Ампликоны выделяли путем вырезания фрагмента ДНК из геля, далее очищали ПЦР-продукт с помощью набора фирмы "Омникс" (Россия) и последующего переосаждения ДНК спиртом.
Секвенирование ДНК осуществляли методом термина-ции цепи по Сэнгеру на приборе CEQ 8000 "Beckman Coulter" (США) с использованием фирменного набора реактивов «The GenomeLab Methods Development Kit» в соответствии с рекомендациями производителя.
филогенетический анализ и компьютерный анализ ну-клеотидных последовательностей. Нуклеотидные последовательности референс-штаммов вируса краснухи были получены из электронной базы данных GenBank (NCBI). Анализ нуклео-тидных последовательностей, подбор праймеров и зонда проводили с помощью компьютерных программ Vector NTI Advance 9.0 («InforMax Inc.», США), FinchTV 1.4 (США), Methyl Primer Express 1.0, Unipro UGENE 1.7.0 (Россия).
Вирус краснухи генотипировали по наиболее консервативному участку генома, кодирующему оболочечный белок Е1 длиной 1442 нуклеотидов, согласно рекомендациям ВОЗ [12].
получение образцов вируссодержащей жидкости. Для получения образцов вируссодержащей жидкости культуру клеток Vero заражали вирусом краснухи с множественностью заражения 0,01 инфекционная единица на клетку. После адсорбции матрасы с монослоем зараженных клеток промывали средой МЕМ. Затем заливали в матрасы 7 мл среды МЕМ, содержащей 1мМ глютамина «Gibco» (США) и 100 мкг/мл гентамицина «Gibco» (США). Зараженные культуры инкубировали 7 дней при 33, 39°С и 5% С02. Ежедневно отбирали аликвоту вируссодержащей жидкости, осветляли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин и хранили при -70°С.
Сбор вирусного материала проводили ежедневно со 2-х по 7-е сутки после заражения и определяли титр вируса методом ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ).
Количественное определение вируса краснухи методом пЦР-РВ с флуоресцентной детекцией проводили, как указано в статье Ю. И. Забияки и соавт. [3]. Результат количественной ПЦР-РВ высчитывали по отношению к контрольным образцам с присвоенной специфической активностью, выраженной в ^ТЦД50/мл, и вследствие этого также выражали в ^ТЦД50/мл.
Экспериментальные данные статистически обрабатывали с помощью t-критерия Стьюдента. Все вычисления проводили, используя пакет прикладных программ Microsoft Excel.
Результаты и обсуждение В работе использовали отечественный штамм вируса краснухи С-77, выделенный Р. Г. Десятсковой из носового смыва больного манифестной формой краснухи в 2001 г. (wt). Для получения аттенуированных вариантов (са39 и са46) штамма С-77 дикий вариант длительно культивировали в культуре клеток Vero: 34 пассажа при температуре 35°С, 4 и 11 пассажей при 33°С.
Определение температурной чувствительности wt, са39 и са46 вариантов штамма C-77
В нескольких исследованиях продемонстрировано, что морфология бляшек, особенности роста на разных культурах клеток, иммуногенетический маркер напрямую связаны с аттенуацией вируса краснухи. В то же время показано, что вакцинные штаммы
вируса краснухи обладают термочувствительным фенотипом, что выражается в пониженной репродукции при 39°С по сравнению с 35°С [8, 9]. О механизмах возникновения термочувствительного фенотипа до сих пор известно крайне мало.
В нашем исследовании проведен анализ интенсивности репродукции wt, ca39 и ca46 вариантов штамма С-77 при различных температурных режимах (33, 39°C) с использованием метода количественного определения вируса на основе ПЦР-РВ. Выбор метода ПЦР-РВ обусловлен тем, что классические методы количественной оценки вируса краснухи - реакция бляшкообразования и реакция цитопатического действия, являющиеся "золотым стандартом", - имеют ряд таких недостатков, как длительность теста (около 12 дней), трудоемкость, а также субъективность в интерпретации результатов. ПЦР-РВ позволяет получить результат (оценить титр) в течение 5-6 ч. В работе Ю. И. Забияки и соавт. показана высокая степень корреляции между результатами определения титра вируса краснухи по реакции ЦПД и ПЦР-РВ при соблюдении определенных условий [3].
При культивировании са39 и са46 вариантов штамма С-77 наблюдали рост титра вируса как при 33°С, так и при 39°С. Наибольших значений титр достигал при температуре культивирования 33°C, тогда как при 39°С зафиксировали значительно более медленное накопление вируса (рис. 1, 2). У wt варианта рост титра вируса при всех температурах был менее выражен, чем у ca вариантов, что может быть обусловлено худшей адаптацией wt варианта вируса к культуре клеток Vero (рис. 3).
Интенсивность репродукции са вариантов штамма С-77 достоверно различалась при культивировании при 33 и 39°С на 3, 4 и 5-е сутки культивирования, между тем у дикого варианта достоверной разницы не выявили (см. рис. 1-3). Так, на 5-е сутки культивирования зараженных клеток при температуре 33°C величина титра са39 и са46 вариантов штамма С-77 составила 6,2 и 6,5 ^ТЦД50/мл соответственно, тогда как при 39°С нарастание титра оказалось менее выраженным: его значение составило 4 и 3,9 ^ТЦД50/мл соответственно. При культивировании wt варианта штамма C-77 на 5-е сутки культивирования титр составил 3,9 ^ТЦД/мл как при 33°C, так и при 39°C. Следовательно, на 5-е сутки культивирования при 39°С титр ca46 варианта штамма C-77 был на 2,6 ^ТЦД50/ мл, а ca39 варианта на 2,2 ^ТЦЦ/мл меньше, чем при температуре культивирования 33°C (p < 0,01), в то время как у wt варианта не наблюдали достоверной разницы в титрах вируса при температуре культивирования 33 и 39°С на 5-е сутки (см. рис. 1-3).
Разница в титре са46 варианта при температуре культивирования 33 и 39°С была более выражена, чем у са39 варианта (p < 0,01), что может быть обусловлено лучшей адаптацией са46 варианта к пониженной температуре культивирования.
Таким образом, установлена достоверная разница в титре са39 и са46 вариантов штамма С-77 при температуре культивирования 33 и 39°С при отсутствии достоверной разницы для wt варианта, что подтверждает наличие биологического маркера аттенуации -холодоадаптированного фенотипа. Для варианта са39 ранее была подтверждена пониженная иммуноген-
ность на кроликах, что характерно и для вакцинного штамма RA27/3 [4]. Данные фенотипические проявления могут служить маркерами аттенуации и использоваться наряду с секвенированием для контроля генетической стабильности вакцинных штаммов.
Определение нуклеотидной последовательности генома и генотипа дикого и ослабленного вариантов штамма С-77 вируса краснухи
Вирус краснухи является единственным представителем рода ЯиЬтг^ семейства Togaviridae. Геном вируса краснухи представляет собой однонитевую геномную РНК положительной полярности размером 9762 нуклеотида и является высококонсервативным
7-1 6543-
са46 вариант
íp
3-й 4-е 5-е
Щ 33°С Щ 39°С
Рис. 1. Накопление са46 варианта штамма С-77 вируса краснухи в культуральной жидкости при температуре культивирования 33 и 39°С.
Здесь и на рис. 2, 3: по горизонтали - сутки после заражения; по вертикали - ^ ТЦД50/мл; данные представлены в виде средних значений трех независимых экспериментов.
са39 вариант
7-, 654
зН
¡é
3-й
4-е
5-е
зз°с
39°С
Рис. 2. Накопление са39 варианта штамма С-77 вируса краснухи в культуральной жидкости при температуре культивирования 33
и 39°С.
7-1 65432-
wt вариант
3-й
4-е
5-е
33 С
39 С
Рис. 3. Накопление варианта штамма С-77 вируса краснухи в культуральной жидкости при температуре культивирования 33
и 39°С.
ОРС НСБ
ОРС СБ
Р 150
Р 90
Кэп
г
poly А
МТ X р н RP
Е2
Е1
НТР
Thr/Ser
(21)
Tyr/Cys
(1042)
Leu/Phe
(1774)
НТР
Leu/Phe
(27)
НТР
Ser/Thr
(1106)
Ala/Thr
(564)
Рис. 4. Локализация аминокислотных замен штамма С-77 вируса краснухи, приобретенных в процессе холодоадаптации.
Показаны две ОРС и локализация генов СБ и НСБ вируса краснухи. МТ - метилтрансфераза; Р - протеаза; Н - хеликаза; ИР - полимераза; С -капсидный белок; Е2 и Е1 - оболочечные белки; НТР - нетранслируемые региона: генома; кэп на 5'-м конце генома, ро1уА на 3'-м. Стрелками указана локализация аминокислотных замен у са39 варианта штамма С-77. В скобках - позиция аминокислоты.
(рис. 4). В работе проведено полное секвенирование генома са39 и wt вариантов штамма С-77 вируса краснухи, за исключением нетранслируемых областей на 5'- и З'-конце. Также проведено секвенирование фрагмента генома длиной 1364 нуклеотида, кодирующего протеазу, у варианта са46 штамма С-77.
Геном вируса краснухи содержит нетранслируе-мую область длиной 40 нуклеотидов на 5'-конце, открытую рамку считывания неструктурных белков (ОРС НСБ) длиной 6348 нуклеотида (41-6391). ОРС НСБ кодирует два неструктурных полипротеина р150 и р90 и включает домены метилтрансферазы, хеликазы, протеазы и полимеразы. Нетранслируе-
мая область между двумя ОРС составляет 120 нт (6389-6509), далее располагается ОРС структурных белков (ОРС СБ), кодирующая СБ (капсидный белок С и два оболочечных белка Е1 и Е2) длиной 3192 нт (6510-9702). НСБ транслируются с геномной РНК и функционируют в качестве вирусного репликационного комплекса. Полноразмерная РНК отрицательной полярности реплицируется с геномной РНК и выступает в качестве матрицы для синтеза вирусной РНК и субгеномной РНК, которая, в свою очередь, является матрицей для синтеза СБ.
Согласно рекомендациям ВОЗ, выделяют две филогенетические ветви (или клэй-да). Внутри клэйда 1 выделяют 6 генотипов (1В, 1С, Ш, 1Е, Щ Ю), также в него было включено 4 дополнительных (предполагаемых генотипов: 1а, Ш, 1 и Ц), в клэйде 2 выделяют 3 генотипа - 2А, 2В, 2С. Таким образом, на данный момент существуют 13 генотипов вируса краснухи [12].
С целью генотипирования выделенного штамма вируса краснухи С-77 провели филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей, кодирующих ген Е1 размером 1442 нуклеотида (82569698) wt варианта вируса, в результате которого штамм вируса краснухи С-77 был отнесен к генотипу ^ (рис. 5). Параллельно в качестве контроля осуществляли секвенирование участка генома Е1 вакцинного штамма ИА 27/3: полученная нами последовательность на 100% совпала с уже известной (код в GenBank - FJ211588).
Следует отметить, что генотип ^ вируса краснухи часто встречается на территории России и стран СНГ.
Таблица 1
Нуклеотидные и аминокислотные замены ca варианта штамма С-77
Фрагмент Мутации в нуклеотидной последовательности Аминокислотные замены
позиция wt ca39 уникальность* позиция wt ca
ОРС НСБ P150 164 ACC TCC Нет 21 Thr Ser
328 AGC AGT Да - - -
2320 AGC AGT Нет - - -
3165 TAC TGC Да** 1042 Tyr Cys
3357 AGT ACT Да 1106 ser thr
P90 5360 СТС TTC Нет 1774 Leu Phe
6064 TTC TTT Да** - - -
6223 GTC GTT Нет - - -
ОРС СБ C 6588 CTC TTC Да 27 Leu phe
7392 GCC GCT Нет - - -
E2 7490 CAT CAC Нет - - -
8199 GCC ACC Да 564 Ala thr
E1 8957 GTC GTT Нет - - -
Примечание. * - проводилось сравнение с 97 нуклеотидными последовательностями диких штаммов вирусов краснухи, представленными в ОепВапк КСВ1 (из них 24 последовательности с полноразмерным геномом; 44, кодирующих ОРС СБ; 2, кодирующие ОРС НСБ; 29, кодирующих протеазу); ** - обнаружено совпадение только с одной последовательностью из базы данных ОепВапк КСВ1. Жирным шрифтом выделены нуклеотидные замены, приводящие к уникальной замене аминокислоты (т. е. в данных позициях ни у одного из диких штаммов вируса краснухи не обнаруживалось такой же аминокислоты, за исключением 1 штамма).
Сравнительный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей дикого и аттенуиро-ванного вариантов штамма С-77 вируса краснухи
С целью выявления вероятных генетических детерминант аттенуации было проведено сравнение геномов wt и са39 вариантов штамма С-77 вируса краснухи. При сравнении геномов са и wt вариантов штамма С-77 обнаружили 13 нуклеотидных отличий, 6 из которых приводили к заменам аминокислот. Во фрагменте, кодирующем НСБ (ОРС НСБ) выявили 8 нуклеотидных замен, 4 из которых ведут к заменам аминокислот. Во фрагменте, кодирующем СБ (ОРС СБ), отметили 5 нуклеотидных замен, 2 из которых ведут к заменам аминокислот (табл. 1).
В результате проведения множественного выравнивания последовательностей са39 и wt вариантов штамма С-77 с 97 последовательностями диких штаммов вируса краснухи разной длины из базы данных КСБ1 ОепБаПк обнаружили, что 2 замены в ОРС НСБ (Туг1042Су8 и Seг1106Thг) и 2 в ОРС СБ (Leu27Phe и А1а5671Ъг) являются почти уникальными, т. е. в данных позициях ни у одного из диких штаммов вируса краснухи, за исключением 1-2 штаммов, нет такой же аминокислоты (см. табл. 1, выделено жирным шрифтом).
На данный момент в мире зарегистрировано 9 живых аттенуированных вакцин, основанных на разных штаммах вируса краснухи (НР^77, ИА27/3, СвпёвИШ, ВИБ-2, Matsuba, ТСИБ19, КИТ, Matsuura и ТО-336), полученных путем пассирования изолятов вируса при пониженной температуре [6, 7]. Линии клеток различались для разных штаммов, а количество пассажей
Таблица 2
Сравнение аминокислотных замен варианта ca штамма С-77, приобретенных в процессе аттенуации известными вакцинными и
дикими штаммами вируса краснухи
ОРС НСБ ОРС СБ
Штамм (генотип) метилтрансфераза протеаза полимераза капсидный белок оболочечный белок
164 21 3165 1042 3357 1106 5360 1774 6588 27 8199 564
С-77 ^ (1Ь) АСС ТЪГ ТАС ТУГ АОТ Ser СТС Leu СТС Leu ОСС А1а
С-77 са39 (1Ь) ТСС Ser ТСС Cys АСТ ТЬг ТТС Phe ТТС Phe АСС ТЬг
С-77 са46 (1Ь) - - ТСС Cys - - - - - - - -
Ма1зиЬа ^ (1А) АСС ТЬг ТАС ТУГ АОТ Ser ТТС Phe СТС Leu ОСС А1а
Ма1зиЬа vac (1А) АСС ТЬг САС Шв АОТ Ser ТТС Phe СТС Leu ОСС А1а
Вй-1 ^ (2А) АСС ТЬг ТАС Туг АОС Ser ТТС Phe СТС Leu ОСС А1а
Bгd-2 vac (2А) АСС ТЬг ТАС Туг АОТ Ser ТТС Phe СТС Leu ОСС А1а
КИТ wt (1А) АСС ТЬг ТАТ ТУГ АОТ Ser ТТС Phe СТС Leu ОСС А1а
КИТ vac (1А) АСС ТЬг САС His АОТ Ser ТТТ Phe СТС Leu ОСС А1а
То-336 wt (1А) АСС ТЬг ТАС Туг АОТ Ser ТТС Phe СТС Leu ОСС А1а
То-336 vac (1А) АСС ТЬг ТАС Туг АОТ Ser ТТС Phe СТС Leu ОСС А1а
Matsuuгa ^ (1А) АСС ТЬг ТАС Туг АОТ Ser ТТС Phe СТС Leu ОСС А1а
Matsuuгa vac (1А) АСС ТЬг ТАС Туг АОТ Ser ТТС Phe СТС Leu ОСС А1а
ТСИВ-19 vac (1А) АСС ТЬг ТСС Cys АОТ Ser ТТС Phe СТС Leu ОСС А1а
Ceпdehi1 vac (1А) АСС ТЬг САС His АОТ Ser ТТС Phe СТС Leu ОСС А1а
Иа 27/3 vac (1А) ТСС Ser ТАС Туг АОТ Ser ТТС Phe СТС Leu ОСС А1а
Примечание. Аттенуированные/вакцинные штаммы вируса краснухи - светлые строки, дикие - затемненные; «-» - секвенирование не проводилось. Жирным шрифтом выделены совпадающие позиции аминокислотных замен и соответствующие им триплеты нуклеотидов са39 варианта штамма С-77 и вакцинных штаммов. Для штаммов, у которых не сохранились штаммы-предки, жирным шрифтом выделены аминокислоты, совпадающие с аминокислотами других вакциннных штаммов или вариантом са39 штамма С-77 и не встречающиеся ни у одного из диких штаммов-предков.
Рис. 5. Определение генотипа штамма С-77 вируса краснухи с помощью филогенетического анализа.
Референс-штаммы данной группы были выделены на территории Томска и Белоруссии. В базе данных ОепБапк (КСБ1) зарегистрированы 16 последовательностей геномов вирусов, выделенных на территории России в недавнее время и относящихся к этому генотипу. Согласно базе данных ОепБапк, за последние 5-6 лет на территории России были выделены штаммы, относящиеся к генотипам ^ и 1Е.
варьировало от 30 до 90. Для всех вакцинных штаммов аттенуацию проводили при пониженной температуре (от 28 до 35°С), она сопровождалась накоплением мутаций и приобретением термочувствительного фенотипа. Количество и локализация замен различались у разных штаммов. Так, в штамме ТО-336 обнаружили 6 аминокислотных замен, возникших в процессе ат-тенуации, а в штамме Matsuura - 19, что может быть обусловлено различными линиями клеток, на которых проводили пассирование, и разным количеством пассажей. Для получения штамма TO-336 проводили 7 пассажей на клетках VMK (velvet monkey kidney), 20 пассажей на первичных клетках почки морской свинки и 3 пассажа на клетках RK. Для штамма Matsuura проводили 14 пассажей на клетках VMK, 65 пассажей на культуре клеток амниона куриных эмбрионов и 11 пассажей на перепелиных эмбриональных фибробла-стах [6].
В поиске общих закономерностей генетических изменений, возникающих при холодовой адаптации, сравнили аминокислотные замены штамма С-77 с соответствующими позициями известных полноразмерных последовательностей холодоадаптированных вакцинных штаммов вируса краснухи и их дикими штаммами-предками при их наличии (табл. 2).
Сравнение проводили со следующими штаммами: Matsuba vac (GenBank АВ588193), Matsuba wt (GenBank AB588189), Brd-2 Vac (GenBank AY258323), Brd-1 wt (GenBank AY258322), Takahashi KRT vac (GenBank AB222608), Takahashi KRT wt (RVi/Matsue. JPN/68 GenBank AB003453.1), а также 3 вакцинными штаммами, для которых не сохранены дикие штаммы-предки TCRB-19 (GenBank AB588188), Cendehil (GenBank AF188704) и Ra 27/3 (GenBank FJ211588). Перечисленные вакцинные штаммы относятся к генотипу 1а, за исключением китайских штаммов BRD-1 и BRD-2, которые относятся к генотипу 2А.
В позиции 21 ОРС НСБ вакцинного штамма Ra27/3 также, как и у варианта ca штамма С-77, находится аминокислота Ser, тогда как у варианта wt - Thr. Наличие в этой же позиции аминокислоты Thr у других диких штаммов и отсутствие дикого штамма-предка у RA27/3 не позволяют судить о значимости этой замены для процесса аттенуации вируса краснухи.
У некоторых вакцинных штаммов в триплетах, соответствующих аминокислотным заменам штамма С-77, выявили замены нуклеотидов, не ведущие к заменам аминокислот (позиции 164, 5360).
В позициях 1106 и 1774 ОРС НСБ штамма С-77 обнаружили 2 аминокислотные замены. При этом в штаммах BRD-2 и KRT наблюдали нуклеотидные замены в соответствующих им триплетах, но они не вели к заменам аминокислот. В свою очередь в позиции 6223 у варианта са штамма С-77 определили нуклео-тидную замену, не ведущую к замене аминокислоты; замену в той же позиции обнаружили в вакцинном штамме BRD-2 (см. табл. 2).
В позиции 1042 ОРС НСБ штамма С-77 выявили аминокислотную замену Tyr на Cys. В результате сравнительного анализа в этой же позиции установили замену Tyr на His в японских штаммах Matsuba и Takahashi KRT. Также в 2 вакцинных штаммах TCRB-19 и Cendehil в этих позициях находятся аминокислоты Cys и His соответственно. Важно отме-
тить, что у всех диких штаммов вируса краснухи, за исключением 1 штамма, в этих позициях находится аминокислота Tyr.
В результате сравнительного анализа полноразмерных геномов wt и са39 вариантов штамма С-77 выявили 13 нуклеотидных замен, 6 из которых ведут к заменам аминокислот. В 4 случаях имеют место замены на аминокислоту, нехарактерную для диких штаммов вируса краснухи, что рассматривается нами как свидетельство их вероятной роли в аттенуации вируса краснухи. Результаты исследований разных групп ученых сходятся в том, что мутации, локализованные в генах, кодирующих НСБ, и в частности протеазу, которая участвует в протеолитиче-ском процессинге НСБ, ведут к появлению холодоа-даптированного фенотипа. В нашем исследовании выявлено 4 значимые мутации в области, кодирующей НСБ, 2 из них в области, кодирующей протеазу (см. рис. 4). Двумя группами японских ученых выявлен ряд мутаций в этой области, ведущих к снижению репродукции вируса краснухи при повышенной температуре [8, 11].
Особого внимания заслуживает замена Туг на Cys в позиции 1042 в протеазном домене штамма С-77. Данная мутация локализуется в протеазном домене полипротеина Р150 [19] и является уникальной, т. е. у диких штаммов вируса краснухи в этой позиции практически всегда имеет место аминокислота Туг. В вакцинном штамме TCRB-19 в данной позиции также находится аминокислота Cys, а в штаммах Matsuba и Cendehil - Cys. Данная мутация сохранялась и в варианте ca46 штамма С-77. Замена Tyr на His в позиции 1042 в вакцинном штамме KRT сопровождалась появлением фенотипа ts, что доказано методами обратной генетики [11].
Протеазный домен содержит богатый цистеином участок связывания ионов Ca2+ и Zn2+, которые необходимы для протеазной активности и репликации вируса [16, 17]. Кроме того, данный участок содержит домен связывания кальмодулина (кальцийсвязы-вающий белок), который также играет важную роль в протеазной активности и репликации вируса [18]. Мутации в этом домене приводят к снижению его конформационной стабильности при высокой температуре [16], что является возможной причиной приобретения термочувствительного фенотипа некоторых вакцинных штаммов вируса краснухи.
Таким образом, в результате сравнительного анализа полноразмерных геномов вариантов wt и ca39 штамма С-77 выявлены вероятные генетические детерминанты аттенуации вируса краснухи. Обнаружена замена Туг на Cys в позиции 1042 ОРС НСБ, которая, по всей вероятности, играет ключевую роль в приобретении холодоадаптированного фенотипа варианта ca штамма С-77, что согласуется с последними данными литературы.
Сведения об авторах:
Отдел вирусологии им. О. Г. Анджапаридзе НИИВС им. И. И. Мечникова РАМН
Дмитриев Григорий Владимирович - науч. сотр., лаборатория экспериментальной иммунологии, e-mail: grigorij.d@mail.ru;
Т. К. Борисова - д-р биол. наук, зав. лабораторией экспериментальной иммунологии;
Е. Б. Файзулоев - канд. биол. наук, зав. лабораторией молекулярной вирусологии;
Ю. И. Забияка - науч. сотр., лаборатория экспериментальной иммунологии;
Р. Г. Десятскова - д-р мед. наук;
В. В. Зверев - д-р биол. наук, проф., академик РАМН, директор НИИВС им. И. И. Мечникова РАМН.
ЛИТЕРАТУРА
1. Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации. 3.3.1. Вакцинопрофилактика. Основные требования к вакцинным штаммам холерного вибриона методические указания МУ 3.3.1.2075-06. - М., 2006.
2. Десятскова Р. Г. и др. // Краснуха. Синдром врожденной краснухи. Инф. сборник. - 1997. - С. 17-24.
3. Забияка Ю. И., Файзулоев Е. Б., Борисова Т. К. и др. // Журн. микробиол. - 2010. - № 5. - С. 57-62.
4. Зверев В. В., Десятскова Р. Г., Юминова Н. В. и др. // Эпидемиол. и вакцинопрофилактика. - 2008. - № 4. - С. 46-53.
5. Румянцев А. А., Грачев В. П., Козлов В. Г. и др. // Вопр. вирусол. - 2001. - № 6. - С. 11-15.
6. Best J. M. // Epidemiol. Infect. - 1991. - Vol. 107. - P. 17-30.
7. Hobman T., Chantler J. // Fields Virology. - 5-th ed. - 2007. - P. 1069-1100.
8. Otsuki N, AboH, Kubota T. et al. // Vaccine. - 2011. - Vol. 29. - P. 1863-1873.
9. OhtawaraM., KobuneF, Umino Y. et al. // Arch. Virol. - 1985. - Vol. 83. - P. 217-227.
10. Plotkin S. A., Oski F. A., HartnettE. M. et al. // J. Pediatr. - 1965. -Vol. 67. - P. 182-191.
11. SakataM., Komase K., Nakayama T. // Vaccine. - 2009. - Vol. 27. -P. 234-242.
12. Weekly epidemiological record // Update of standard nomenclature for wild-type rubella viruses. - 2007. - Vol. 82, N 24. - P. 216-222.
13. WHO Expert Committee on Biological Standardization // Technical Report Series N 941. - Geneva, 2007. - P. 265-301.
14. WHO Meeting Report Working Group on Technical Specifications for Manufacture and Evaluation of Dengue Vaccines. Geneva //
Quality control aspects of manufacturing live recombinant dengue vaccines. 11-12 May 2009. - P. 1-36.
15. WHO Expert Committee on Biological Standardization // Technical Report Series N 924. - Geneva, 2004. - P. 35-101.
16. Zhou Y, Tzeng W. P., Yang W. et al. // J. Vrol. - 2007. - Vol. 81, N 14. - P. 7517-7528.
17. Zhou Y, Tzeng W. P., Yeming Y. et al. // Biochem. J. - 2009. - Vol. 417, N 2. - P. 477-483.
18. Zhou Y, Tzeng W. P., WongH. C. et al. // J. Biol. Chem. - 2010. - Vol. 285, N 12. - P. 8855-8868.
19. Zhou Y, UshijimaH, Frey T. K. // J. Gen. Virol. - 2007. - Vol. 88, N 3. - P. 932-941.
Поступила 16.12.11
STUDYING OF MOLECULAR MECHANISMS OF RUBELLA VIRUS ATTENUATION EVIDENCE FROM RUSSIAN STRAIN C-77
G. V. Dmitriev, T. K. Borisova, E. B. Faizuloev, J. I. Zabiyaka, R. G. Desiatskova, and V. V. Zverev
Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow, Russia
Live attenuated rubella vaccine is used for vaccination. Temperature-sensitive (ts) phenotype was proved for almost all rubella vaccine strains, and the acquisition of the ts phenotype during cold adaptation was strongly correlated with the attenuation of the wild-type viruses. Nevertheless, the molecular mechanisms of the attenuation have been insufficiently understood for rubella virus. Study ofthese mechanisms, identifying genotypic markers of attenuation, which together with the sequence analyses could be used for genetic stability control of vaccine strains, is still of current interest. In this work, we determined nearly complete genome sequences of attenuated (ca) and the wildtype progenitor (wt) of the rubella virus strain C-77 isolated in Russia. Possible genetic determinants of attenuation were detected. Thus, 13 nucleotide differences leading to 6 amino acid substitutions were found. Four amino acid substitutions were found to be almost unique. Special consideration should be given to Tyr1042Cys substitution in the protease domain of C-77 strain, because it most probably plays the crucial role in acquisition of ts-phenotype.
Key words: rubella virus, attenuated strains, determinants of attenuation, temperature sensitivity
© Н. Ф. ЛОМАКИНА, Ю. М. БАТУЕВ, 2012 УДК 578.835:578.53].083.3:577.2.08
Н. Ф. Ломакина, Ю. М. Батуев
новый генотип вируса мешотчатого расплода у пчел APIS MELLIFERA
ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я. Р. Коваленко, РАСХН, Москва
Вирус мешотчатого расплода (BMP) приводит к гибели пчелиных личинок. До недавнего времени было известно три генотипа BMP: европейский, азиатский и южноафриканский [7, 9]. Серологические исследования, секвенирование и филогенетический анализ фрагмента гена РНК-полимеразы BMP позволили обнаружить у европейской пчелы Apis mellifera в европейской части Российской Федерации (РФ) два генотипа, один из которых образует самостоятельную ранее никем не описанную группу (генотип 4), занимающую промежуточное положение на филогенетическом древе между вирусами азиатского и южноафриканского генотипов. К этой группе вирусов относятся изолят 202/8, выделенный в 2006 г в Московской обл. от пчел, завезенных ранее из Узбекистана, и варианты Тг5 и 6/А3 лабораторного штамма, выделенного в Калужской обл. в 1986 г. Гомология между ними составляет 94,2%, в то время как с представителями других групп она не превышает 80,6-83,5%. Другую группу BMP составляют вирусы европейского генотипа, циркулирующие в Краснодарском крае, Адыгее и Московской обл. (изоляты 207/4 и 212/3). Гомология между ними - 99%. Два генотипа BMP, обнаруженных в РФ, удалось дифференци-
ровать с помощью ПЦР и РИД. В РИД оба генотипа реагируют с сывороткой № 6 (1), в то время как сыворотка № 58 распознает только генотип 4.
Ключевые слова: вирусные болезни пчел, вирус мешотчатого расплода, ПЦР
Мешотчатый расплод - вирусная болезнь пчелиных личинок. Они погибают, когда прядут свои коконы в запечатанных ячейках перед окукливанием. Погибшие личинки дряблы и водянисты, под кутикулой у них скапливается мутная жидкость, придающая им вид мешочка - отсюда и название. При хроническом течении болезни из-за гибели части расплода (личинок) семья пчел становится менее продуктивной, при обострении семья может погибнуть.
Болезнь у европейской медоносной пчелы Apis mellifera впервые описал G. F. White в 1913 г. и уста-
