CC BY
27
иммунных привилегий СК, влияние на поддержание стволового статуса клеток и удержание их в покоящемся состоянии и влияние на активацию СК при репаративном запросе. Показано, что Т-регуляторные клетки нелимфо-идных тканей по секретому и транскриптому напоминают стволовые клетки, что позволило выделить их в отдельный класс иммунных клеток стволовых ниш.
Суммарно можно говорить о значительном взаимном влиянии иммунной системы и СК, происходящем в стволовых нишах тканей взрослого организма. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 22-25-00459.
Литература:
1. Karpenko D.V., Kapranov N.M., Bigildeev A.E., Front Cell Dev
Biol. 2022, doi: 10.3389/fcell.2022.993056.
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ САМОИНАКТИВИРУЮЩИХСЯ ЛЕНТИВИВЕКТОРОВ ТРЕТЬЕГО ПОКОЛЕНИЯ ДЛЯ АНАЛИЗА КЛОНАЛЬНОГО РАЗНООБРАЗИЯ И РАЗМЕРА КЛЕТОЧНЫХ КЛОНОВ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК НА МОДЕЛИ ОЧАГОВ ЭКТОПИЧЕСКОГО КРОВЕТВОРЕНИЯ У МЫШЕЙ
Д.В. Карпенко1, А.С. Артюхов2, А.Е. Бигильдеев1
1 ФГБУ НМИЦ гематологии Минздрава России, Москва, Россия
2 Центр высокоточного редактирования
и генетических технологий для биомедицины, РНИМУ им. Н.И. Пирогова, Москва, Россия
e-mail: d_@list.ru
Ключевые слова: лентивирусный вектор, LeGO, МСК, сайт интеграции, индекс-хоппинг, КОЕф, маркирование клеток, очаг эктопического кроветворения.
Важным аспектом применения лентивирусных векторов для генной и клеточной терапии с генетически модифицированными клетками является понимание эффективности заражения различных видов клеток, особенно стволовых, а также информация о сайтах интеграции (СИ) провирусов. Это необходимо для оценки ассоциированных рисков. С другой стороны, лентивирусные векторы применяются для индивидуального маркирования различных популяций клеток и анализа клональной динамики в них. Однако клональное устройство некоторых типов тканей млекопитающих, в частности, стромы костного мозга (КМ), до сих пор остается недостаточно изученным. Продвижение в этом направлении позволит более эффективно применять регенеративный потенциал мезенхимных стволовых клеток (МСК) для восполнения ими функций органов и тканей.
Стромальный подслой длительной культуры костного мозга декстеровского типа (ДККМ) мыши (n = 10) транс-дуцировали самоинактивирующимся лентивирусным вектором 3 поколения системы LeGO на основе HIV-1. Трансдуцированные ДККМ имплантировали под капсулу почки сингенным реципиентам. В очагах эктопического кроветворения (ОЭК), полученных спустя 42 дня, исследовали содержание колониеобразующих единиц фибро-бластных (КОЕф), эффективность маркирования ДкКм и КОЕф. СИ в ОЭК изучали с помощью NGS на Illumina MiSeq. Биоинформатической анализ проводили алгоритмом, разработанным авторами на языке Python. Картирование СИ выполняли NCBI BLAST.
Несмотря на высокую эффективность заражения ДККМ, ни одна из 309 КОЕф, полученных из 10 ОЭК, не была маркирована, по данным цифровой капельной ПЦР. ЫЭВ-анализ показал, что крупных маркированных клонов (40-100 клеток), было всего 10 из 2165 среди всех образцов. Следовательно, клетки с высоким про-лиферативным потенциалом не были эффективно заражены. Значит, регистрируемые маркированные клетки — это не стволовые стромальные клетки, которые переживают процедуру первичной имплантации. Их доля от всех стромальных клеток ОЭК оценивается в 30% (диапазон значений 5-72%). Картирование СИ показало, что они распределены по всему геному мыши, с небольшими преференциями к генам. Отмечено, что индекс-хоппинг — серьезное препятствие для анализа амплифи-цированных библиотек.
В подслое ДККМ эффективность заражения МСК заметно ниже, чем КОЕф и более дифференцированных стромальных клеток. Это может быть обусловлено совокупностью молекулярных процессов, которые определяют стволовый статус клетки. Это подразумевает, что эффективность генной терапии, основанной на подобных лентивирусных векторах, может быть ограничена и определяется, в основном, временем жизни зараженных не стволовых клеток. С другой стороны, это означает сниженную вероятность нарушения функций стволовых клеток.
РАЗРАБОТКА МОДЕЛИ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА И ЕЕ ВАЛИДАЗАЦИЯ С ПОМОЩЬЮ ПОВЕДЕНЧЕСКИХ ТЕСТОВ НА КРЫСАХ
Е.К. Карсунцева, А.Д. Воронова, С.С. Андрецова, А.В. Чадин, Г.А. Фурса, О.В. Степанова, В.П. Чехонин
ФГБУ НМИЦ ПН им. В.П. Сербского Минздрава России, Москва, Россия
e-mail: katya.karsunceva@gmail.com
Ключевые слова: моделирование болезни Альцгеймера, бета-амилоид, тесты открытого поля, тест на пассивное избегание, водный лабиринт Морриса.
Болезнь Альцгеймера (БА) на сегодняшний день является тяжелейшим нейродегенеративным заболеванием, характеризующимся прогрессирующей потерей памяти и дезориентацией в пространстве [1]. БА затрагивает население старше 65 лет, и после диагностирования заболевания средняя продолжительность жизни пациентов составляет всего 7 лет. Существующие подходы к лечению способствуют лишь замедлению нейродегенерации, однако не приводят к выздоровлению пациентов. Таким образом, поиск эффективной терапии БА остается важнейшей задачей нейробиологии. Для оценки различных стратегий лечения необходимы экспериментальные и доклинические исследования, в которых большая роль отводится изучению поведенческих реакций у лабораторных животных. На данный момент существует множество протоколов для моделирования болезни Альцгеймера, однако все они имеют свои недостатки [2]. Таким образом, целью данного исследования было разработать оптимальную модель болезнни Альцгеймера на крысах и провести ее валидиза-цию с помощью поведенческих тестов.
В исследовании были использованы самцы (n=16) и самки (n=16) линии Вистар в возрасте 6 месяцев. Синтетический бета-амилоид (2,5 нмоль) вводили по 5 мкл в оба полушария в область гиппокампа. Для
сравнения были использованы интактные крысы и животные, которым вводили PBS в объеме 5 мкл. Для вали-дизации модели болезни Альцгеймера были проведены следующие тесты: открытое поле, узнавание предметов, У-лабиринт, пассивное избегание и водный лабиринт Морриса. Тесты проводили через 4 недели после введения бета-амилоида в течение последующих 4 недель. Для оценки и обработки данных, полученных после тестов, проводили статистический анализ в программах GraphPad Prism 8.
У животных, которым вводили бета-амилоид, были выявлены значимые ухудшения показателей в У-лабиринте и водном лабиринте Морриса, тогда как в группах сравнения не наблюдалось каких-либо нарушений. Полученные результаты могут свидетельствовать о потере интереса у животных, нарушении памяти и дезориентации в пространстве. Эти процессы являются основными симптомами БА, наблюдаемыми у пациентов.
В большинстве работ моделирование БА проводят только на самцах, тогда как в своем исследовании мы использовали крыс обоих полов. Это является значимым преимуществом нашей модели, так как БА подвержены как мужчины, так и женщины. Таким образом, нами была успешно оптимизирована и валидизирована модель болезни Альцгеймера на крысах с помощью поведенческих тестов. Данная модель может быть рекомендована для дальнейшего изучения терапевтических препаратов при лечении болезни Альцгеймера. Работа поддержана грантом РНФ № 22-15-00141.
Литература:
1. Solis E Jr., Hascup K.N., Hascup E.R. J. Alzheimers Dis. 2020.
V. 76. N. 4. P. 1179-1198.
2. Drummond E., Wisniewski T. Acta Neuropathol. 2017 Feb. V.
133. N. 2. P. 155-175.
ОЦЕНКА ЭФФЕКТОВ ИНГИБИРОВАНИЯ СИГНАЛЬНОГО КАСКАДА NOTCH НА ДИФФЕРЕНЦИРОВКУ ИНДУЦИРОВАННЫХ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА В ПРЕДШЕСТВЕННИКИ ДОФАМИНЕРГИЧЕСКИХ НЕЙРОНОВ
Н.В. Католикова1, 2, Д.Д. Шафранская3, А.Д. Пржибельский3, Р.Р. Гайнетдинов1, 4, А.Б. Малашичева2, 5
1 Институт трансляционной биомедицины, Санкт-Петербургский Государственный Университет, Санкт-Петербург, Россия
2 ФГБУН Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия
3 Центр алгоритмический биотехнологии, Санкт-Петербургский Институт Трансляционной Биомедицины, Санкт-Петербургский Государственный Университет, Санкт-Петербург, Россия
4 Клиника высоких медицинских технологий им. Н.И. Пирогова, Санкт-Петербургский государственный Университет, Санкт-Петербург, Россия
5 ФГБУ НМИЦ им. В.А. Алмазова Минздрава России, Санкт-Петербург, Россия
e-mail: nkatolikova@yandex.ru
Ключевые слова: Notch сигналинг, дофаминергические нейроны, дифференцировка, индуцированные плюрипотент-ные стволовые клетки человека.
Notch сигналинг играет важнейшую роль в развитии нервной системы. В эмбриональном периоде белки Notch сигнального пути принимают участие в регуляции клеточной миграции, контроле баланса между самообновлением и дифференцировкой клеток, поддерживают рост аксонов и дендритов, а также вносят вклад в регуляцию синаптиче-ской пластичности. Постнатально Notch сигнальный каскад важен для поддержания пула стволовых клеток, регуляции пролиферации и дифференцировки, функционирования зон взрослого нейрогенеза, а также имеет решающее значение для активации латентных нейрогенных программ.
При нейрональной дифференцировке плюрипотент-ных стволовых клеток белки сигнального каскада Notch необходимы для роста нейронов и играют роль в спецификации и регионализации дифференцирующихся клеток [1]. Однако эффекты от влияния на Notch сигналинг вариабельны и сильно зависят от клеточного контекста и состояния других сигнальных каскадов, с эффекторами которых взаимодействует белки Notch [2].
В нашей работе мы провели оценку эффекта ингиби-рования Notch сингналинга во время дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (иПСК) в дофаминергические нейроны и сделали сравнение между ингибированием Notch с помощью короткой шпилечной РНК (shRNA) к гену эффекторного белка Notch RPBJ-k и ингибитором гамма-секретазы DAPT. Для анализа были использованы транскриптомные профили клеток, полученные на 7-й день дифференцировки.
Мы не обнаружили достоверных различий между клетками контрольной дифференцировки и дифференци-ровки в условиях ингибирования Notch сигналинга с помощью shRNA к RBPJ-k. Вероятнее всего, полученные данные свидетельствуют о том, что индукция дифферен-цировки в нейрональном направлении сама по себе приводит к ингибированию Notch сигналинга и дополнительное ингибирование не оказывает выраженного эффекта. В то же время мы обнаружили, что хотя ингибирование Notch с помощью DAPT имеет много общих эффектов по сравнению с более специфичным ингибированием Notch с помощью shRNA к RPBJ-k, между этими двумя воздействиями есть достоверные различия. Применение DAPT приводит к более выраженной активации SHH-сигналинга, играющего важную роль в направлении дифференцировки иПСК, а также к изменению спектра экспрессируемых рецепторов. Кроме того, эти клетки в большей степени экспрессируют DEPTOR, что приводит к снижению активности mTOR сигналинга по сравнению с клетками, в которых ингибирование Notch было выполнено с помощью shRNA к гену RBPJ-k. Работа выполнена за счет средств гранта НШ-4664.2022.1.4.
Литература:
1. Tieng, V. et al. Stem Cells Dev. 23, 1535-1547. 2014.
2. Qi, Y. et al. Nat. Biotechnol. 35, 154-163. 2017.
ПРОТЕОМНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ВНЕКЛЕТОЧНОГО МАТРИКСА, СЕКРЕТОМА И КЛЕТОК ПРИ СТАРЕНИИ МСК И ВОЗДЕЙСТВИИ GDF11
Д.Н. Каширина, Д.К. Матвеева, А.Ю. Ратушный, И.М. Ларина, Л.Б. Буравкова
ФГБУН ГНЦ РФ Институт медико-биологических проблем РАН, Москва, Россия
e-mail: daryakudryavtseva@mail.ru
Ключевые слова: мезенхимальные стромальные клетки, про-теом, клеточное старение, внеклеточный матрикс, секретом.
