CC BY
5
сравнения были использованы интактные крысы и животные, которым вводили PBS в объеме 5 мкл. Для вали-дизации модели болезни Альцгеймера были проведены следующие тесты: открытое поле, узнавание предметов, У-лабиринт, пассивное избегание и водный лабиринт Морриса. Тесты проводили через 4 недели после введения бета-амилоида в течение последующих 4 недель. Для оценки и обработки данных, полученных после тестов, проводили статистический анализ в программах GraphPad Prism 8.
У животных, которым вводили бета-амилоид, были выявлены значимые ухудшения показателей в У-лабиринте и водном лабиринте Морриса, тогда как в группах сравнения не наблюдалось каких-либо нарушений. Полученные результаты могут свидетельствовать о потере интереса у животных, нарушении памяти и дезориентации в пространстве. Эти процессы являются основными симптомами БА, наблюдаемыми у пациентов.
В большинстве работ моделирование БА проводят только на самцах, тогда как в своем исследовании мы использовали крыс обоих полов. Это является значимым преимуществом нашей модели, так как БА подвержены как мужчины, так и женщины. Таким образом, нами была успешно оптимизирована и валидизирована модель болезни Альцгеймера на крысах с помощью поведенческих тестов. Данная модель может быть рекомендована для дальнейшего изучения терапевтических препаратов при лечении болезни Альцгеймера. Работа поддержана грантом РНФ № 22-15-00141.
Литература:
1. Solis E Jr., Hascup K.N., Hascup E.R. J. Alzheimers Dis. 2020.
V. 76. N. 4. P. 1179-1198.
2. Drummond E., Wisniewski T. Acta Neuropathol. 2017 Feb. V.
133. N. 2. P. 155-175.
ОЦЕНКА ЭФФЕКТОВ ИНГИБИРОВАНИЯ СИГНАЛЬНОГО КАСКАДА NOTCH НА ДИФФЕРЕНЦИРОВКУ ИНДУЦИРОВАННЫХ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА В ПРЕДШЕСТВЕННИКИ ДОФАМИНЕРГИЧЕСКИХ НЕЙРОНОВ
Н.В. Католикова1, 2, Д.Д. Шафранская3, А.Д. Пржибельский3, Р.Р. Гайнетдинов1, 4, А.Б. Малашичева2, 5
1 Институт трансляционной биомедицины, Санкт-Петербургский Государственный Университет, Санкт-Петербург, Россия
2 ФГБУН Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия
3 Центр алгоритмический биотехнологии, Санкт-Петербургский Институт Трансляционной Биомедицины, Санкт-Петербургский Государственный Университет, Санкт-Петербург, Россия
4 Клиника высоких медицинских технологий им. Н.И. Пирогова, Санкт-Петербургский государственный Университет, Санкт-Петербург, Россия
5 ФГБУ НМИЦ им. В.А. Алмазова Минздрава России, Санкт-Петербург, Россия
e-mail: nkatolikova@yandex.ru
Ключевые слова: Notch сигналинг, дофаминергические нейроны, дифференцировка, индуцированные плюрипотент-ные стволовые клетки человека.
Notch сигналинг играет важнейшую роль в развитии нервной системы. В эмбриональном периоде белки Notch сигнального пути принимают участие в регуляции клеточной миграции, контроле баланса между самообновлением и дифференцировкой клеток, поддерживают рост аксонов и дендритов, а также вносят вклад в регуляцию синаптиче-ской пластичности. Постнатально Notch сигнальный каскад важен для поддержания пула стволовых клеток, регуляции пролиферации и дифференцировки, функционирования зон взрослого нейрогенеза, а также имеет решающее значение для активации латентных нейрогенных программ.
При нейрональной дифференцировке плюрипотент-ных стволовых клеток белки сигнального каскада Notch необходимы для роста нейронов и играют роль в спецификации и регионализации дифференцирующихся клеток [1]. Однако эффекты от влияния на Notch сигналинг вариабельны и сильно зависят от клеточного контекста и состояния других сигнальных каскадов, с эффекторами которых взаимодействует белки Notch [2].
В нашей работе мы провели оценку эффекта ингиби-рования Notch сингналинга во время дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (иПСК) в дофаминергические нейроны и сделали сравнение между ингибированием Notch с помощью короткой шпилечной РНК (shRNA) к гену эффекторного белка Notch RPBJ-k и ингибитором гамма-секретазы DAPT. Для анализа были использованы транскриптомные профили клеток, полученные на 7-й день дифференцировки.
Мы не обнаружили достоверных различий между клетками контрольной дифференцировки и дифференци-ровки в условиях ингибирования Notch сигналинга с помощью shRNA к RBPJ-k. Вероятнее всего, полученные данные свидетельствуют о том, что индукция дифферен-цировки в нейрональном направлении сама по себе приводит к ингибированию Notch сигналинга и дополнительное ингибирование не оказывает выраженного эффекта. В то же время мы обнаружили, что хотя ингибирование Notch с помощью DAPT имеет много общих эффектов по сравнению с более специфичным ингибированием Notch с помощью shRNA к RPBJ-k, между этими двумя воздействиями есть достоверные различия. Применение DAPT приводит к более выраженной активации SHH-сигналинга, играющего важную роль в направлении дифференцировки иПСК, а также к изменению спектра экспрессируемых рецепторов. Кроме того, эти клетки в большей степени экспрессируют DEPTOR, что приводит к снижению активности mTOR сигналинга по сравнению с клетками, в которых ингибирование Notch было выполнено с помощью shRNA к гену RBPJ-k. Работа выполнена за счет средств гранта НШ-4664.2022.1.4.
Литература:
1. Tieng, V. et al. Stem Cells Dev. 23, 1535-1547. 2014.
2. Qi, Y. et al. Nat. Biotechnol. 35, 154-163. 2017.
ПРОТЕОМНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ВНЕКЛЕТОЧНОГО МАТРИКСА, СЕКРЕТОМА И КЛЕТОК ПРИ СТАРЕНИИ МСК И ВОЗДЕЙСТВИИ GDF11
Д.Н. Каширина, Д.К. Матвеева, А.Ю. Ратушный, И.М. Ларина, Л.Б. Буравкова
ФГБУН ГНЦ РФ Институт медико-биологических проблем РАН, Москва, Россия
e-mail: daryakudryavtseva@mail.ru
Ключевые слова: мезенхимальные стромальные клетки, про-теом, клеточное старение, внеклеточный матрикс, секретом.
Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) являются многообещающими кандидатами для клеточной терапии. Терапевтический потенциал МСК в отношении восстановления тканей и заживления ран основан не только на их паракринных эффектах, но и на продукции внеклеточного матрикса (ВКМ), регулирующего функциональную активность клеток. Однако потенциал регенерации с возрастом снижается. Одним из способов модуляции регуляторных функций МСК может быть применение геропротекторных цитокинов, таких как GDF11. Чтобы выяснить механизмы старения МСК, а также возможность модуляции свойств сенесцентных МСК цитокином GDF11, изучали протеомные изменения как самих клеток МСК, так и изменения ВКМ и се-кретируемых белков.
Сенесцентные МСК (линия ASC52telo) получали методом стресс-индуцированного старения с помощью ми-томицина С (МмС). Параллельно в аналогичных условиях культивировали МСК, не подвергшиеся воздействию МмС. Также на этом этапе к половине клеток в каждой группе добавляли рекомбинантный белок GDF11 (Abcam, США) в концентрации 10 нг/мл и культивировали в течение 10 дней. Затем отдельно анализировали белки клеток, белки кондиционированной среды (секретом), а также белки ВКМ, полученного путем децеллюляриза-ции. Протеомный анализ проводили методом жидкостной хроматографии — масс-спектрометрии на основе системы нано-ВэжХ Dionex Ultimate3000 (Thermo Fisher Scientific, США) и масс-спектрометра TimsTOF Pro (Bruker Daltonics, США).
У сенесцентных МСК в лизате выявлено повышение содержания белков, для которых характерно участие в ответе на стресс и тепловой шок, метаболизме белков, регуляции сигналинга апоптоза и др. процессах, регулируемых IL1B, CDKN1, ММР3, GDF15, PLAUR, FAS. Одновременно, снижались уровни белков, участвующих в митозе, экспрессии генов, процессинге РНК, метаболических процессах соединений азота и в регуляции внеклеточного матрикса.
В ВКМ и секретоме МмС+ клеток обнаружено повышенное содержание белков каскада комплемента и коагуляции (PAI1, PAI2, VTN, FGB, A2M), при этом снижены уровни коллагенов I и VI типов (COL1A1, COL1A2, COL6A1, COL6A2, COL6A3), а также регуля-торные и адгезионные гликопротеины FBLN1, HTRA1, LGALS1, TGFBI. Особого внимания заслуживает отрицательный регулятор сигнального пути рецептора гормона роста — GDF15, уровень которого был повышен в образцах как лизата МСК, так и ВКМ и секретома МмС+ клеток.
Добавление в среду культивирования GDF11 приводило к повышению уровня фактора роста гепатомы (HDGF), а также активатора фактора роста гепатоцитов (HGFA) в клетках, а в секретоме увеличивался уровень простациклинсинтазы (PTGIS) — мощного медиатора вазодилатации и ингибитора агрегации тромбоцитов. Обнаруженные белки могут быть ключевыми регуляторами действия GDF1 1. В целом, GDF1 1 не оказывал влияния на белки, ассоциированные с клеточным старением. Работа выполнена при поддержке гранта РНФ № 21-75-10117.
ИНТЕГРАЛЬНЫЙ ПОКАЗАТЕЛЬ В ОЦЕНКЕ БИОСОВМЕСТИМОСТИ ПОКРЫТИЙ ИЗ ОКСИНИТРИДОВ ТИТАНА, ПОЛУЧЕННЫХ С ПОМОЩЬЮ РЕАКТИВНОГО МАГНЕТРОННОГО РАСПЫЛЕНИЯ
И.И. Ким1, 2, М.А. Суровцева1, 2, Н.А. Бондаренко1, 2, А.П. Лыков1, О.В. Повещенко1, 2, Е.В. Чепелева1, 2, И.Ю. Журавлева2, А.А. Алишевская3
1 НИИ клинической и экспериментальной лимфологии — филиал ФГБНУ ФИЦ Институт цитологии и генетики Сибирского отделения РАН, Новосибирск, Россия
2 ФГБУ НМИЦ им. академика Е.Н. Мешалкина Минздрава России
3 ООО «НИЦ Биостатистики и Клинических исследований», Новосибирск, Россия
e-mail: kii5@yandex.ru
Ключевые слова: интегральный показатель, нитинол, оксинитрид титана, биосовместимость, NO, EA.hy926, жизнеспособность.
Сердечно-сосудистые заболевания являются ведущей причиной заболеваемости и смертности населения. Эффективным подходом к коррекции ИБС является коронарная ангиопластика, заключающаяся в установке стента. Большое распространение получили стенты с лекарственным покрытием. Однако в отдаленные сроки после их установки на фоне длительно развивающихся рестенозов формируются тромбы. В связи с этим в последнее время вырос интерес к биоинертным покрытиям из оксидов и оксинитридов титана. Титанооксидные пленки улучшают био- и гемосовместимость металлической подложки.
В данной работе изучали образцы с покрытиями TiON с различным соотношением N2 к O2, нанесенных с помощью реактивного магнетронного распыления на подложки из медицинского нитинола (NiTi, 8x8x0,5 мм), время экспозиции — 45 мин.: контроль (NiTi); № 1 (TiO2, U=-100 V); № 2 (TiO2, U=0); № 3 (Ti-O-N, U=-100 V, N/O — 1/1); № 4 (Ti-O-N, U=0, N/O — 1/1); № 5 (Ti-O-N, U=-100 V, N/O — 2/1) № 6 (Ti-O-N, U=0, N/O — 2/1); № 7 (Ti-O-N, U=-100 V, N/O — 3/1); № 8 (Ti-O-N, U=0, N/O — 3/1). Оценивали влияние этих покрытий на цитотоксич-ность, адгезию, жизнеспособность и продукцию NO клетками эндотелиальной линии EA.hy926. Цитотоксичность определяли в МТТ тесте после экспозиции образцов на клетках. Количество адгезированных клеток, живых и находящихся в фазах апоптоза и некроза, подсчитывали на 1 мм2 после окрашивания образцов с клетками акридинновым оранжевым и этидиум бромидом. Продукцию NO определяли с помощью реактива Грисса.
В результате было показано, что наименьшую цито-токсичность продемонстрировал образец № 2, наибольшую адгезию — образец № 4, наибольшую жизнеспособность — № 5, и наибольшую продукцию NO — образец № 8.
В связи с неоднозначностью полученных данных нами был введен интегральный показатель для определения наиболее биосовместимого покрытия. Для этого для каждой из 4 групп измеряемых показателей были установлены следующие пограничные значения и присвоены баллы: нижний допустимый уровень (0 баллов), приемлемый диапазон значений (1 балл), оптимальный уровень (2 балла). В каждой серии экспериментов каждому результату был присвоен соответствующий балл и было рассчитано среднее значение. Интегральный показатель рассчитывался для каждого покрытия по формуле:
