CC BY
10
ЭФФЕКТЫ, ОБНАРУЖЕННЫЕ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ФНОа НА МУЛЬТИПОТЕНТНЫЕ МЕЗЕНХИМНЫЕ СТРОМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ (ММСК) ЧЕЛОВЕКА, СХОЖИ С ЭФФЕКТАМИ ДЕМЕТИЛИРОВАНИЯ АССОЦИИРОВАННОГО CPG В ПРОМОТОРЕ ИНТЕРЛЕЙКИНА-1Р ММСК ЗДОРОВЫХ ДОНОРОВ
Д.В. Карпенко, А.И. Дорофеева, А.Е. Бигильдеев
ФГБУ НМИЦ гематологии Минздрава России, Москва, Россия
e-mail: d_@list.ru
Ключевые слова: ММСК человека, ФНОа, IL1B, ИФН-у, CpG, NF-kB, метилирование, экспрессия IL1B.
ФНОа — один из ключевых регуляторов, ассоциирующийся с повреждениями, воспалительными процессами, и старением. В работе исследовали отклик ММСК костного мозга здоровых людей в ответ на ФНОа и другие стимулы. Было замечено значительное стимулирующее влияние воздействия ФНОа на экспрессию IL1B, являющегося одним из ростовых факторов стромальной ткани костного мозга, а также деметилирующее влияние ФНОа на CpG промотора IL1B в позиции -299 от старта транскрипции (CpG4). CpG4 расположен вблизи сайта связывания факторов транскрипции NF-kB, передающих сигнал от ФНОа и ИЛ-1 р. Изменения экспрессии и профиля метилирования схожи с данными многомерного одно-факторного корреляционного анализа метилирования CpG4, полученными на ММСК человека, что дает основания предполагать их общую природу.
ММСК были получены из костного мозга здоровых доноров (n = 44) после подписания ими информированного согласия. Клетки культивировали в стандартных контрольных условиях или с добавлением одного из факторов: ФНОа, ИЛ-1р или интерферона-гамма (ИФН-у). ММСК также ко-культивировали в течение 4 дней с лимфоцитами (ЛЦ) от стороннего донора. Статус метилирования CpG в промоторе IL1B исследовали при помощи бисульфитной конверсии ДНК с последующей традиционной ПЦР и секвенированием суммарного ПЦР-продукта по Сэнгеру. Экспрессию IL1B измеряли методом RT-qPCR.
Культивирование ММСК (n = 6) в присутствии ФНОа приводит к повышению среднего уровня деметилиро-вания CpG4 и экспрессии IL1B более чем в 100 раз. Отмена ФНОа не приводит к уменьшению деметили-рования CpG4, но сопровождается частичным снижением экспрессии IL1B. Исследование метилирования CpG4 в контрольных образцах и изменения экспрессии IL1B в ММСК (n = 38) в ответ на различные стимулы показало, что увеличение экспрессии IL1B в ММСК происходит в ответ на ФНОа и при ко-культивировании с ЛЦ, но не в ответ на ИЛ-1 р или ИФН-у. ММСК были разделены на две группы: с базовым уровнем деметилирования CpG4 <0,8 (Г1) и >0,9 (Г2). Базовый уровень экспрессии IL1B в Г2 в 5,3 раза больше, чем в Г1. Экспрессия IL1B в Г2 при любых экспериментальных условиях в 1,27,4 раз (медиана 2,6) больше, чем в Г1.
В ответ на ФНОа происходит деметилирование CpG4 и повышение экспрессии IL1B, а отмена ФНОа сопровождается частичным сохранением повышенной экспрессии IL1B при сохранении деметилированного статуса CpG4. Активация экспрессии IL1B в ММСК под действием ФНОа и ЛЦ происходит различным образом. Деметилирование CpG4 в IL1B связано с увеличением экспрессии этого гена в ММСК человека. Учитывая
митотическое наследование профиля метилирования ДНК и физиологическую роль ФНОа и ИЛ-1р, можно предположить, что наблюдаемое различие в эпигенетическом маркере является долгосрочным отпечатком воспалительных процессов, перенесённых человеком ранее, а также маркером физиологических отличий стромы костного мозга человека. Работа поддержана грантом РФФИ № 19-29-04023.
ВЗАИМОРЕГУЛЯЦИЯ СТВОЛОВЫХ И ИММУННЫХ КЛЕТОК В ТКАНЕСПЕЦИФИЧНЫХ СТВОЛОВЫХ НИШАХ
Д.В. Карпенко, А.Е. Бигильдеев
ФГБУ НМИЦ гематологии Минздрава России, Москва, Россия
e-mail: d_@list.ru
Ключевые слова: стволовые клетки, раковые стволовые клетки, иммунные привилегии, Т-регуляторные клетки, ниша, аутоиммунитет, толерантность, покоящиеся стволовые клетки.
Эксперименты по трансплантации, которые стали возможны вследствие развития хирургии в начале ХХ века, показали существование особых иммунопривилегиро-ванных территорий, таких как мозг, глаз, плацента, семенники и хрящи. Первичные объяснения механизмов иммунных привилегий подразумевали наличие барьеров, препятствующих действию компонент иммунной системы. Более поздние работы показали не абсолютный характер таких барьеров и, более того, были продемонстрированы иммунные привилегии для индивидуальных стволовых клеток (СК) вне барьерных тканей, а именно, мышц, волосяных фолликулов (кожи), кроветворных СК костного мозга. Недавно мы подтвердили иммунные привилегии мезенхимных СК костного мозга экспериментально, отметив важность ниш для функций СК [1]. Выводы, сделанные из этого эксперимента и из научной литературы, представлены ниже.
Полученные результаты укрепляют идею о том, что иммунные привилегии — базовое свойство покоящихся стволовых клеток. Известно также, что раковые СК имеют иммунные привилегии. Поскольку, несмотря на риски иммунные привилегии, СК не были исключены естественным отбором, есть веские основания, требующее их наличия. Основанием для таких особых взаимоотношений СК и иммунной системы может служить необходимость защиты СК и их дифференцированного потомства от аутоиммунных реакций.
Основной контроль над аутоиммунными реакциями осуществляется за счет отрицательной селекции лимфоцитов. Однако с течением времени вследствие приобретения мутаций может возникнуть расхождение между основным механизмом толерантности и антигенами, представленными на клетках периферических органов и тканей, достаточное для аутоиммунных реакций, что требует более точной настройки контроля аутоиммунитета. Предполагается роль СК в этом процессе. Подтверждением могут являться работы, в которых показано, что введение мезенхимных СК приводит к повышенной толерантности к аллогенным трансплантатам. По-видимому, обе системы (СК и адаптивный иммунитет) настолько важны для организма, что их тесное взаимодействие эволюционно обусловлено. Так, например, показано участие Т-регуляторных лимфоцитов в предоставлении
иммунных привилегий СК, влияние на поддержание стволового статуса клеток и удержание их в покоящемся состоянии и влияние на активацию СК при репаративном запросе. Показано, что Т-регуляторные клетки нелимфо-идных тканей по секретому и транскриптому напоминают стволовые клетки, что позволило выделить их в отдельный класс иммунных клеток стволовых ниш.
Суммарно можно говорить о значительном взаимном влиянии иммунной системы и СК, происходящем в стволовых нишах тканей взрослого организма. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 22-25-00459.
Литература:
1. Karpenko D.V., Kapranov N.M., Bigildeev A.E., Front Cell Dev
Biol. 2022, doi: 10.3389/fcell.2022.993056.
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ САМОИНАКТИВИРУЮЩИХСЯ ЛЕНТИВИВЕКТОРОВ ТРЕТЬЕГО ПОКОЛЕНИЯ ДЛЯ АНАЛИЗА КЛОНАЛЬНОГО РАЗНООБРАЗИЯ И РАЗМЕРА КЛЕТОЧНЫХ КЛОНОВ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК НА МОДЕЛИ ОЧАГОВ ЭКТОПИЧЕСКОГО КРОВЕТВОРЕНИЯ У МЫШЕЙ
Д.В. Карпенко1, А.С. Артюхов2, А.Е. Бигильдеев1
1 ФГБУ НМИЦ гематологии Минздрава России, Москва, Россия
2 Центр высокоточного редактирования
и генетических технологий для биомедицины, РНИМУ им. Н.И. Пирогова, Москва, Россия
e-mail: d_@list.ru
Ключевые слова: лентивирусный вектор, LeGO, МСК, сайт интеграции, индекс-хоппинг, КОЕф, маркирование клеток, очаг эктопического кроветворения.
Важным аспектом применения лентивирусных векторов для генной и клеточной терапии с генетически модифицированными клетками является понимание эффективности заражения различных видов клеток, особенно стволовых, а также информация о сайтах интеграции (СИ) провирусов. Это необходимо для оценки ассоциированных рисков. С другой стороны, лентивирусные векторы применяются для индивидуального маркирования различных популяций клеток и анализа клональной динамики в них. Однако клональное устройство некоторых типов тканей млекопитающих, в частности, стромы костного мозга (КМ), до сих пор остается недостаточно изученным. Продвижение в этом направлении позволит более эффективно применять регенеративный потенциал мезенхимных стволовых клеток (МСК) для восполнения ими функций органов и тканей.
Стромальный подслой длительной культуры костного мозга декстеровского типа (ДККМ) мыши (n = 10) транс-дуцировали самоинактивирующимся лентивирусным вектором 3 поколения системы LeGO на основе HIV-1. Трансдуцированные ДККМ имплантировали под капсулу почки сингенным реципиентам. В очагах эктопического кроветворения (ОЭК), полученных спустя 42 дня, исследовали содержание колониеобразующих единиц фибро-бластных (КОЕф), эффективность маркирования ДкКм и КОЕф. СИ в ОЭК изучали с помощью NGS на Illumina MiSeq. Биоинформатической анализ проводили алгоритмом, разработанным авторами на языке Python. Картирование СИ выполняли NCBI BLAST.
Несмотря на высокую эффективность заражения ДККМ, ни одна из 309 КОЕф, полученных из 10 ОЭК, не была маркирована, по данным цифровой капельной ПЦР. ЫЭВ-анализ показал, что крупных маркированных клонов (40-100 клеток), было всего 10 из 2165 среди всех образцов. Следовательно, клетки с высоким про-лиферативным потенциалом не были эффективно заражены. Значит, регистрируемые маркированные клетки — это не стволовые стромальные клетки, которые переживают процедуру первичной имплантации. Их доля от всех стромальных клеток ОЭК оценивается в 30% (диапазон значений 5-72%). Картирование СИ показало, что они распределены по всему геному мыши, с небольшими преференциями к генам. Отмечено, что индекс-хоппинг — серьезное препятствие для анализа амплифи-цированных библиотек.
В подслое ДККМ эффективность заражения МСК заметно ниже, чем КОЕф и более дифференцированных стромальных клеток. Это может быть обусловлено совокупностью молекулярных процессов, которые определяют стволовый статус клетки. Это подразумевает, что эффективность генной терапии, основанной на подобных лентивирусных векторах, может быть ограничена и определяется, в основном, временем жизни зараженных не стволовых клеток. С другой стороны, это означает сниженную вероятность нарушения функций стволовых клеток.
РАЗРАБОТКА МОДЕЛИ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА И ЕЕ ВАЛИДАЗАЦИЯ С ПОМОЩЬЮ ПОВЕДЕНЧЕСКИХ ТЕСТОВ НА КРЫСАХ
Е.К. Карсунцева, А.Д. Воронова, С.С. Андрецова, А.В. Чадин, Г.А. Фурса, О.В. Степанова, В.П. Чехонин
ФГБУ НМИЦ ПН им. В.П. Сербского Минздрава России, Москва, Россия
e-mail: katya.karsunceva@gmail.com
Ключевые слова: моделирование болезни Альцгеймера, бета-амилоид, тесты открытого поля, тест на пассивное избегание, водный лабиринт Морриса.
Болезнь Альцгеймера (БА) на сегодняшний день является тяжелейшим нейродегенеративным заболеванием, характеризующимся прогрессирующей потерей памяти и дезориентацией в пространстве [1]. БА затрагивает население старше 65 лет, и после диагностирования заболевания средняя продолжительность жизни пациентов составляет всего 7 лет. Существующие подходы к лечению способствуют лишь замедлению нейродегенерации, однако не приводят к выздоровлению пациентов. Таким образом, поиск эффективной терапии БА остается важнейшей задачей нейробиологии. Для оценки различных стратегий лечения необходимы экспериментальные и доклинические исследования, в которых большая роль отводится изучению поведенческих реакций у лабораторных животных. На данный момент существует множество протоколов для моделирования болезни Альцгеймера, однако все они имеют свои недостатки [2]. Таким образом, целью данного исследования было разработать оптимальную модель болезнни Альцгеймера на крысах и провести ее валидиза-цию с помощью поведенческих тестов.
В исследовании были использованы самцы (n=16) и самки (n=16) линии Вистар в возрасте 6 месяцев. Синтетический бета-амилоид (2,5 нмоль) вводили по 5 мкл в оба полушария в область гиппокампа. Для
