CC BY-ND
22
42
ЗНиСО
март №3 (264)
штаммов для производства лечебных бактериофагов. Чувствительность бактерий к антибиотикам и бактериофагам коррелирует с некоторыми показателями функциональной активности микрофлоры кишечника и может характеризовать состояние микробиоценоза кишечника [3]. С учетом того, что литическая активность бактериофагов зависит от индивидуального микробиоценоза и изменения фенотипических и эпигенетических свойств отдельных микроорганизмов, необходим постоянный мониторинг чувствительности бактерий различных биотопов к существующим фаговым препаратам.
ЛИТЕРАТУРА
1. Алешкин В.А. и др. Бактериофаги в России: прошлое, настоящее и будущее. //Материалы международной научно-практической конференции «Бактериофаги: Теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности». / В.А. Алешкин, А.В. Алешкин, С.С. Афонасьев. Ульяновск, 23—25 апреля 2013. Т. I. С. 139—144.
2. Бочков И.А. и др. Влияние лечебных фагов на условно-патогенную и симбионтную микрофлору толстой кишки / И.А. Бочков, Э.С. Лавренов, Л.П. Юрко //Эпидемиология и инфекционные болезни. 2009. № 2. С. 48—51.
Затевалов А.М. и др. Влияние бактериофагов на микрофлору толстой кишки. / А.М. Затевалов, И.А. Киселева, Ю.А. Ко-панев. //Материалы международной научно-практической конференции «Бактериофаги: Теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности». Ульяновск, 2013. Т. II. С. 9—14. Зуева Л.П. и др. Современный взгляд на роль бактериофагов в эволюции госпитальных штаммов и профилактике и нфекций, связанных с оказанием медицинской помощи / Л.П. Зуева, Б.И. Асланов, В.Г. Акимкин //Микробиология. 2014. № 3. С. 100—107.
Катаева Л.В. и др. Оценка литической активности некоторых бактериофагов. / Л.В. Катаева, А.А. Вакарина, Н.Ф. Нижего-родцева. //Материалы международной научно-практической конференции «Бактериофаги: Теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности». Ульяновск, 2013 г. Т. II. С. 17—22.
Контактная информация:
Катаева Любовь Владимировна, тел.: 8 (909) 40-50-74,
e-mail: [email protected]
Contact information: Kataeva Lubov, phone: 8 (909) 40-50-74, e-mail: [email protected]
УДК 616-079
РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ И ПОДХОДОВ ОБНАРУЖЕНИЯ ВИРУСОВ ГЕПАТИТА А И С НА ПОВЕРХНОСТЯХ ДЛЯ ДАЛЬНЕЙШЕГО ИССЛЕДОВАНИЯ ВНУТРИБОЛЬНИЧНОЙ КОНТАМИНАЦИИ
С.А. Эспер1, Т.В. Гребенникова1-2, М.Г. Исагулянц2, К.К. Кюрегян3, А.М. Ходорович1 'ГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов», г. Москва, Россия 2ФГБУ «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, г. Москва, Россия 3ФГБУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П. Чумакова», г. Москва, Россия
Исследовалась разработка чувствительных методов детекции вирусов гепатита А и С, возможность сохранения вирусов в течение определенного промежутка времени и их использования в качестве биомаркеров внутрибольничной контаминации. Также были проведены исследования различных поверхностей больничных помещений на присутствие РНК вирусов гепатита А и С.
Ключевые слова: гепатит А, гепатит С, гнездовая ПЦР, внутрибольничная контаминация.
S.A. Esper, T.V. Grebennikova, M.G. Isaguliants, K.K. Kyuregyan, A.M. Hodorovich □ DEVELOPMENT METHODS AND APPROACHES FOR DETECTION OF HEPATITIS A AND C VIRUSES ON THE SURFACES FOR FURTHER INTRAHOSPITAL CONTAMINATION STUDY □ SBEI HPE «The Peoples' Friendship University of Russia» Moscow, Russia; FSBE «Federal Scientific Research Centre of Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamaleya» of Russian Ministry of Healthcare, Moscow, Russia; FSBE «Institute of Poliomyelitis and Viruses Encephalitis named after M.P. Chumakov», Moscow, Russia.
Development of sensitive methods for detection of Hepatitis A and C viruses, and investigation for how long the viruses can be stored on the surface, in order to use them as biomarkers for intrahospital contamination levels, were performed in current study. Additionally, different surfaces from medical clinic was scanned for hepatitis A and C contamination. Key words: Hepatitis A, Hepatitis C, nested PCR, intrahospital contamination.
Мониторинг вирусов в окружающей среде и разработка чувствительных методов для их выявления — один из способов предотвращения распростронения вирусной инфекции и контроля распространения заболевания [1, 2, 3]. Исследования, проведенные ранее, показали, что многие вирусы остаются инфекционными вне организма длительный период времени, они могут оставаться на поверхностях после выхода из инфицированных индивидуумов (человека или животных) [1, 3, 4]. Мониторинг вирусов в окружающей среде, в том числе на поверхностях, имеет большое значения для оценки степени контаминации окружающей
г-Ь
среды и профилактики распространения заболевания от инфицированных индивидуумов к здоровым [5, 6]. Детекция вирусов на поверхностях имеет определенные сложности, требуются специальные разработанные чувствительные подходы и методы для выявления и детекции вирусов. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и полимеразная цепная реакция в реальном времени (ЛРСЯ) широко применяются для быстрого и чувствительного обнаружения вирусов гепатита [1]. В работе были исследованы молекулярные методы детекции вирусов гепатита А и С, которые широко распространены в мире, и их исследования является
март №3 (264)
43
Таблица 1. Последовательность праймеров и условия проведения гнездовой ПЦР
Вирус гепатита С (участок 5'иТЯ)
Последовательность Положение Направление Положение в геноме Протокол
5' — ^ tga gga ай ай gtc И — 3' Внешний Прямой 45—64 Первая стадия: 1 цикл (50 °С — 50 мин, 95 °С - 5 мин), 30 циклов (95°С - 30 с, 55 °С - 30 с, 72 °С - 30 с. Вторая стадия: 1 цикл (95°С - 1 мин, 55 °С - 30 с, 72 °С - 5 мин)
5' — tat cag gca gta сса саа gg — 3' Внешний Обратный 298—275
5' — йс acg cag ааа gcg tct ag —3' Внутренний Прямой 63—82
5' — атс caa cac tac tcg gct ag — 3' Внутренний Обратный 250—269
Вирус гепатита А (участок УР1/2А)
Последовательность Положение Направление Положение в геноме Протокол
5'— ай cag аИ aga ^ cct tgg 1а —3' Внешний Прямой 2 799—2 821 Первая стадия: 1 цикл (50 °С - 50 мин, 95 °С - 5 мин), 30 циклов. Вторая стадия: (95 °С - 30 с, 55 °С -30 с, 72 °С - 30 с), 1 цикл (95 °С - 1 мин, 55 °С - 30 с, 72 °С - 5 мин)
5'— agt ааа aac tcc agc atc cat ttc —3' Внешний Обратный 3 352—3 375
5' — ggt ttc tat tca gat tgc ааа Ма —3' Внутренний Прямой 2 891—2 914
5' — cat tat ttc atg ^ ^ ag —3' Внутренний Обратный 3 246—3 265
актуальным для России [1—4]. Особый интерес представляла экспериментальная проверка возможности сохранения вирусов на поверхностях в течение определенного промежутка времени, чтобы выяснить, являются ли они стабильными и могут ли быть использованы в качестве маркера при мониторинге контаминации и для обнаружения степени безопасности окружающей среды.
Материалы и методы. Тест-системы и наборы праймеров: Для определения вирусов гепатита А и С были использованы тест-системы: «АмплиСенс® НАУ-БЬ» и «АмплиСенс® НСУ-БЬ», для гнездовой ПЦР использованы праймеры, разработанные в лаборатории (табл. 1).
Выделение РНК проводили с использованием неорганического сорбента (БЮ2). К 200 мкл Ь образца добавляли 600 мкл Ь лизирующего буфера (6М гуанидинтиоцианат, 0,1М Трис-НСЬ, рН 6,4, 0,1 % тритон Х-100) и добавляли 20 мкл Ь неорганического сорбента, тщательно перемешивали и снова инкубировали 10 мин при комнатной температуре в шейкере. Затем центрифугировали 30 с при 13 000 и удаляли надосадочную жидкость. Осадок сорбента дважды промывали 200 мкл Ь промывочного буфера (6М гуанидинтиоцианат, 0,1М Трис-НСЬ, рН 6,4) и 2 раза — 70 %-м этанолом. Затем осадок подсушивали в течение 10 мин при 56 °С и элюировали РНК с поверхности сорбента в 30 мкл Ь воды, обработанной диэтилпирокарбо-натом для удаления РНК-аз.
Во время гнездовой ПЦР обратная транскрипция проводилась совместно с амплификацией, в одной пробирке. Реакция проводилась в конечном объеме 25 мкл. Реакционная смесь содержала 5 мкл РНК, 2,5 мкл 10-кратного ТАЕ-буфера, 0,25 мМ MgCl2, 0,25 мМ каждого dNTP, по 10 рто1 каждого прай-мера, 0,5 мкл ЯНавт, 0,25 ед. Taq-полимеразы, 50 ед. ММЬУ-ревертазы. Последовательности праймеров и условия амплификации указаны в табл. 1. Соотношение циклов «амплификация : ре-амплификация» составило 30: 30.
Положительный контроль вируса гепатита А: культуральный вирус, генотип 1А, разведен в инак-тивированной сыворотке крупного рогатого скота, концентрация — 105 копий РНК/мл. Положительный контроль вируса гепатита С: сыворотка крови от пациентов с хроническим гепатитом С, концентрация — 107 копий РНК/мл.
Результаты и обсуждение. Нами было проведено сравнение наборов ПЦР детекции гепатита А и С. РНК вирусов гепатита А и С была выделена из образцов положительного контроля, затем были приготовлены несколько десятикратных разведений: от 105 до 10-1 копий РНК/мл вируса гепатита А и от 107 до 101 копий РНК/мл вируса гепатита С. Приготовленные разведения РНК были проверены разными наборами: РНК гепатита А была детектирована наборами «АмплиСенс® НАУ-БЬ» на основе ПЦР в реальном времени и гнездовой ПЦР с использованием праймеров, разработанных в лаборатории (табл. 1). Сравнение чувствительности выявления гепатита С было проведено с использованием тест-системы «АмплиСенс® НСУ-БЬ» и гнездовой ПЦР (табл. 1). Результаты сравнения чувствительности различных систем ПЦР представлены в (табл. 2 и 3).
Мы обнаружили, что чувствительность наборов «АмплиСенс® НАУ-БЬ» и гнездовой ПЦР одинакова и составляет 1-10 копий РНК/мл. Значит, для обнаружения РНК гепатита А могут быть использованы как «АмплиСенс® НАУ-БЬ», так и гнездовая ПЦР. Результаты сравнения тест-системы «АмплиСенс® НСУ-БЬ» и гнездовой ПЦР продемонстрированы в (табл. 3).
Используя метод гнездовой ПЦР, возможно определить 10 копий РНК/мл, тогда как «АмплиСенс® НСУ-БЬ» детектирует только 103 копий РНК/мл. Следовательно, при обнаружении РНК вируса гепатита С гнездовая ПЦР более чувствительна, чем тест-система «АмплиСенс® НСУ-БЬ».
Оценка стабильности гепатита А и С на поверхностях была проведена методом разведения положительных контролей, от 105 до 102 копий РНК/мл для гепатита А и от 107 до 104 — для гепатита С. Разное количество вируса было нанесено на поверхности, образцы отобрали спустя 8, 12, 24, 32, 48 и 56 ч, затем РНК была выделена и проанализирована методом ПЦР.
Выяснили, что РНК гепатита А в концентрации 105 копий РНК/мл можно выявить спустя 56 часов после нанесения на поверхность, в концентрации 104 — спустя 24 ч, в концентрации 103 — через 12 ч. РНК вируса гепатита С в концентрации 107 копий РНК/мл определили спустя 32 ч после нанесения на поверхность, в концентрации 106 — спустя 24 ч, в концентрации 105 — через 8 ч. Результаты оценки
44
ЗНиСО
март №3 (264)
Таблица 2. Результаты сравнения тест-систем «АмплиСенс® HАV-FL» и гнездовой ПЦР для обнаружения РНК вируса гепатита А
Разведение РНК HAV 105 104 103 102 101 10 10-1
АмплиСенс@НА^Ь + + + + + + +
Гнездовая PCR + + + + + + +
Таблица 3. Результаты сравнения тест системы «АмплиСенс® HCV-FL» и гнездовой ПЦР для обнаружения РНК вируса гепатита С
Разведение РНК HCV 107 106 105 104 103 102 101
АмплиСенс@ HCV-Eph + + + + +
Гнездовой PCR + + + + + + +
Таблица 4. Выявление РНК вируса гепатита А и С на поверхностях в зависимости от разведения
и времени экспонирования
ц
Время после нанесения на поверхность (час) HAV копий РНК/ мл HCV копий РНК/ мл
105 104 103 102 107 106 105 104
8 + + + + + +
12 + + + + +
24 + + + +
32 + +
48 +
56 +
стабильности вирусов гепатита А и С показаны в табл. 4.
Обобщая вышеизложенное, мы сделали вывод, что вирусы гепатита А и С могут оставаться стабильными на поверхностях в течение нескольких суток, поэтому их можно использовать как биомаркеры для оценки контаминации окружающей среды, в частности внутрикомнатной контаминации.
Для изучения внутрибольничной контаминации было собрано 60 проб с разных поверхностей в различных кабинетах одной из клиник г. Москвы (в стоматологическом, терапевтическом, процедурном кабинетах, в инфекционном отделении и лаборатории, в туалете и коридорах). Все образцы были проанализированы на РНК вирусов гепатита А и С, и ни в одном из них не был обнаружен РНК гепатита А или С.
Мы рассмотрели наиболее чувствительные методики детекции вирусов гепатита А и С. Так, для детекции РНК гепатита А можно применять «АмплиСенс® НАУ^Ь» и метод гнездовой ПЦР. Для детекции РНК гепатита С рекомендуется метод гнездовой ПЦР. Вирусы гепатита А и С были обнаружены, в зависимости от концентрации, в течение 12—56 ч после аппликации на поверхности, что указывает на стабильность вирусов на поверхностях и возможность их использования в качестве биомаркеров контаминации окружающий среды. Была разработана методика обнаружения генома вирусов гепатита А и С на поверхностях для оценки внутрибольничной и внутрикомнатной контаминаций. Уровень санитарии в исследуемой
больнице определен как «хороший», что доказывает
эффективность применяемых там дезинфекционных
средств и протоколов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Попова А.Ю. Вопросы управления и социальной гигиены стратегические приоритеты российской федерации в области экологии с позиции сохранения здоровья нации //Здоровье населения и среда обитания. 2014. № 2.(251). С. 4—7.
2. Бутаев Т.М. и др. Эпидемиологические особенности вирусного гепатита А на современном этапе в республике Северная Осетия — Алания. / Т.М. Бутаев, Г.К. Гадзиева, Н.И. Отараева [и др.]. //Здоровье населения и среда обитания. 2014. № 2.(251). С. 34-36.
3. Ергина М.Н. и др. Эпидемиологическая и клинико-лабораторная характеристика хронического вирусного гепатита С в Иркутской области. / М.Н. Ергина, К.А. Аитов, А.Ю. Чащин [и др.] //Здоровье населения и среда обитания. 2012. № 1 (226). С. 27—30.
4. Солодовников Ю.П. и др. Эпидемиологические особенности вирусного гепатита А в мегаполисе. / Ю.П. Солодовников, И.Н. Лыткина, Б.Е. Зайцев [и др.] //Вакцинация. 2001. № 4 (16). С. 4—5.
5. Крамарь О.Г. и др. Внутрибольничные инфекции. / О.Г. Кра-марь, Т.Н. Савченко [и др.]. //Вестник волгоградского государственного медицинского университета. 2010. № 2 (34). С. 3—7.
6. Carducci A. atal. Environmental survey to assess viral contamination of air and surfaces in hospital settings.//Journal of Hospital Infection. 2011. № 77. P. 242—247.
Контактная информация:
Эспер Сузан Аднановна, тел.: 8 (925) 186-15-33, e-mail: [email protected]
Contact information: Esper Suzan,
рhone: 8 (925) 186-15-33, e-mail: [email protected]
