CC BY
15УДК 615.32:582.736 https://doi.org/10.29296/25877313-2020-06-04
© Коллектив авторов, 2020
РАЗРАБОТКА МЕТОДИК ИДЕНТИФИКАЦИИ И КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЛАВОНОИДОВ В ТРАВЕ ЧИНЫ КЛУБНЕНОСНОЙ (LATHYRUS TUBEROSUS L.)
Р.А. Бубенчиков
д.фарм.н., доцент,
кафедра фармакогнозии и ботаники, Курский государственный медицинский университет E-mail: bubenhikova.ksmu@yandex.ru О.Н. Кулик аспирант,
кафедра фармакогнозии и ботаники, Курский государственный медицинский университет E-mail: bubenhikova.ksmu@yandex.ru К.Р. Бубенчикова студентка,
Курский государственный медицинский университет E-mail: bubenhikova.ksmu@yandex.ru
Актуальность. Чина клубненосная (Lathyrus tuberosus L.) применяется в народной медицине как вяжущее средство, однако до настоящего времени не установлены действующие вещества этого растения и не проведена его стандартизация. Цель работы. Разработка методик идентификации и количественного определения флавоноидов в траве чины клубненосной. Материалы и методы. Объект исследования - трава чины клубненосной, заготовленная в 2018-2019 гг. В основу метода качественной идентификации флавоноидов положена тонкослойная хроматография, количественное определение флавоноидов осуществляли спектрофотометрическим методом.
Результаты. Для качественной идентификации использованы пластинки Sorbfil на алюминиевой подложке, объем нанесения извлечения - 10 мкл, подвижная фаза: бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:2), стандартное вещество - рутин, цинарозид; детектирование выполняли 5%-ным раствором хлористого алюминия. Проведена валидация методики. Для количественного определения флавоноидов разработана спектрофотометрическая методика определения в пересчете на рутин. Установлены оптимальные условия экстрагирования.
Выводы. Разработаны методики качественной идентификации и количественного определения флавоноидов в траве чины клубненосной. Содержание флавоноидов представлено от 1,88±0,07% до 2,40±0,04%.
Ключевые слова: чина клубненосная, бобовые, флавоноиды, стандартизация, хроматография, спектрофотометрия.
Для цитирования: Бубенчиков Р.А., Кулик О.Н., Бубенчикова К.Р. Разработка методик идентификации и количественного определения флавоноидов в траве чины клубненосной (Lathyrus tuberosus L.). Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2020;23(6):22-27. https://doi.org/10.29296/25877313-2020-06-04
Чина клубненосная (Ьа^угш tuberosus Ь.) относится к семейству бобовые (БаЬаееае Ь), которое включает в себя более 100 видов растений, относящихся к роду чина (ЬаШуг^ Ь). На территории черноземной полосы России произрастают чина лесная, чина луговая, чина гороховидная, чина клубненосная, душистый горошек и др. [1].
Чина клубненосная (в народе ее еще называют земляным орешком или чиной розовой) относится к многолетникам, достигающим в длину 30-100 см. Стебли ребристые, четырехгранные, простертые. Листочки продолговато-эллиптические, однопарные, зеленого цвета с усиками. Соцветие - рыхлая кисть, состоящая из 3-8 небольших цветков, длиной до 2 см ярко-розового цвета.
Плод - боб продолговато-линейной формы, голый. Чина клубненосная начинает цвести с июня по октябрь, а плодоносить - с июля [1, 2]. Растение распространено на Кавказе, в Малой и Средней Азии, Сибири. В России встречается во всех южных областях Средней России, на черноземной почве. Произрастает в посевах зерновых, вдоль дорог, по лугам, полянам, опушкам, на сорных местах [2].
В народной медицине используют отвар корней, обладающий вяжущим действием (при дизентерии, колитах и т.д.). Свежие молодые листья добавляют в салат [3]. В траве чины клубненосной выявлено наличие дубильных веществ, тритерпе-новых соединений, полисахаридов, флавоноидов [4-6]. До настоящего времени не установлены
действующие вещества чины клубненосной и не проведена стандартизация этого растения.
Цель исследования - разработка методик идентификации и количественного определения флавоноидов травы чины клубненосной, как одной из групп биологических активных веществ.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Объект исследования - измельченная трава чины клубненосной. Сырье заготавливали в период массового цветения в 2018-2019 гг. в Курской области (Мантуровский район). Заготовку осуществляли при благоприятной погоде, срезанное сырье помещали в тряпичные мешки и доставляли к месту сушки. Сырье чины клубненосной измельчали раскладывали тонким слоем и сушили на воздухе в тени, затем просеивали (сито с ячейкой 1 мм), выделяли среднюю пробу [6, 7].
Структура фармакопейной статьи предусматривает раздел «Определение подлинности биологически активных веществ», в котором приводятся качественные реакции и исследование действующих веществ с помощью методов хроматографии. Для хроматографического исследования травы чины клубненосной использовали метод тонкослойной хроматографии. Разработку метода идентификации травы чины клубненосной проводили по флавоноидным соединениям - одной из групп биологически активных веществ. Методику идентификации флавоноидов разрабатывали по следующим направлениям: определение способа экстрагирования; выбор стандартных веществ; установление хроматографических пластинок; определение системы растворителей; установление алик-воты извлечения для нанесения на хроматографи-ческую пластинку; выбор проявляющего реактива.
Для установления способа экстрагирования применяли методы, наиболее часто используемые в ГФ XIV издания [8]. Далее проводили экстракцию из измельченного сырья четырьмя способами.
Способ 1 - к 1,0 г сырья добавляли 100 мл 70%-ного этилового спирта и нагревали при кипении на водяной бане с обратным холодильником в течение 60 мин.
Способ 2 - к 1,0 г сырья добавляли 10 мл 96%-ного этилового спирта и нагревали при кипении на водяной бане с обратным холодильником в течение 10 мин.
Способ 3 - к 1,0 г сырья добавляли 10 мл 70%-ного этилового спирта и нагревали при кипе-
нии на водяной бане с обратным холодильником в течение 10 мин.
Способ 4 - к 1,0 г сырья добавляли 10 мл 50%-ного этилового спирта, помещали на водяную баню, далее присоединяли к обратному холодильнику, время экстракции - 10 мин.
Полученные извлечения охлаждали до температуры окружающей среды, очищали при помощи фильтрования.
Стандартные вещества устанавливали на основе изучения литературных данных; в качестве веществ-свидетелей были выбраны фармакопейные стандартные образцы (ФСО) - рутина (Sigma-Aldrich), цинарозида (фирма «Фитопанацея»), кверцетина (USP reference standard). Для хромато-графирования использовали пластинки со слоем силикагеля «Sorbfil ПТСХ-АФ-А-УФ 10x20» на различных основах и различных серий: алюминиевой и полимерной (полиэтилентерефталат). В качестве подвижной фазы использовались системы растворителей: бутанол - уксусная кислота - вода (4:1:2), этилацетат - бутанол-муравьиная кислота - вода (30:10:5:5), этилацетат - метанол - вода (77:12:11), этилацетат - муравьиная кислота - вода (65:15:20). Подвижная фаза проходила расстояние 7-8 см. На хроматографическую пластинку нанесение стандартных растворов и исследуемых извлечений проводили с помощью микрошприца в объемах для исследуемых извлечений - 10, 20, 30, 50 мкл и стандартных растворов - 10 мкл. Затем пластину помещали в хроматографическую камеру. Сухую пластинку, просматривали в УФ-свете, в дальнейшем обрабатывали 5%-ным раствором алюминия хлорида, высушивали (0,5 ч) и просматривали в ультрафиолетовом свете (длина волны 365 нм), отмечая появление характерных пятен и их цвет.
Разработанная методика количественного определения включала в себя: установление наиболее оптимальных условий экстракции фла-воноидных соединений, максимума поглощения комплекса флавоноидов с алюминия хлоридом и изучение условий спектрофотометрирования данного комплекса.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Извлечение, полученное Способом 2 экстракции, имеет лучшее разделение зон флавоноидов, поэтому был выбран этот способ экстрагирования как более эффективный, требующий меньше усилий и содержащий меньше сопутствующих веществ.
Исследование систем растворителей показало, что бутанол - уксусная кислота (4:1:2) дает лучшее разделение флавоноидных соединений, что и было использовано в дальнейшем. Для исследования использованы хроматографические пластинки со слоем силикагеля «Sorbfil ПТСХ-АФ-А-УФ 10x20» на алюминиевой основе.
На хроматографическую пластинку наносили аликвоты исследуемых растворов по 10, 20, 30 и 50 мкл. В ходе эксперимента выявлено, что оптимальный объем для нанесения на хроматографическую пластинку - 10 мкл. Данный объем извлечения позволяет получить воспроизводимые и репрезентативные хроматограммы.
Для проявления зон флавоноидов выбран 5%-ный раствор алюминия хлорида в спирте этиловом 70%-ном, поскольку в результате химической реакции образуются соединения, имеющие желто-зеленую флуоресценцию в УФ-свете.
Для идентификации флавоноидов сырья чины клубненосной использованы стандартные образцы флавоноидных соединений, содержащиеся в траве чины клубненосной: СО рутина, СО цинарозида, СО кверцетина. На хроматограмме выявлены четыре основные характерные зоны, две из которых по флуоресценции и окрашиванию зон соответствовали рутину и цинарозиду.
Валидацию разработанной методики идентификации флавоноидов проводили по показателям: робастность, специфичность, воспроизводимость [9].
Робастность изучали по влиянию насыщенности хроматографической камеры на разделение флавоноидных соединений. Хроматографическую пластинку после нанесения аликвот исследуемого извлечения из различных серий помещали в камеру различной степени насыщенности, время насыщения - 30 и 60 мин, и хроматограммы сравнивали. В результате установили, что в насыщенной камере наблюдается более четкое разделение, а время насыщения не имеет значения.
Изучение специфичности проводили, сравнивая хроматографический профиль стандартных образцов с зонами испытуемых растворов. Установлено, что стандартные образцы подходят и могут быть использованы для стандартизации сырья чины клубненосной, так как расположение их зон позволяет объективно описывать положение зон флавоноидных веществ относительно веществ-маркеров.
Воспроизводимость данной методики изучалась путем сравнения хроматограмм, полученных
на различных пластинках, в разные дни и проведенные разными аналитиками. Проведенные исследования показали, что полученные хромато-графические профили близки по интенсивности окраски, размеру, расположению зон. Идентичные хроматограммы получены в разные дни и разными экспертами.
В процессе исследований сырья чины клубненосной разработана методика, позволяющая идентифицировать сырье по характерному хрома-тографическому профилю.
Методика идентификации сырья. 1,0 г сырья (сито с ячейкой 1 мм) помещают в термостойкую колбу с притертым горлышком, к нему добавляют спирт этиловый в объеме 10 мл, колбу со смесью присоединяют к обратному холодильнику и нагревают 10 мин, пропускают через марлю, затем через бумажный фильтр до получения прозрачного раствора. В качестве раствора сравнения используют 2,5 мг стандартных веществ (рутина, кверцетина, цинарозида) в 10 мл спирта этилового. Полученное извлечение наносят на хроматографи-ческую пластинку на подложке из алюминия со слоем силикагеля «Sorbfil ПТСХ-АФ-А-УФ 10x20». Объем наносимых аликвот составляет 10 мкл (стандартные растворы и исследуемые извлечения). Пластину помещают в предварительно насыщенную хроматографическую камеру с подвижной фазой бутанол - уксусная кислота - вода (4:1:2), после прохождения подвижной фазы пластинку высушивают на воздухе (20-30 мин). При помощи пульверизатора обрабатывают 5%-ным раствором хлористого алюминия и после окончательного высыхания просматривают в УФ-свете при длине волны 365 нм. На исследуемой хрома-тограмме можно наблюдать четыре зоны желтого цвета, две из которых соответствуют цинарозиду и рутину.
Методика количественного определения флавоноидов. Прежде всего определяют максимум поглощения извлечения из травы чины клубненосной с алюминия хлоридом. В качестве экс-трагента используют 70%-ный спирт этиловый, соответствующий длине волны 410 нм и равный максимуму поглощения СО рутина с алюминия хлоридом. Следовательно, длина волны 410 нм может быть применена для спектрофотометриче-ского определения флавоноидов в надземной части чины клубненосной в пересчете на рутин (удельный показатель - 260). Далее устанавливают оптимальные условия экстрагирования.
В процессе эксперимента изучены: степень дисперсности сырья, природа и концентрация экс-трагента, время экстрагирования. Первоначально сырье чины клубненосной с влажностью 13% бы-
Установлено, что наиболее подходящим экс-трагентом является 70%-ный спирт этиловый, при его использовании наблюдается высокий уровень извлечения флавоноидных соединений, который составляет 2,40±0,04%. Экстрагент более высокой концентрации (96%-ный спирт этиловый) не обеспечил хорошей полноты извлечения флавоноидов из сырья чины клубненосной, поэтому наблюдали низкое содержание флавоноидов 1,20±0,04%. Исходя из полученных результатов, в качестве экс-трагента флавоноидов выбран спирт этиловый 70%-ный. Экстрагирование биологически активных веществ проводили в течение 30, 45, 60, 75 мин. Показано, что оптимальным временем экстрагирования является 60 мин, содержание флавоноидов составляет 2,33±0,07% (табл. 1). При увеличении времени экстракции не наблюдается повышения концентрации фенольных соединений, но имеет место накопление балластных веществ в извлечении.
Следующий этап по разработке методики основывался на изучении полученных комплексов флавоноидов с алюминия хлоридом различной концентрации (табл. 2).
ло измельчено (1, 2 и 3 мм). В итоге наибольший выход флавоноидов из травы чины клубненосной отмечается при измельчении 1 мм и составляет 2,40±0,03% (табл. 1).
Таблица 2. Условия спектрофотометрирования комплексов флавоноидов
из травы чины клубненосной с алюминия хлоридом
Концентрация и объем алюминия хлорида для реакции комплексообразования Сумма флавоноидов в пересчете на абсолютно сухое сырье и рутин, %
Концентрация раствора алюминия хлорида, %:
1 2,28±0,04
2 2,23±0,06
3 2,26±0,05
4 2,34±0,07
5 2,32±0,05
Объем раствора алюминия хлорида 5%, мл:
1 2,32±0,05
2 2,35±0,08
3 2,28±0,07
4 2,31±0,06
5 2,29±0,06
Таблица 1. Условия экстракции флавоноидов из травы чины клубненосной
Параметры экстрагирования Сумма флавоноидов в пересчете на абсолютно сухое сырье и рутин, %
Измельченность сырья, мм:
1 2,40±0,03
2 2,25±0,07
3 2,13±0,04
Используемый экстрагент:
Вода очищенная 1,71±0,07
30%-ный спирт этиловый 1,83±0,06
50%-ный спирт этиловый 1,98±0,05
70%-ный спирт этиловый 2,40±0,04
96%-ный спирт этиловый 1,20±0,04
Время экстрагирования, мин (соотношение: сырье - экстрагент - (1:100), экстрагент - спирт этиловый 70%о-ный):
30 2,19±0,05
45 2,23±0,06
60 2,33±0,05
75 2,23±0,07
В ходе эксперимента установлены условия спектрофотометрирования: наиболее приемлемая концентрация алюминия хлорида составляет 4% в объеме 2 мл. Полученные данные дают возможность разработать методику спектрофотометриче-ского определения суммы флавоноидов в траве чины клубненосной:
Методика спектрофотометрического определения суммы флавоноидов. Точную навеску (около 1,0 г) измельченного сырья размером 1 мм и влажностью 13% засыпают колбу вместимостью 250 мл, заливают 100 мл спирта этилового в кон-цетрации 70% и взвешивают, используя для этого тарирные весы (±0,01). Взвешенную колбу со смесью помещают на кипящую водяную баню и герметично соединяют с обратным холодильником во избежание потерь спирта. По истечении 60 мин колбу с содержимым снимают с водяной бани, охлаждают на воздухе, вытирают насухо бумажными полотенцами и взвешивают. При изменении массы смеси доводят ее до исходной тем же растворителем, добавляя его по каплям при помощи мерной пипетки. Извлечение фильтруют до прозрачного раствора (раствор А). Далее 2 мл раствора А добавляют в мерную колбу вместимостью
25 мл, добавляют 2 мл раствора хлористого алюминия 4%-ного и раствор кислоты уксусной 3%-ный в объеме 1 мл. Затем спиртом 70%-ным доводят до метки, закрывают плотно стеклянным колпачком и через 30 мин (раствор Б), измеряют при длине волны 410 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.
Раствор сравнения состоит из 2 мл раствора А, 1 мл раствора кислоты уксусной 3%-ной и спирта этилового 70%-ного. По формуле рассчитывают содержание суммы флавоноидных соединений в пересчете на рутин (%):
D-100•25-100
= 1% , А— • а • 2 • (100 - W ) 1 см
где D - оптическая плотность исследуемого извлечения (раствора Б); - удельный показа-
1 см
тель поглощения рутина с алюминия хлоридом в спирте этиловом 70%-ном при длине волны 410 нм, равный 260; а - масса навески сырья, г; W-влажность сырья, %.
Метрологическая характеристика методики спектрофотометрического определения флавонои-дов представлена в табл. 3.
Таблица 3. Метрологическая характеристика методики спектрофотометрического определения флавоноидов в траве чины клубненосной
N f X 52 S Р, % X е, %
5 4 2,40 0,00025 0,01581 95 0,04 1,67
5 4 1,88 0,00093 0,0305 95 0,07 3,72
Примечание : N - объем выборки; / - число степеней свободы; X - среднее арифметическое; 52 - дисперсия; S -стандартное отклонение; р - доверительная вероятность; X - вычисленные значения переменных; е - относительная ошибка.
Содержание флавоноидов в траве чины клубненосной имеет интервал 1,88%±0,07% до 2,40±0,04%, ошибка единичного определения с вероятностью 95% не превышает 3,72%.
ВЫВОДЫ
1. Разработана методика идентификации флаво-ноидов в траве чины клубненосной с использованием метода тонкослойной хроматографии; в качестве стандартных веществ выбраны рутин и цинарозид.
2. Разработана методика спектрофотометричес-кого определения флавоноидов в траве чины клубненосной в пересчете на рутин.
3. Определены приемлемые условия проведения экстракции флавоноидов из сырья: размер частиц - 1 мм, время извлечения - 60 мин, экстрагент - 70%-ный спирт этиловый.
ЛИТЕРАТУРА
1. Губанов И.А., Киселева К.В., Новиков В.С., Тихомиров В.Н. Иллюстрированный определитель растений Средней России. М. : Товарищество научных изданий КМК, Институт технологических исследований. 2004; 2:439-447.
2. Маевский П.Ф. Флора средней полосы европейской части России. Изд. 11-е. М.: Товарищество научных изданий КМК. 2014. С. 157-159.
3. Махлаюк В.П. Лекарственные растения в народной медицине. Саратов, 1991. 544 с.
4. Бубенчикова, В.Н., Кулик О.Н. Исследование дубильных веществ чины клубненосной (Lathyrus tuberosus L.) XXVI
Российский национальный конгресс «Человек и лекарство», 2019. 101 с.
5. Бубенчикова, В.Н. Изучение тритерпеновых соединений травы тимьяна Маршалла. Всеросс. науч.-практ. конф. с междунар. участием «Традиции и инновации фармацевтической науки и практики». Курск, 2011. С. 207-309.
6. Зайчикова, С.Г. Изучение липидного и флавоноидного состава образцов некоторых видов рода чины (¿а/йутго)./ Химико-фармацевтический журнал. 2001; 5:36-38.
7. Государственная Фармакопея Российской Федерации XIV изд. Т. 4. «Лекарственное растительное сырье». М.: ФЭМБ.
8. Государственная фармакопея Российской Федерации. МЗ РФ. XIII изд. Т.2. М.: ФЭМБ, 2015. 1040 с.
9. Руководство ICH «Валидация аналитических методик. Содержание и методология» Q2(R1). Фармация. 2008; 4:3-10.
Поступила после доработки 17 марта 2020 г.
DEVELOPMENT OF THE METHODS OF IDENTIFICATION
AND QUANTITATIVE DETERMINATION OF FLAVONOIDS
IN THE HERB OF THE GROUNDNUT PEAVINE (LATYRUS TUBEROSUS L.)
© Authors, 2020 R.A.h Bubenchikov
Dr.Sc. (Pharm.), Associate Professor, Department of Pharmacognosy and Botany, Kursk State Medical University E-mail: bubenhikova.ksmu@yandex.ru O.N. Kulik
Post-graduate Student, Department of Pharmacognosy and Botany, Kursk State Medical University
E-mail: bubenhikova.ksmu@yandex.ru
K.R. Bubenchikova
Student, Kursk State Medical University
E-mail: bubenhikova.ksmu@yandex.ru
Relevance. The article is devoted to the standardization of the raw material of the groundnut peavine to the legume family (Fabace-ae). The groundnut peavine (Lathyrus tuberosus L.) is a perennial herbaceous plant that grows widely in the chernozem zone of Russia.
Objective. The aim of the work was the development of methods of identification and quantitative determination of flavonoids in the herb of groundnut peavine.
Material and methods. The object of study is the grass of the groundnut peavine, harvested during flowering in 2018-2019. The basis for qualitative definition of flavonoids is thin-layer chromatography, the basis of quantitative determination is spectrophotometric method.
Results. When conducting quality identification installed the following conditions were established: Sorbfil plates on an aluminum substrate, the volume of application of the studied extraction - 10 ml, mobile phase: e butanol-acetic acid-water (4: 1: 2), the standard substance is rutin, cinaroside; detection treatment with 5% solution of aluminum chloride. Validation of the methodology. For the quantitative determination of flavonoids, a spectrophotometric determination method was developed in terms of rutin. The optimal extraction conditions were established.
Conclusion. The procedure has been developed a technique for the qualitative identification and quantitative determination of flavonoids in the groundnut peavine herb. The content of flavonoids ranged from 1,88%±0,07% to 2,40±0,04%.
Key words: Groundnut peavine, Fabaceae, flavonoids, standardization, chromatography, spectrophotometry.
For citation: Bubenchikov R.A., Kulik O.N.,Bubenchikova K.R. Development of the methods of identification and quantitative determination of flavonoids in the herb of the groundnut peavine (Latyrus tuberosus L.). Problems of biological, medical and pharmaceutical chemistry. 2020;23(4):22-27. https://doi.org/10.29296/25877313-2020-04-04
REFERENCES
1. Gubanov I.A., Kiseleva K.V., Novikov V.S., Tihomirov V.N. Illjustrirovannyj opredelitel' rastenij Srednej Ros-sii. M.: Tovarishhestvo nauchnyh izdanij KMK, Institut tehnologicheskih issledovanij. 2004; 2:439-447.
2. Maevskij P.F. Flora srednej polosy evropejskoj chasti Rossii. Izd. 11-e. M.: Tovarishhestvo nauchnyh izdanij KMK. 2014. S. 157-159.
3. Mahlajuk V.P. Lekarstvennye rastenija v narodnoj medicine. Saratov, 1991. 544 s.
4. Bubenchikova, V.N., Kulik O.N. Issledovanie dubil'nyh veshhestv chiny klubnenosnoj (Lathyrustuberosus L.) XXVI Rossijskij nacional'nyj kongress «Che-lovek i lekarstvo», 2019. 101 s.
5. Bubenchikova, V.N. Izuchenie triterpenovyh soedinenij travy tim'jana Marshalla. Vseross. nauch.-prakt. konf. s mezhdunar. uchastiem «Tradicii i inno-vacii farmacev-ticheskoj nauki i praktiki». Kursk, 2011. S. 207-309.
6. Zajchikova, S.G. Izuchenie lipidnogo i flavonoidnogo sostava obrazcov nekotoryh vidov roda chiny (Lathyrus). Himiko-farmacevticheskijzhurnal. 2001; 5:36-38.
7. Gosudarstvennaja Farmakopeja Rossijskoj Federacii XIV izd. T. 4. «Lekarstvennoe rastitel'noe syr'e». M.: FJeMB.
8. Gosudarstvennaja farmakopeja Rossijskoj Federacii. MZ RF. XIII izd. T.2. M.: FJeMB, 2015. 1040 s.
9. Rukovodstvo ICH «Validacija analiticheskih metodik. Soderzhanie i metodologija» Q2(R1). Farmacija. 2008; 4:3-10.
