РАЗРАБОТКА МЕТОДА ОПТИМИЗАЦИИ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД НА ОСНОВЕ КИНЕТИЧЕСКОЙ МОДЕЛИ РОСТА МИКРООРГАНИЗМОВ Текст научной статьи по специальности «Экологические биотехнологии»

Б И О Л О Г И Ч Е С К И Е

НАУКИ

УДК 57

Ю.В. Игнатичева

РАЗРАБОТКА МЕТОДА ОПТИМИЗАЦИИ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД НА ОСНОВЕ КИНЕТИЧЕСКОЙ МОДЕЛИ РОСТА МИКРООРГАНИЗМОВ

С целью оптимизации составов питательных сред разработан и создан лабораторный оптимизатор питательных сред для аэробных процессов микробиологического синтеза. Оптимизатор предназначен для реализации предварительного подбора питательной среды из компонентов, доступных производителю продукции микробиологического синтеза. В рабочих ячейках оптимизатора обеспечивается скорость массопередачи кислорода в 5 раз превышающая аэрацию жидкости в качалочных колбах. Режим аэрации и перемешивания в ячейках оптимизатора приближается к условиям культивирования аэробных микроорганизмов в биологических реакторах. Таким образом, обеспечивается поиск состава питательной среды, адекватного условиям биореакторного процесса. Объект исследования - пробиотическая культура Bacillus subtilis ДК-1 (номер по Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика В-2756). Штамм Bacillus subtilis ДК-1 относится к микроорганизмам, непатогенным для человека, согласно классификации микроорганизмов, приведенной в Санитарных правилах СП 1.3.2322-08. Штамм синтезирует лизоцим, подавляющий жизнедеятельность патогенной микрофлоры.

Ключевые слова: оптимизатор, барботажная ячейка, культивирование, линеаризация.

© Игнатичева Ю.В., 2018.

Научный руководитель: Мухачёв Сергей Германович - кандидат технических наук, доцент, Казанский национальный исследовательский технологический университет, Россия.

Экспериментальная установка

Оптимизатор состоит из силового блока с системой управления и термостата с 12-ю барботажны-ми ячейками. В качестве ячейки использован мерный цилиндр объемом 250 мл (ГОСТ 1770 -74). Высота цилиндра при заливе среды 150 мл обеспечивает возможность достаточно интенсивного перемешивания за счет барботажа воздуха или воздуха, обогащенного кислородом, с удельным расходом до 10 л/лмин [1, 2]. Для стабилизации объема жидкости в рабочих ячейках газовый поток предварительно увлажняется за счет барботажа через слой стерильной дистиллированной воды. Увлажнительный сосуд также является и смесителем газов. Из него увлажненный воздух или газовая смесь, подается по отдельным линиям в рабочие ячейки.

Контроли роста бактерий осуществлялся по изменению оптической плотности культуральной жидкости. Измерение оптической плотности культуральных жидкостей и сред осуществлялось с помощью фотоэлектроколориметра КФК-3 «ЗОМ-3» (длина волны 590 нм, толщина кюветы 5,07 мм, разбавление 1:20).

Оптимизация состава питательной среды

Отношения концентраций минеральных компонентов (соли магния, натрия, марганца, железа) к сахарозе определялись методом одномерного поиска.

Зависимость удельной скорости роста от концентраций минеральных компонентов выражена слабо (рисунок 1).

Рис.1. Зависимость удельной скорости роста бактерий от содержания минеральных компонентов в среде

Добавки солей магния и марганца требуются в минимальном количестве - около 2,5 мл исходного раствора на ячейку. Раствора солей железа требуется около 5 мл. А вот количество фосфатов должно быть увеличено [1].

Оптимизация содержания ростовых факторов и дигидрофосфата калия осуществлялась при вариациях концентраций компонентов, аналогичных методу симплексных решёток [1, 2].

Экспериментальные кривые прироста оптической плотности культуральных жидкостей во всех опытах имели вид графика с насыщением (рисунок 2), поэтому рост может описываться формулой, отражающей эффект лимитирования (в данном случае падение концентраций компонентов, в том числе и лимитирующих рост, пропорционально времени процесса):

ЛОП = аЧ / (Ь+г),

где: а - максимальная скорость роста в не лимитируемых условиях, Ь - «константа лимитирования».

Рис.2. Прирост биомассы бактерий в ячейках №2 2 - 12.

Определение параметров а и Ь легко реализуется путем линеаризации предложенной зависимости: 1/ДОП = 1/а + (Ь/а)Л.

Данные роста биомассы в первой ячейке не брались в рассмотрение, поскольку условия перемешивания в ней отличались за счет прокачки жидкости насосом через измерительную ячейку с датчиком растворенного кислорода. Расход воздуха выбирался таким образом, чтобы концентрация растворенного кислорода была отлична от нуля.

Отсутствие линейности экспериментальной зависимости означало бы неадекватность предложенной модели. Отклонения от линейных графиков отдельных экспериментальных точек представляют собой ошибки экспериментов, позволяющие оценить корректность их реализации. Все это представлено на рисунках 3 и 4.

4 3,5 3 с 2,5 О о ^ 1,5 1 0,5 у = 8,1639х + 1,5289

^ —

0 0,1 0,2 1/t 0,3

у = 16,877х + 1,3359

2 1 О

О 0,1 0,2 0,3

1/t

А) Ячейка 2

6 5 4 3 2 1 0 у = 16,747х +0,7911

о <]

) 0,1 1ft 0,2 0,3

В) Ячейка 4

Б) Ячейка 3

R у = 19,993х +0,4188

5 1 4 3 2 1 Ж

) 0,05 0,1 1/t 0,15 0,2 0,25

Г) Ячейка 5

4,5 4 3,5 § 3 5 2,5 "" 2 1,5 у - 12,189х + 1,1523

Г*

0 0,1 0,2 0,3 1/t

Д) Ячейка 6 Е) Ячейка 7

Рис. 3(А-Е). Линеаризация кинетических кривых роста бактерий

4 3,5 с 3 | 2,5 ^ 2 1,5 у = 13,155х +0,677

Р

0 0,1 0,2 0,3 1/t

Ж) Ячейка 8

И) Ячейка 10

5,5 5 4,5 ■= Л о 3.5 ä з 2,5 2 1,5 у = 20,977х + 0,5294

/и

У

•У

*

0 0,1 0,2 0,3 1/t

4 3,5 3 | 2,5 ^ 2 1,5 у = 8,4565х + 1,9082

0 0,1 0,2 0,3 1/t

у = 12,631 х + 1,0794

3,5 3 | 2,5 ^ 2 1,5 1 St.

0,1 0,2 0,3 1/t

К) Ячейка 11

Л) Ячейка 12

Рис. 4(Ж-Л). Линеаризация кинетических кривых роста бактерий

Параметры а и Ь уравнения АОП = аЧ / (Ь+1) легко рассчитываются исходя из полученных линейных трендов представленных на рисунках 12а - 12л, где через у обозначена переменная величина 1/АОП.

Результаты расчета параметров кинетических зависимостей, а также величин экономических коэффициентов (Ух/в) в размерности гАСБ/гРВ представлены в таблице 1.

Таблица 1

Расчет кинетических параметров и экономических коэффициентов___

№ ячейки 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

а 0,654 0,749 1,264 2,388 0,868 1,230 1,477 0,862 1,889 0,926 0,524

b 5,340 12,63 21,17 47,74 10,58 17,89 19,43 13,94 39,62 11,70 4,432

Yx/s 0,200 0,163 0,211 0,174 0,200 0,200 0,219 0,188 0,217 0,225 0,165

Зависимость экономического коэффициента от кинетического параметра «а», пропорционального предельной величине скорости роста, показана на рисунке 5.

Экономический коэффициент роста, гАСБ/гРВ ООО О р ^ р го О сл СЛ ГО СП

О

(¿о

1 2 3 Параметр"а"

Рис.6. Зависимость экономического коэффициента от кинетического параметра «а»

Зависимость экономического коэффициента от параметра «Ь», определяющего эффект лимитирования роста, представлена на рисунке 6.

Экономический коэффициент роста, гАСБ/гРВ о о р р го ">0110 01

• J

Si

20 40 60 Параметр "Ь"

Рис. 6. Зависимость экономического коэффициента от кинетического параметра «Ь»

Поскольку от параметра «Ь» зависимость выражена не четко (в центральной части графика точки отсутствуют, отклонение отдельных точек от линии тренда значительно) то корректировать состав среды по данным, представленным на рисунке 5, не представляется возможным.

Экстремальный характер зависимостей, представленных на рисунках 5 и 6, может быть объяснен тем, что при уменьшении «Ь» и увеличении «а», снижается энергетическая эффективность метаболической машины клетки из-за необходимости обеспечения высокой интенсивности процессов биосинтеза. Т.е. изменяется соотношение между конструктивным и энергетическим обменами.

На основании полученной зависимости (рисунок 5) определялся оптимальный состав питательной

среды.

Таблица 2

Оптимальный состав питательной среды_

№ п/п Компонент Концентрация, г/л

1 MgSO4■7H2O 0,017

0,01

2 FeSO4■7H2O 0,045

3 KH2PO4 0,159

4 Сахароза 2,5

ша 0,45

5 Биотин (витамины) 0,3 мкг/л

6 Гидролизат рыбной муки 15 мл

7 Гидролизат кукурузного экстракта 10 мл

Заключение

Проведены биотехнические испытания оптимизатора питательных сред и разработана методика оптимизационного исследования. Достоинством конструкции оптимизатора является существенное повышение массообменных характеристик, что приближает режим перемешивания и массообмена к условиям промышленного биореактора.

Предложенный метод оптимизации питательных сред «работоспособен» в условиях реальных погрешностей реализации биотехнологических экспериментов при минимальном количестве испытаний. При этом не важно, какой компонент находится в физиологическом минимуме в конкретной ячейке, поскольку кинетическая модель строится относительно времени процесса и прироста биомассы микроорганизмов.

Библиографический список

1. Отчёт. Разработка интенсивного режима культивирования спорообразующих бактерий (Договор № ГС1/26903 от 22.03.2017). Регистрационный № АААА-А17-117042450108-3// ООО «Бионация». Казань, 2018. 74 с.

2. Игнатичева Ю.В. Оптимизатор питательных сред для аэробных процессов микробиологического синтеза // Ю.В. Игнатичева, С.Г. Мухачев / Молодой исследователь: вызовы и перспективы: сб. ст. по материалам LXV[ Международной научно-практической конференции «Молодой исследователь: вызовы и перспективы». 2018. № 13(66).

ИГНАТИЧЕВА ЮЛИЯ ВЛАДИМИРОВНА - магистрант, Казанский национальный исследовательский технологический университет, Россия.