CC BY
218
УДК579.083.13: 663.131
С. Г. Мухачев
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА СТЕХИОМЕТРИЧЕСКИХ ИНВАРИАНТОВ ПРИ ОЦЕНКЕ ХАРАКТЕРИСТИК ПРОЦЕССА РОСТА АЭРОБНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ
Предложен метод расчета характеристик процесса культивирования микроорганизмов в аэробных условиях, основанный на построении стехиометрических инвариантов в форме уравнений связи метаболических скоростей. Показано, что затраты энергии в процессе синтеза биомассы, рассчитанные по экспериментальным данным о процессе аэробного роста этанолокисляющих дрожжей с использованием метода стехиометрических инвариантов, близки к теоретически определенным на основе закона Гесса.
Методические основы оперативного расчета материально-энергетического баланса аэробного процесса роста микроорганизмов рассмотрены на примере этанолокисляющих дрожжей Candida lambica ВСБ-579 (штамм получен для выполнения экспериментальных работ из коллекции института «ВНИИСинтезбелок» в 1979 году). Штамм отличается высоким качеством белка, приближающегося к качеству белка пищевого достоинства. Однако, экспериментальные работы и промышленное использование штамма затруднены ввиду крайне узкого диапазона толерантности к концентрации субстрата (оптимальный диапазон
0,9 - 2,1 г/л). Устойчивое ведение процесса возможно практически только в управляемом режиме оксистата [1 - 3], поскольку при повышенных концентрациях субстрата и растворенного кислорода наблюдается эффект синергического ингибирования. Резко выраженная зависимость метаболизма от концентрации субстрата подтверждается нестабильностью экономического коэффициента (рис.1) при подачах различных по величине доз этанола (2,3; 4,6 и 6,9 г). Таким образом, выбранный штамм дрожжей представляет интерес при отработке методов балансовых расчетов, применимых для анализа динамических режимов, характеризующихся существенными изменениями стехиометрии биосинтеза.
При описании и анализе процессов биосинтеза были приняты следующие основные допущения:
1. Метаболическая система клетки при постоянной величине удельной скорости роста находится в стационарном состоянии, т.е. величина пула макроэргических соединений в расчете на единичное количество биомассы не меняется.
2. Распределение потоков энергии в живой клетке может быть оценено в соответствии с общепринятым постулатом Пирта [4] и Стоутхамера [5, 6] об аддитивности затрат источника углерода и энергии на поддержание жизнедеятельности и рост клетки.
3. Вследствие того, что культивирование микроорганизмов проводится практически в постоянных физико-химических условиях, можно считать производство энергии в клетке зависящим лишь от внутреннего биохимического механизма преобразования молекулы субстрата; влиянием незначительного изменения внешних условий на указанный процесс можно пренебречь. В связи с чем принято, что энергия, выделяемая при гидролизе молекулы АТФ, является постоянной величиной.
4. Затраты энергии на процессы синтеза биополимеров в клетке могут быть определены на основании закона Г есса, как равные теплоте образования биомассы из углекислого
газа, аммиака и воды: глубина перестройки молекулы любого субстрата в цепи многих сотен превращений в биохимической машине клетки столь существенна, что в целом сам процесс биосинтеза эквивалентен синтезу из «продуктов сгорания» биомассы [7]. По отношению к этим продуктам, составляющим по определению Минкевича [8] физиологический базис («Ф-базис») соединений, энергия которых принята условно за ноль, ведется весь расчет энергетического баланса биосинтеза.
5. Жидкая фаза в лабораторном биореакторе рассматривается как гомогенная среда; различием между внутри- и внеклеточными концентрациями веществ пренебрегаем.
Рис. 1 - Изменение эффективности использования субстрата при варьировании величины дозы питательной среды
Условия эксперимента
В режиме оксистата реализована серия отъемно-доливных процессов роста этано-локисляющих дрожжей Candida lambica ВСБ-579, осложненного продуцированием уксусной кислоты.
Культивирование дрожжей осуществлялось в лабораторном биореакторе объемом 4 л, оснащенном системой гидродинамического пеногашения, функционирующей без использования химических пеногасителей [9], дополненной устройством дегазации рециркулируемого потока культуральной жидкости. Датчики рН и растворенного кислорода были установлены в выносной измерительной ячейке, включенной в контур рециркуляции культуральной жидкости. Время пребывания потока в рециркуляционном контуре не превышало 6 секунд.
Система КИПиА обеспечивала управление:
- скоростью вращения мешалки в пределах 3 - 27 с-1 с точностью ± 0,17 с-1;
- температурой в биореакторе в пределах 20 - 45 °С с точностью ± 0,1 °С;
- кислотностью культуральной жидкости в пределах 2,0 - 8,0 ед. рН с точностью ± 0,1 ед. рН;
- расходом воздуха, подаваемым на аэрацию, в пределах 0,5 - 5 л/мин с точностью ± 0,1 л/мин (расход определялся по перепаду давления на многопучковом капилляре, тарировка входного расходомера и измерение расхода отработанного воздуха осуществлялись с использованием барабанного счетчика ГСБ-400, дополнительно оснащенного счетчиком оборотов).
Измерение состава отработанного воздуха обеспечивалось газоанализаторами кислорода (М5130) и углекислого газа (ГИАМ-5), тарировка которых проводилась с использованием стандартных газовых смесей 1 класса три раза в течение суток.
Для повышения стабильности работы приборов, помимо существующей термокомпенсации, все электронные схемы и газовый тракт в целом были термостабилизированы.
Культивирование проводилось при следующих уставках регуляторов: температура культуральной жидкости - 34 °С; рН - 4,7; концентрация растворенного кислорода > 7% от уровня насыщения, равного в среднем 6,1 мг/л.
С целью исключения образования осадка солей в технологической обвязке, компоненты питания подавались двумя отдельными потоками с одинаковыми объемными скоростями: раствор этанола с концентрацией 200 г/л и раствор минеральных компонентов питания следующего состава, г/л: KCl - 8,384; MgSO4-7 H2O - 2,502; FeSO4- 7 H2O - 0,506; ZnSO4-7 H2O - 0,144; MnSO4-7 H2O - 0,13; H3PO4 - 14,082. Значение рН исходной среды (подушки) перед засевом доводилось до заданного уровня аммиачной водой. В качестве титрующего агента использовалась аммиачная вода с концентрацией аммиака 6 %. Дозирование растворов осуществлялось из мерных емкостей перистальтическими дозаторами. Дополнительно автоматически дозировалась дистиллированная вода в количестве, компенсирующем отъем культуральной жидкости.
Отъем культуральной жидкости при реализации отъемно-доливных процессов осуществлялся автоматически с использованием весового приемника со сменным стаканом объемом 300 мл. Рабочий объем культуральной жидкости в квазистационарном режиме поддерживался в пределах 1340 - 1585 мл, с точностью воспроизведения конечных значений в пределах ± 18 мл. Для обеспечения корректности расчета баланса воды и поддержания заданного объема культуральной жидкости, на выходе отработанного воздуха из биореактора был установлен обратный холодильник.
Концентрация биомассы определялась путем высушивания до постоянного веса отфильтрованной и промытой пробы с погрешностью не хуже 3 %.
Концентрации этанола и продуктов его окисления определялись с целью качественной оценки состава культуральной жидкости хроматографически (хроматограф «Хром-4», внутренний стандарт - ацетон).
Управляющие программы были реализованы с использованием языка программирования Fortran-4. Послеэкспериментальная обработка реализована в среде Microsoft Excel®.
Первичная обработка результатов измерений
Расчет газового баланса осуществлялся после процедуры фильтрации данных первичных замеров (усреднения по 5 последовательным замерам с дискретностью 0,5 секунды) и восстановления сигналов, искаженных при движении потока в газовом тракте за счет задержки потока и отклонения течения от режима идеального вытеснения. Режим движения газового потока в биореакторном пространстве над жидкостью был близок к режиму идеального перемешивания за счет работы гидромеханического устройства пеногашения. Пересчет концентраций компонентов отработанного воздуха осуществляли по формуле:
c ~ c 0 + 0 ■ Ac 0 / At,
(1)
где С и Co - восстановленное и замеренное значения концентрации компонента, % об.; 0 -среднее время пребывания потока в пространстве биореактора над культуральной жидкостью, мин; At - дискретизация замеров, мин.
После перерасчета осуществлялся сдвиг замеров по оси времени на величину задержки в выходном газовом тракте (перемещение отработанного воздуха от биореактора до датчиков газоанализаторов), в котором режим движения потока был близок к идеальному вытеснению. Задержка определялась на стадии подготовки к экспериментам методом подачи трассера. В качестве трассера использовался углекислый газ. Оценка параметров газового потока производилась на основе регистрации дифференциальной функции распределения времени пребывания потока в биореакторе и выходном газовом тракте при подаче тестовых сигналов (импульсный ввод 50 мл СО2 в газовую полость биореактора). Время задержки в среднем составило 85 сек. При изменении расхода отработанного воздуха время задержки корректировалось расчетным путем и полученное значение округлялось с точностью шага дискретизации замеров At. При этом пренебрегали изменением объема перемешиваемого газа над культуральной жидкостью в биореакторе вследствие незначительного колебания газосодержания и уровня пены в квазистационарном режиме ведения процесса. При изменении объема пены в переходных режимах величина перемешиваемого объема газа в биореакторе корректировалась по данным визуального наблюдения уровня газо-жидкостной среды. Восстановленные значения концентраций кислорода и углекислого газа использовались в балансовых расчетах, осуществляемых в режиме «on line» с дискретностью 30 с.
Для концентраций газообразных компонентов справедливо уравнение баланса потоков азота (с примесью инертных газов), приведенных к нормальным условиям, л/мин
где О2 и СО2 с соответствующими индексами - концентрации кислорода и углекислого газа во входном и выходном газовом потоке в объемных процентах.
Скорости потребления кислорода и десорбции углекислого газа (равной его продуцированию при низком значении рН культуральной жидкости) рассчитывались по формулам:
где 32 и 44 - молекулярные массы кислорода и углекислого газа; 60 - число минут в 1 ч; 20,95 и 0,035 - концентрации кислорода и углекислого газа в сухом воздухе, % об.; 22,4 -объем в литрах одной граммолекулы газообразного вещества при нормальных условиях (отклонением от параметров идеального газа пренебрегали ввиду незначительных давлений и температур потоков).
Связыванием углекислого газа подаваемым аммиаком пренебрегали вследствие низкого значения рН культуральной жидкости.
Расходы субстрата Яб и титранта (аммиака) Яы определялись из числа поданных доз, объема единичной дозы и концентраций компонентов в подаваемых растворах. Средняя метаболическая скорость потребления субстрата равна скорости его подачи, усредненной на интервале потребления дозы субстрата, поскольку в режиме отъема-долива с управлением подачами по данным измерения концентрации растворенного кислорода,
[10, 11]:
(2)
(3)
Ro - 32 ■ б0 ■ (v°х ■ 20,95 - v°х ■ O2вых) /(100 ■ 22,4), г О2/ч; Rc - 44 ■ б0 ■ (v°ь,х * СО2вых - v°х * 0,035)/(100 ■ 22,4), г СО2/ч,
(4)
(5)
субстрат срабатывается практически до нуля. Средняя метаболическая скорость потребления источника азота в квазистационарном режиме ведения процесса оказывается меньше скорости подачи на величину количества аммиака, пошедшего на оттитровку подкисленного раствора солей и оставшегося непотребленным (при постоянстве средних значений рН культуральной жидкости и ее буферности в квазистационарных условиях).
Результаты и обсуждение
Материальный баланс процесса может быть представлен совокупностью уравнений образования и расхода макроэргических соединений (пересчитанных на АТФ).
Существенное упрощение формы записи стехиометрических соотношений может быть получено при общепринятом приведении (пересчете) формул всех углеродсодержащих веществ (составов) к одному атому углерода.
Уравнение энергетического обмена (окисление этанола) представим в виде:
PS1 ' CHqOr + Р01 ' O2 + ADP ^ PC1 ' CO2 + Ph1 ' H2O + ATP ; (6)
PS1 = 1/ES> PO1 = YS/(4' ES )> PC1 = 1/ES> PH1 = q/(2' ES), где Es = 8 моль АТФ/моль; S - выход макроэргических соединений с единичного количества субстрата (этанола) при его полном окислении в пересчете на АТФ [12]; у s - степень восстановленное™ субстрата, рассчитываемая по формуле, предложенной Минкевичем И.Г. и Еро-шиным В.К. для органических соединений и биомасс микроорганизмов [13]; q = 3; r = 0,5.
Пластический обмен (преобразование вещества субстрата в биополимеры клетки без учета дополнительных затрат энергии), может быть описан уравнением:
РS2 ' CHqOr + Po2 ' O2 + Pn2 ' NH3 ^ CHbNc0d + Ph2 ' H2O ;
PS2 = 1; P02 =(YS - YX )/ 4; PN2 = c; PH2 = (q + 3 ' c - b)/ 2, (7)
где Y x - степень восстановленности биомассы; b = 1,807; c = 0,166; d = 0,44.
Конструктивный обмен (синтез биомассы) может быть описан путем энергетического сопряжения уравнения образования макроэргических соединений (6) и их расхода в процессе биосинтеза, пропорционального образованию новой биомассы в соответствии с уравнением (7):
(EX /ES + 1)' CHq0r +[EX ' YS /(4' ES )+(yS - YX )/ 4]' 02 + c ' NH3 ^ (8)
CHbNcOd + (Ex/Es)• CO2 +[Ex ■ q/(2• Es)+(q + 3• c-b)/2]'H2O ’
где EX - удельные дополнительные затраты макроэргических соединений, в пересчете на АТФ, на синтез биомассы и процессы, пропорциональные росту, мольАТФ/мольАСБ.
Продуктный обмен в данном случае представляется процессом синтеза уксусной кислоты. Стехиометрия продуцирования уксусной кислоты, с учетом ее автоматической оттитровки аммиачной водой, описывается уравнением:
PS3 ' CHq0r + Р03 ' 02 + PN3 ' NH3 + ADP ^ Pp3 ' CHkNn0f + Ph3 ' H20 + ATP ;
PS3 = PP3 = 1/EP , P03 =(yS - YP )/(4' EP ), PN3 = n/EP ; (9)
PH3 =(yS - YP )/ 2 + r - f , где YP - степень восстановленности экзометаболита (уксусной кислоты), k = 3,5; n = 0,5; f = 1.
Уточнение механизма процесса. Для оценки возможного механизма процесса были выполнены сравнительные эксперименты по утилизации разовых доз этанола и продуктов его последовательного окисления - ацетальдегида и уксусной кислоты. Результаты,
представленные в таблице 1, свидетельствуют о том, что, образующаяся при относительном избытке этанола, уксусная кислота может срабатываться исследуемой культурой дрожжей в условиях лимита по субстрату, но, в основном, в энергетическом обмене. При этом на один условный моль образуемой уксусной кислоты, клетка получает энергию в количестве Ер = 2,5 моля АТФ, а при ее срабатывании - в количестве Ед - Ер = 8 - 2,5 = 5,5 молей АТФ [12].
Таблица 1 - Сравнительная эффективность ассимиляции продуктов последовательного окисления этанола
Субстрат Дыхательный коэффициент, гСО2/гО2 Экономический коэффциент, г АСБ/г Б
Этанол 0,77 0,49
Ацетальдегид 0,97 0,48
Ацетат аммония 1,37 0,08
На рис. 2 показана динамика растворенного кислорода при потреблении доз субстрата 2,3 и 4,6 г. При большей величине дозы наблюдается временное падение интенсивности потребления кислорода через 2 - 3 мин после подачи, что происходит вследствие ингибирования нарастающей внутриклеточной концентрацией ацетальдегида, являющегося промежуточным продуктом окисления этанола. При этом в культуральной жидкости хроматографический анализ выявил ацетальдегид лишь в следовых количествах. Возможно, образующийся в небольшом количестве после подачи физиологически избыточной дозы этанола, ацетальдегид не выбрасывается в среду, а накапливается и затем полностью срабатывается внутри клеток, в данном случае в течение 7 - 8 мин.
Рис. 2 - Динамика концентрации растворенного кислорода при различных дозах субстрата
Уравнения связи метаболических скоростей. Традиционно стехиометрические инварианты записываются в виде не меняющих свое значение во времени линейных комбинаций концентраций реагентов и продуктов. Разница между числом реакций и числом ключевых веществ определяет число инвариантов (частных линейно независимых уравнений баланса). Для анализа динамических процессов биосинтеза нами предложено продифференцировать инвариантные соотношения. В этом случае мы получим набор частных уравнений связи метаболических скоростей. Такие уравнения могут использоваться для расчетного нахождения величин неизвестных метаболических скоростей, которые экспериментально сложно или даже невозможно измерить на практике.
Обозначим через у и 2 количества молей АТФ, образуемых по механизмам реакций (6) и (9) соответственно. Молярные расходные коэффициенты, представляющие собой отношения молярных скоростей расхода и синтеза компонентов (кислорода, углекислого газа, аммиака, этанола, уксусной кислоты соответственно) к скорости образования биомассы, могут быть представлены в виде:
^О/Х = (Мх ■ Я0)/(Мс • Ях) = у • Реї + в02 + 2' Роэ; (10)
^С/Х = (МХ • ЯС )/(МС • ЯХ )= у • вС1; (11)
УМ/х = (МХ • )/(ММ • ЯХ )= ^N2 + 2 • Рыэ; (12)
У3/х - (Мх ■ Из )/(М3 ' Ях ) - У ' Рз1 + Рэ2 + 2 ' Рзэ ; (13)
Ур/х -(мх ■ Яр)/(мр ■ Ях)-2'Ррз’ (14)
где М - масса г-моля соответствующего компонента; индексы X, О, С, Ы, 3, Р - обозначают компоненты (соответственно биомассу, кислород, углекислый газ, аммиак, субстрат и продукт).
Из уравнений (11) и (12) выразим у и 2, подставим в уравнение (10) и разрешим его относительно скорости роста биомассы:
Ях — 1 ■ Х — 4 ■ Яр/мо ^з ЯС /мс - ^з - YP )' яы /(п ' мы )
Мх Мх dt
'X
Ys - Yx -(Ys - Yp)• c/n
(15)
Аналогично с использованием других уравнений системы (10) - (14) находятся: Rs 1 dS 4 • Rq/Mq —Y p •Rc/Mc + (y x — Yp )• Rx/Mx
Ms Ms dt
R
's
p
YS - YP
(16)
1 dP _ 4 • Rq/Mq -y s Rc/MC -(y S - Y X )• RX/MX • dt _
(17)
Мр Мр dt Yз - Yр
где х, 3, р - соответственно количества биомассы (г АСБ), субстрата и продукта (г) в биореакторе.
Для случая вторичного потребления ацетата аммония в энергетическом обмене (Яр < 0) получаются уравнения, которые после подстановки всех численных значений параметров, идентичны (15) - (17). Таким образом, из шести метаболических скоростей необходимо замерять лишь три. Остальные находятся из стехиометрических инвариантов (15) - (17). Расчет метаболических скоростей в размерности моль/мольАСБ-ч дает непосредственно значения стехиометрических коэффициентов в суммарном уравнении материального баланса.
Уравнения связи метаболических скоростей могут быть записаны в данном случае относительно четырех любых метаболических скоростей. Однако, только три из таких выражений будут линейно независимы.
Имея выражения для метаболических скоростей, можно записать уравнение баланса макроэргических соединений в дифференциальной форме:
(у + 2) ■Ях/Мх — Ех ■ Ях /Мх + е■ х/Мх + Яр / Мр, (18)
где е - затраты энергии на поддержание жизнедеятельности (процессы не пропорциональные росту), мольАТФ/мольАСБ-ч; Яр - скорость изменения концентрации АТФ, Мр - масса г-моля АТФ.
Или, с учетом выражений у и 2, получаемых из уравнений (10) и (11), уравнение (18) записывается в виде:
(
Ер •Ys^ Mx•Rc
Es -
v YS - YPJ
+ -
Ec
Mc • RX yS - YP
4 • Mx•Rq Mq • Rx
- Y s + Y x
(19)
_ EX + e/м + (Rf/Mf)/(Rx/Mx)
Для стационарных условий постоянства внутриклеточной концентрации АТФ справедливо выражение:
cF _ (RF/MF)/(RX/MX), (20)
где Cf - молярная внутриклеточная концентрация АТФ, мольАТФ/мольАСБ.
Поскольку величина молярной концентрации АТФ значительно меньше затрат АТФ на моль вновь синтезированной биомассы Ех, ее значением можно пренебречь, но только в стационарных условиях при м s const.
Расчет энергетических параметров микробного роста. Уравнение (19) позволяет найти энергетические параметры Ex и e на основе данных газового анализа и экспериментальных или рассчитанных с использованием уравнения (15) значений концентрации биомассы.
Для процесса роста дрожжей Candida lambica ВСБ-579 (формула биомассы CHii807Noii66Oo,44; YX = 4,4282; молекулярная масса с учетом зольных элементов Мх = 24,74) уравнение (19) примет вид:
5 • Rq / Mq + 0,5 • Rc / Me -1,965 • Rx / Мх ~ Ex • Rx / Мх + e • X/Мх (21) или, деля правую и левую части на величину скорости роста биомассы, получаем выражение функции затрат энергии в виде:
Fe = 5• Yq/x + 0,5• Ye/х -1,965 - Ex + e/H. (22)
Для определения численных значений Ex и e достаточно данных двух стационарных режимов или двух групп значений параметров, полученных в периодическом процессе для разных моментов времени. Но это должны быть достаточно близкие по условиям и параметрам режимы, иначе нет гарантий, что величина затрат энергии на поддержание жизнедеятельности останется постоянной. Кроме того, реализация двух стационарных процессов требует длительного эксперимента, и желательно иметь метод, применимый для анализа отдельного процесса (состояния популяции), в том числе в режиме «on-line».
Нами была разработана следующая процедура расчета. Она, естественно, требует подбора величины дозы субстрата, обеспечивающей стационарное состояние метаболизма в течение времени, достаточного для анализа процесса. На рис.3 приведена зависимость удельной скорости роста от концентрации субстрата при дозировании этанола в количестве 2,3 и 4,6 г.
«
Н
W
О
а
н
W
о
а
о
a
W
R
Я
35
л
п
а
П
Концентрация этанола, г/л
Рис. 3 - Удельная скорость роста при различных дозах субстрата
Данная зависимость получена расчетным путем на основе использования выражений стехиометрических инвариантов. При малой величине дозы субстрата стационарного состояния ме-
таболической системы клетки не наблюдается. При величине дозы 4,6 г наблюдается стационарное состояние (м=С0ПБ1) в диапазоне падения концентрации субстрата от 2,07 до 1,1 г/л. Этот интервал может использоваться для корректного расчета энергетических параметров.
Для повышения надежности расчета необходимо использовать достаточный массив данных. В нашем случае это 17 - 20 точек с дискретизацией по времени 30 с, относящиеся к интервалу стационарного состояния метаболизма и воспроизводимые на каждом цикле отъема - долива. Первоначально было необходимо убедиться в достижении условия квазистационарности. Для этого определяли количество биомассы в аппарате в начале и в конце последовательных циклов отъема-долива на основе прямого измерения концентрации биомассы в отбираемой культуральной жидкости и рассчитываемого ее объема. После достижения квазистационарности процесса, в расчетах использовались данные шести последовательных циклов отъема-долива (табл. 2). В соответствии с полученными данными можно оценить погрешность реализации квазистационарного режима как приемлемую.
Таблица 2 - Оценка погрешности реализации квазистационарного режима культивирования этанолокисляющих дрожжей
Концентрация биомассы, г АСБ/л Начальное количество биомассы, г АСБ Конечное количество биомассы, г АСБ
8,923 11,841 14,041
8,839 11,730 13,914
8,401 11,149 13,316
9,079 12,048 14,292
8,727 11,573 13,773
8,992 11,712 13,915
Математическое ожидание
8,826 11,712 13,915
Среднеквадратичное отклонение
0,242 0,321 0,344
Расчет баланса выполняли для двух случаев непрерывных процессов культивирования: а) квазистационарный процесс; б) нестационарный процесс (переходный режим).
Интегрирование уравнений (15) - (17) осуществляли на каждом цикле потребления фиксированной дозы субстрата с начальными условиями:
X0 = X • Ут|п ; Э0 = Бс| • ; Ро = 0 , (23)
где X - концентрация биомассы в конце предыдущего цикла отъема-долива, гАСБ/л; Ут|п -стартовый объем культуральной жидкости в начале нового цикла отъема-долива, л; УБ -объем дозы субстрата, л; - концентрация субстрата в подаваемом растворе, г/л.
Концентрации всех компонентов пересчитывались при подачах доз раствора минеральных компонентов и воды, подаваемой для компенсации потери объема культуральной жидкости. В качестве исходных данных использовались экспериментально полученные массивы
значений скоростей потребления кислорода, аммиака и образования углекислого газа. В начале и в конце периода отъемно-доливного процесса, когда величина удельной скорости роста равна нулю, расчет вели по уравнениям, полученным из системы (15) - (17) путем подстановки dX/dt = 0. Отсутствие роста определяли по величине дыхательного коэффициента ЯО > 0,67 мольСО2/мольО2, что соответствует полному окислению субстрата.
Проинтегрируем уравнение (21) в пределах от Ь до ^ поделив затем правую и левую части на величину интеграла от количества биомассы:
t
І(5
to
* Rо / Mo + 0,5 * Rc / Me
t
1,965 * (dX/dt)/MX) * dt І (dX/dt) * dt
=E
to
. + e или:
І(X/MX) * dt
to
t
І
to
X * dt
(24)
^1 = ЕХ ' ^2 + е ,
где интегральные комплексы ^ (удельный интегральный расход МЭС) и ^ (удельная интегральная величина скорости роста биомассы) рассчитываются на временном интервале стационарного состояния метаболической системы культуры. Результат такого расчета представлен на рис. 4. При этом для конкретного цикла отъема-долива определенные по методу наименьших квадратов значения параметров расхода энергии в процессе роста популяции составили: Ех = 2,883 мольАТФ/мольАСБ, е = 1,875 мольАТФ/мольАСБч.
Рис. 4 - Зависимость интегральной характеристики расхода энергии от величины интегральной скорости роста биомассы дрожжей Candida lambica ВСБ-579 в оптимальных условиях культивирования
Естественно, единичное определение параметров расхода энергии в процессах метаболизма при малых диапазонах изменения величин интегральных комплексов, соответствующих ограниченному временному интервалу стационарного состояния метаболической системы культуры, не обеспечивает достаточной точности. В табл. 3 приведен разброс искомых показателей при обработке данных потребления шести последовательно подаваемых доз субстрата в квазистационарном режиме. Среднеквадратичное отклонение составило 7,5 %, что соответствует средней точности определения параметров процессов в большинстве биотехнологических экспериментов. Таким образом, искомые значения энергетических параметров находятся в интервалах (± 3а): е = 2,001 ± 0,269 моль-АТФ/мольАСБч; Ех = 2,576 ± 0,58 мольАТФ/мольАСБ.
Таблица 3 - Оценка погрешности расчета энергетических параметров процесса роста этанолокисляющих дрожжей
Порядковый номер дозы субстрата е Ех
мольАТФ мольАСБ- ч мольАТФ мольАСБ
1 2,021 2,586
2 2,138 2,360
3 1,987 2,656
4 1,875 2,883
5 2,041 2,378
6 1,943 2,591
Математическое ожидание 2,001 2,576
Среднеквадратичное отклонение 0,0895 0,1934
Оценим полученные результаты на основании теоретического расчета затрат энергии. Обозначим через Ид и Нх энтальпии сгорания субстрата и биомассы соответственно. Учитывая, что энтальпии образования углекислого газа, воды и аммиака соответственно равны Ис = 394 кдж/моль, Ин = 286 кдж/моль, = 46 кдж/моль [14], а энтальпия гидроли-
за АТФ равна приближенно Идур = 20,95 кдж/моль [15], в соответствии с законом Гесса энтальпии образования субстрата и биомассы рассчитываются по формулам:
ИХ = Ис + [(Ь - 3 ' с)/2]' ИН + с ' - НХ ; ИБ = Ис +(я/2)' ИН - НБ (25)
Для этанола (приведенная формула к одному атому углерода: СН3О0,5) получаем Ид = 145,6 кдж/моль. На основании известного состава биомассы получаем Их = 88,9 кдж/моль.
С учетом того, что в пластическом обмене часть энергии субстрата, пропорциональная разности степеней восстановленности субстрата и биомассы, переходит в биомассу, определяем дополнительно необходимые затраты АТФ в конструктивном обмене:
Е(ХС) = Их ~(у5 -Ух)' ^У5 = 2,523 мольАТФ/мольАСБ, (26)
П х ' ИДТР
где П х = 0,96 - энергетический КПД пластического обмена [16].
Расхождение математического ожидания экспериментального значения Ех и расчетного
значения Е^ составляет: бЕ = 100 • 12,576 - 2,5231 / 2,523 = 2,1 %, что находится в пределах погрешности определения количества и колебания состава биомассы [17].
Оценим применимость предлагаемого подхода к расчету материальноэнергетического баланса переходного режима при реализации отъемно-доливного процесса культивирования микроорганизмов. Экспериментально полученные значения величин, усредненные на интервалах потребления доз субстрата, приведены в таблице 4. Последние две графы содержат данные для построения зависимости (22).
Учитывая значительный разброс исходных данных (рис. 5), примем Ех равным теоретическому значению, и рассчитаем средний расход энергии в метаболизме поддержания: е = 3,8 мольАТФ/мольАСБ^час. Полученное значение значительно отличается от определенного для оптимальных условий (при Н ^ Нтах). Таким образом, на интервалах потребления доз субстрата, мгновенные значения затрат энергии на поддержание жизнедеятельности существенно изменяются - от 2 до примерно 4,5 мольАТФ/мольАСБ^ч. Что соответствует изменению метаболизма от практически оптимального режима роста до срабатывания остаточного количества экзометаболита в энергетическом обмене. Очевидно, что расчетное значение Е^ можно использовать для приближенного нахождения мгновенного
значения затрат энергии на поддержание жизнедеятельности по единичному (одномоментному) определению значений метаболических скоростей. Для этого формулу (22) необходимо представить в виде:
е = Н' (ре - ЕХС)). (27)
Таблица 4 - Характеристики переходного режима отъемно-доливного процесса культивирования дрожжей Candida lambica ВСБ-579
^T, мин Vl0, л O2 вых, % об. CO2 вых, % об. v вх o, л/мин v вых o, л/м ин Ro, г/час Rc, г/час Rs, г/час Rn, г/час Rx, г/час X, гАСБ Н, час-1 1/Н, час Fe, мольАТФ мольАСБ
105,9 1,48 19,78 0,75 2,000 1,988 2,201 1,668 1,841 0,169 0,869 1,410 0,616 1,622 8,364
57,53 1,47 18,91 1,23 2,013 1,991 3,864 2,797 3,390 0,251 1,290 2,776 0,465 2,152 10,223
42,90 1,46 18,13 1,64 2,019 1,988 5,360 3,769 4,546 0,352 1,814 4,021 0,451 2,217 10,042
37,70 1,44 17,48 2,07 2,027 1,990 6,575 4,784 5,173 0,345 1,777 5,163 0,344 2,905 13,095
31,85 1,43 16,74 2,50 2,043 1,999 7,998 5,809 6,123 0,397 2,047 6,229 0,329 3,043 13,935
28,27 1,42 16,06 2,98 2,040 1,991 9,217 6,917 6,898 0,429 2,209 7,255 0,305 3,284 15,044
23,08 1,39 15,53 3,44 2,034 1,984 10,128 7,967 8,449 0,495 1,561 7,901 0,198 5,061 24,551
21,13 1,37 15,15 3,55 2,037 1,980 10,879 8,191 9,229 0,491 1,549 8,362 0,185 5,397 26,665
29,90 1,40 14,93 3,66 2,028 1,969 11,233 8,416 6,522 0,465 1,467 9,151 0,160 6,239 29,253
26,65 1,37 15,13 3,64 1,990 1,935 10,636 8,223 7,317 0,468 1,479 9,702 0,152 6,561 27,407
23,08 1,40 14,77 3,68 1,960 1,899 11,154 8,148 8,449 0,533 1,683 10,507 0,160 6,244 25,022
Использованные расчетные формулы:
- Эксп. (1) (1) Эксп. (3) (4) (5) (16) Эксп. (15) Эксп. (dX/dt) X - (22)
Примечание: ДТ - продолжительность (период) потребления дозы субстрата; У|_о - начальный объем культуральной жидкости перед подачей дозы субстрата; «Эксп.» - величины, определенные при обработке данных прямых замеров общепринятыми способами
Значение величины e, определяемое в режиме «on line», может служить в качестве
показателя отклонения от оптимальности физико-химических условий процесса и использоваться в задачах оптимизации составов питательных сред и режимов культивирования.
Литература
1. Hospodka J. Oxygen-absorption rate-controlled feeding of substrate in to aerobic microbial cal-tures//Biotechnol. And Bioeng. 1966.№ 8. Р. 117 - 134.
2. Еникеев Ш.Г., Мухачев С.Г., Литвиненко Л.А., Шкидченко А.Н. Качественная модель квазине-прерывного способа культивирования дрожжей Candida utilis//B сб.: Применение математических методов в микробиологии. Пущино: АН СССР, 1975. С. 229 - 239.
3. Мухачев С.Г., Валеев Р.И., Еникеев Ш.Г. Алгоритм управления процессом культивирования аэробных микроорганизмов на основе данных о потреблении кислорода// В сб.: Автоматизация микробиологических процессов. Рига: «Зинатне», 1982. С. 40 - 43.
4. Pirt S.J. The maintenance energy of bacteria in growing cultures//Proc. Roy. Soc. 1965. №163. Р. 224-231.
5. Stouthamer A.H., Bettenhaussen C.W. Utilisation of energy for growth and maintenance in continuous and batch cultures of microorganisms: a reevaluation of the method for the determination of ATP production by measuring molar growth yields//Biochim. et biophys. Acta. 1973. 301. №1. Р. 53 - 70.
6. Stouthamer A.H. A theoretical study on the amount of ATP required for synthesis of microbial cell material// Antonio van Leeuwenhoek J. Microbiol. and Serol. 1973., 39, №3. Р. 545 - 565.
7. Еникеев Ш.Г., Валеев Р.И., Мухачев С.Г. Энерго-материальный баланс и показатели роста аэробных гетеротрофов//В сб.: 3-й симпозиум социалистических стран по биотехнологии. Братислава, 1983. А.4-16.
8. Минкевич И.Г. Физико-химические основы материально-энергетического баланса роста микроорганизмов// В Сб.: Лимитирование и ингибирование микробиологических процессов. Пущино: Изд-е АН СССР, 1980. С.55 - 91.
9. Шевченко В.Т., Печуркин Н.С. Гидромеханический способ гашения пены в ферментерах// Сб.: Управляемый биосинтез и биофизика популяций. II всесоюзное совещание 26/VI - 7/VII 1969. Красноярск: 1969, С.230 - 231.
10. Еникеев Ш.Г. и др. Получение микробной биомассы на основе этилового спирта: Метод. указания к учебно-исследовательскому лабораторному практикуму/ Казань: КХТИ, 1983. 32 с.
11. Минкевич И.Г., Митрохина Н.А. Определение скоростей физиологических процессов в культурах метанотрофных микроорганизмов методом газового баланса// Биотехнология. 1987. Т.3. № 4. С. 503 -507.
12. Watteuw C.M., Armiger W.B., Ristroph P.L., Humphrey A.E. Production of Single Cell Protein from Ethanol by Fed-Baich Process// Biotechnol. and Bioeng. 1979. 21,7. Р.1221 - 1237.
13. Минкевич И.Г., Ерошин В.К. Расход кислорода и воды при росте микроорганизмов// Изв. АН СССР. 1972. №2. С. 245 - 254.
14. Справочник химика. М.-Л.: Гос. науч.-техн. изд-во хим. литературы, 1962. Т.1. 1072 с.
15. МанаковМ.Н. Стехиометрия и энергетика биосинтеза//Прикладная биохимия и микробиология. 1981. XVII. Вып.3, С.375-379.
16. Ленинджер А. Биохимия. Молекулярные основы структуры и функций клетки. М.: Мир, 1974. 959 с.
17. Минкевич И.Г., Ерошин В.К., Алексеева Т.А., Терещенко А.П. Элементный состав и энергосодержание биомассы микроорганизмов// Микробиологическая промышленность. 1977.Вып.2 (144), С. 1 - 4.
© С. Г. Мухачев - канд. техн. наук, докторант каф. химической кибернетики КГТУ.
