CC BY
115
f Январь - Март 2014
©КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 579.222
£ Влияние состава питательных сред
на протеолитическую активность ф глубинных культур Bacillus subtilis ВКПМ 2335
I и Bacillus licheniformis ВКПМ2336
^ М.Г. Щербаков, А.А. Ильязов, М.Ю. Шапошникова, П.Г. Васильев, В.И. Фролов,
Р.В. Котельников
Научно-исследовательский центр Федерального государственного бюджетного учреждения S «48 Центральный научно-исследовательский институт» Министерства обороны Российской
^ Федерации, Екатеринбург, Россия
Influence of culture media on the concentration of proteolytic enzymes in submerged culture supernatant Bacillus subtilis VKPM2335 and Bacillus licheniformis VKPM2336
M.G. Shcherbakov, A.A. Ilyazov, M.Y. Shaposhnikova, P.G. Vasiliev, V.I. Frolov, R.V. Kotelnikov
Research Center of Federal State Budgetary Institution «48 Central Research Testing Institute» of the
Ministry of Defence of the Russian Federation, Yekaterinburg, Russia f->\
Протеолитические ферменты бацилл используются для создания лечебно-профилактических препаратов. В зависимости от состава питательной среды, на которой осуществляется глубинное культивирования микроорганизмов, находится количественное содержание таких ферментов в культуральной жидкости и, соответственно, эффективность препаратов. Целью данных исследований было изучение влияния состава питательных сред, используемых при глубинном культивировании бацилл B. subtilis ВКПМ 2335 и B. licheniformis ВКПМ 2336 на протеолитическую активность соответствующих культуральных жидкостей. Культивирование проводили в ферментерах БИОР (Россия) объемом 0,25 м3 с коэффициентом заполнения 0,6. Протеолитическую активность культуральных жидкостей определяли на момент окончания цикла культивирования микроорганизмов. Установлено, что концентрации протеолитических ферментов в культуральных жидкостях, полученных с использованием питательных сред различного состава, может отличаться более, чем в два раза. Наибольшая протеолитическая активность у культуральной жидкости B. licheniformis ВКПМ2336наблюдается при использовании питательной среды на основе гидролизата соевой муки. Для большего выхода протеолитических ферментов B. subtilis ВКПМ 2335 предпочтительнее использовать питательную среду на основе гидролизата казеина.
Ключевые слова: культуральная жидкость; протеолитическая активность; питательная среда; гидролизат; казеин, B. subtilis ВКПМ 2335; B. licheniformis ВКПМ 2336, ферментер БИОР.
Библиографическое описание: Щербаков МГ, Ильязов АА, Шапошникова МЮ, Васильев ПГ, Фролов ВИ, Котельников РВ. Влияние состава питательных сред на протеолитическую активность глубинных культур Bacillus subtilis ВКПМ 2335 и Bacillus licheniformis ВКПМ 2336. Биопрепараты 2014; 1(49): 36-39.
Proteolytic enzymes of bacilli are often used for production of therapeutic and preventive drug products. The efficacy of such products depends on the enzyme content in culture media, which in turn is related to the media's composition. The aim of this paper was to study relation between the composition of culture media used in submerged cultivations of B. subtilis VKPM 2335 and B. licheniformis VKPM 2336 and proteolytic activity of the corresponding culture fluid. Cultivation was conducted in BIOR bioreactor (Russia), internal volume - 0,25 m3, fill factor - 0,6. Proteolytic activity of the culture fluids was determined at the end of the cultivation cycle. It was shown, that proteolytic enzyme concentration in culture fluids obtained using culture media of different composition can show twofold difference. The highest proteolytic activity of B. licheniformis VKPM2336 culture fluid was obtained using soya flour hydrolysate culture medium. It is recommended to use caseine hydrolysate to increase B. subtilis VKPM 2335 proteolytic enzymes yield.
Key words: culture fluid; proteolytic activity; culture media hydrolisate; casein, B. subtilis VKPM 2335; B. licheniformis VKPM . 2336; bioreactor BIOR.
IT)
ПРЕПАРАТЫ
/-;- - - - — - -\
Bibliographic description: Shcherbakov MG, IlyazovAA, Shaposhnikova MY, Vasiliev PG, Frolov VI, Kotelnikov RV. Influence of culture media on the concentration of proteolytic enzymes in submerged culture supernatant Bacillus subtilis VKPM 2335 and Bacillus licheniformis VKPM 2336. Biopreparation (Biopharmaceuticals) 2014; 1(49): 36-39.
Бациллы синтезируют большое количество биологически активных веществ. Среди них ферменты, различные по механизму действия антибиотики, полиса-харидные и других комплексы, характеризующиеся адъювантными свойствами, а также предшественники биологически активных аминов, аминокислот, белков и многие другие соединения [1-5]. На их основе сконструированы лечебно-профилактические препараты [6, 7]. Содержание ферментов в таких препаратах обеспечивает их терапевтическую активность. Ферменты обладают противовоспалительным, противомикроб-ным, антикоагуляционным, дегидратационным, антитоксическим действием [8]. Особенно перспективными в клинической практике являются протеолитические ферменты, как вещества способные эффективно лизи-ровать клеточные стенки патогенных бактерий [9], а также обладающие антитоксическим действием [10].
При глубинном культивировании микроорганизмов рода Bacillus большое значение для спорообразования бацилл, синтеза ферментов и накоплении их в культу-ральной жидкости имеют факторы питательной среды: ее состав, концентрация водородных ионов, температура, следовые количества некоторых веществ - ингибиторов [11]. Принимая во внимание перспективные свойства синтезируемых бациллами протеолитических ферментов, представляется актуальным вопрос количественного содержания их в культуральной жидкости в зависимости от состава питательной среды, на которой осуществляется глубинное культивирования микроорганизмов.
Целью данных исследований было изучение влияния состава питательных сред, используемых при глубинном культивировании бацилл B. subtilis ВКПМ 2335 и B. licheniformis ВКПМ 2336 на протеолитическую активность соответствующих культуральных жидкостей.
Материалы и методы
В работе использовали спорообразующие микроорганизмы Bacillus subtilis ВКПМ 2335 и Bacillus licheniformis ВКПМ 2336, депонированные в ГНЦ РФ ФГУП ГосНИИгенетика. Биологические, морфологические, тинкториальные свойства штаммов и условия хранения в полной мере соответствовали характеристикам, указанным в паспортах.
Культивирование проводили в ферментерах БИОР (Россия) объемом 0,25 м3 с коэффициентом заполнения 0,6. Биореакторы были оснащены магнитными перемешивающими устройствами, фильтрами тонкой очистки воздуха, датчиками температуры, скорости перемешивания и расхода воздуха на аэрацию.
Для глубинного культивирования использовали питательные среды на основе гидролизата соевой муки и гидролизата казеина. Все питательные среды содержали набор солей, обеспечивающих потребность вегетативных и спорулирующих бактерий в ионах Fe3+,
Мд2+, Са2+, Na+, Мп2+. В качестве источника углерода в составе всех вышеперечисленных питательных сред использовали глюкозу.
Протеолитическую активность культуральных жидкостей В. subtilis ВКПМ 2335 и В. lichehiformis ВКПМ 2336 определяли на момент окончания цикла культивирования микроорганизмов путем измерения скорости ферментативной реакции гидролиза казеина под воздействием протеолитических ферментов, оцениваемой по количеству образовавшегося тирозина. Концентрацию тирозина определяли колориметрическим методом с использованием реактива Фолина [11].
Биологическую концентрацию микроорганизмов в культуральной жидкости (кл/мл) определяли методом последовательных десятикратных разведений испытуемого микробного препарата в 0,9% растворе натрия хлорида с последующим высевом на чашки Петри и подсчетом выросших колоний.
Величину рН определяли потенциометрическим методом с применением универсального иономера.
Результаты и обсуждение
При глубинном культивировании аэробных микроорганизмов рода Bacillus почти все углеводы потребляются ими путем окисления. В процессе роста культуры в питательной среде накапливаются промежуточные продукты окисления, такие, как кетокислоты, ди- и трикарбоновые кислоты, альдегиды. В процессе жизнедеятельности микроорганизмов в результате потребления катионов или анионов питательной среды происходит либо подщелачивание, либо подкисление культуральной жидкости.
Величина рН культуральной жидкости на момент окончания цикла глубинного культивирования штаммов B. subtilis ВКПМ 2335 и B. licheniformis ВКПМ 2336 зависит от метаболизма конкретного вида микроорганизма, а также от интенсивности процессов роста, развития и спорообразования.
Сравнительное изучение ферментативной активности культуральной жидкости B. subtilis ВКПМ 2335 с использованием для глубинного культивирования различной основы питательных сред (табл. 1), показало, что протеолитическая активность культуральной жидкости B. subtilis ВКПМ 2335 зависит от величины рН при равных показателях биологической активности. Так, культуральная жидкость, полученная при использовании питательной среды на основе гидролизата казеина при величине рН 5,6 имела большую протеолитическую активность по сравнению с культуральной жидкостью, полученной при использовании питательной среды на основе гидролизата соевой муки при рН 6,7.
Результаты экспериментов, представленные в таблице 2, показывают более чем в 2 раза большую
G
- Март 2014
Таблица 1. Протеолитическая активность культуральной жидкости B. subtilis ВКПМ 2335
Показатель Питательная среда на основе....
гидролизата казеина гидролизата соевой муки
Содержание жизнеспособных микроорганизмов в культуральной жидкости, кл/мл (1,2±0,3)х109 (1,5±0,2)х109
рН, ед. рН 5,6±0,3 6,7±0,5
Протеолитическая активность, ед/мл (6,5±0,5)х10-3 (2,5±0,5)х10-3
Таблица 2. Протеолитическая активность культуральной жидкости B. licheniformis ВКПМ 2336
Показатель Питательная среда на основе..
гидролизата казеина гидролизата соевой муки
Содержание жизнеспособных микроорганизмов в культуральной жидкости, кл/мл (4,5±0,5)х109 (4,5±1,2)х109
рН, ед. рН 7,1±0,1 7,0±0,2
Протеолитическая активность, ед/мл (5,8±1,1)х10-3 (12,5±0,5)х10-3
протеолитическую активность культуральной жидкости B. licheniformis ВКПМ 2336, полученной при использовании питательной среды на основе гидролизата соевой муки. При этом значение рН культуральной жидкости B. licheniformis ВКПМ 2336 при использовании различных основ питательных сред было равным. Это свидетельствует о содержании ингибиторов протео-литических ферментов в питательной среде на основе гидролизата казеина при глубинном культивировании B. licheniformis ВКПМ 2336.
При сравнении культуральных жидкостей различных штаммов используемых бацилл большая протеолитическая активность была установлена у B. licheniformis ВКПМ 2336 при использовании питательной среды на основе гидролизата соевой муки. Значения показателей протеолитической активности культуральных жидкостей с использованием этой питательной среды выше в 5 раз, чем у B. subtilis ВКПМ 2335. При использовании питательной среды на основе гидролизата казеина протеолитическая активность культуральных жидкостей B. subtilis ВКПМ 2335 и B. licheniformis ВКПМ 2336 была близка по значению.
Выводы
Таким образом, в экспериментальных работах было установлено, что состав питательных сред, используемых для глубинного культивирования B. subtilis ВКПМ 2335 и B. licheniformis ВКПМ 2336 значительно влияет на синтез этими микроорганизмами протеолитических ферментов. Количественное содержание протеолитических ферментов в культуральных жидкостях B. subtilis ВКПМ 2335 и B. licheniformis ВКПМ 2336, полученных с использованием питательных сред различного состава может отличаться более, чем в два раза. С целью максимального получения протеолитических ферментов в культуральной жидкости на момент окончания цикла глубинного культивирования B. subtilis ВКПМ 2335 предпочтительнее использовать питательную среду на основе гидролизата казеина; в культуральной жидкости B. licheniformis ВКПМ 2336 - питательную среду на основе гидролизата соевой муки.
Литература:
1. Смирнов ВВ, Резник СР, Василевская ИА. Спорообразу-ющие аэробные бактерии-продуценты биологически активных веществ. Киев: Наукова Думка; 1982.
2. Пирузян ЛА, Михайловский ЕМ. Сапрофитная микрофлора в качестве продуцента биологически активных веществ для целей микробной сапрофитной фармакотерапии. Микробиология 1992; 6:860-9.
3. Смирнов ВВ, Резник СР. Бактерии рода Bacillus - продуценты антибиотиков. В кн.: Проблемы изыскания и биотехнологии новых антибиотиков. М.; 1982. С. 53-57.
4. Слабоспицкая АТ, Крымовская СС, Резник СР. Ферментативная активность бацилл, перспективных для включения в состав биопрепаратов. Микробиологический журнал 1990; 52(2): 9-14.
5. Безбородов АМ, Астапович НИ. Секреция ферментов у микроорганизмов. М.: Наука; 1984.
6. Коррекция нарушений кишечного микробиоценоза про-биотиком на основе природного адсорбента. Методические рекомендации. СПб.: СПбГМА; 2006.
7. Топчий НВ. Проблема дисбиоза в общей врачебной (семейной) практике. Фарматека 2007; 8/9: 59-66.
8. Вольф М, Рансбергер К. Лечение ферментами. М.: Мир; 1976.
9. Takahara Y, Hirose Y, Yasuda N. Effects of peptidelipids produced by Bacillus on the enzymatic lysis of gram-negative bacterial cells. Agric Biol Chem 1976; 40(9): 1901-3.
10. Varsha S, Perekh LJ. Bacterial degradation of antinutritional factors: isolation of trypsin inhibitor and hemagglutinin degrading bacteria from rat small intestine. Indian J Microbiol 1984; 24: 149-51.
11. Рухлядева АП, Полыгалина ГВ. Методы определения активности гидролитических ферментов. М.: Пищевая промышленность; 1981.
References
1. Smirnov VV, Reznik SR, Vasilevskaya IA. Aerobic spore-forming bacteria-producers of biologically active substances. Kiev: Naukova Dumka; 1982 (in Russian).
2. Piruzyan LA, Mihaylovsky EM. Saprophytic microflora as a producer of biologically active substances for microbial saprophytic pharmacotherapy. Mikrobiologiya1992; 6:860-9 (in Russian).
3. Smirnov VV, Reznik SR. Bacteria of the species Bacillus - producers of antibiotics. In: Problems of finding and
ПРЕПАРАТЫ
biotechnology of new antibiotics. Moscow; 1982. P. 53-57 (in Russian).
4. Slabospitskaya AT, Krymovskaya SS, Reznik SR. The enzymatic activity of bacilli promising for inclusion in the biologic medical products. Mikrobiologichesky journal 1990; 52(2): 9-14 (in Russian).
5. Bezborodov AM, Astapovich NI. Secretion of enzymes in microorganisms. Moscow: Nauka; 1984 (in Russian).
6. Correction of disorders of intestinal microbiocenosis by probiotic based on natural adsorbent. Guidelines. Saint Petersburg: SPbGMA; 2006 (in Russian).
7. Topchiy NV.Dysbiosis problem in general (family) practice. Farmateka 2007; 8/9:59-66 (in Russian).
8. Volf M, RansbergerK.Treatment with enzymes. Moscow: Mir; 1976 (in Russian).
9. Takahara Y, Hirose Y, Yasuda N. Effects of peptidelipids produced by Bacillus on the enzymatic lysis of gram-negative bacterial cells. Agric Biol Chem 1976; 40(9): 1901-3.
10. Varsha S, Perekh LJ. Bacterial degradation of antinutritional factors: isolation of trypsin inhibitor and hemagglutinin degrading bacteria from rat small intestine. Indian J Microbiol 1984; 24: 149-51.
11. Ruhlyadeva AP, Polygalina GV. Methods for determining of the activity of hydrolytic enzymes. Moscow: Pische-vaya promyshlennost; 1981 (in Russian).
Authors:
Research Center of Federal State Budgetary Institution «48
Central Research Testing Institute» of the Ministry of Defence of
the Russian Federation. 1 Zvezdnaya street, Ekaterinburg, 620085,
Russian Federation.
Shcherbakov MG. Head of the Research Center. Doctor of
Technical Sciences, professor.
Ilyazov AA. Deputy Head of the Research Center for research work. Candidate of Biological Sciences, docent.
Shaposhnikova MY. Senior researcher. Candidate of Biological Sciences.
Vasiliev PG. Chief researcher. Doctor of Biological Sciences, Candidate of Medical Sciences, professor.
Frolov VI. Head of department. Candidate of Biological Sciences.
Kotelnikov RV. Senior researcher. Об авторах:
Научно-исследовательский центр Федерального государственного бюджетного учреждения «48 Центральный научно-исследовательский институт» Министерства обороны Российской Федерации, Российская Федерация, 620085, Екатеринбург, Звездная ул., 1
Щербаков Михаил Геннадьевич. Начальник Научно-исследовательского центра, д-р техн. наук, профессор.
Ильязов Айрат Арсланович. Заместитель начальника Научно-исследовательского центра по научно-исследовательской работе, канд. биол. наук, доцент.
Шапошникова Марина Юрьевна. Научный сотрудник, канд. биол. наук.
Васильев Петр Геннадьевич. Главный научный сотрудник, д-р биол. наук, канд. мед. наук, профессор.
Фролов Владимир Иванович. Начальник отдела, канд. биол. наук.
Котельников Роман Вячеславович. Старший научный сотрудник.
Адрес для переписки:
Васильев Петр Геннадиевич; [email protected]
Поступила 24.01.2014 г.
Принята 21.03.2014 г.
