CC BY
163
doi: 10.24411/0235-2451-2020-10719 УДК636.085.16
Изучение возможности использования «диких» штаммов бактерий как возможных продуцентов витамина В12 (кобаламина)*
М. В. МАРЧЕНОК12, А. Б. ПОДВОЛОЦКАЯ12, Е. С. ФИЩЕНКО12
1ООО «Арника», ул. Енисейская, 23б, Владивосток, Приморский край, 690039, Российская Федерация
2Дальневосточный федеральный университет, ул. Суханова, 8, Владивосток, Приморский край, 690091, Российская Федерация
Резюме. Исследования проводили с целью поиска новых перспективных микробных продуцентов витамина В12 для его синтеза. Осуществляли скрининг восьми «диких» штаммов микроорганизмов, выделенных из растениеводческой продукции, как возможных продуцентов кобаламинов: 1 - Pseudomonas aeruginosa, 1 - Bacillus subtilis, 2 - Bacillus circulans, 3 - Pseudomonas fluorescens, 1 -Pseudomonasdenitrificans. На первом этапе их оценивали по накоплению биомассы в одинаковых условиях культивирования. Преимуществом по величине этого показателя в аэробных условиях обладали штаммы B. subtilis В1 и P. denitrificans Р5: выход сухой биомассы в среднем составил соответственно 11,2 г/л и 12,6 г/л. На втором этапе изучали динамику накопления биомассы бактерий по показателю оптической плотности в зависимости от используемых источников углеводов (сахароза, глюкоза, мальтоза). Результаты на средах с глюкозой и мальтозой статистически не различались: соответственно 2,52 и 2,46 отн. ед. для P. denitrificans Р5 и 2,50 и 2,49 отн. ед. для B. subtilis В1. На питательных средах с добавлением сахарозы накапливалось достоверно меньше биомассы. На третьем этапе работы после окончания ферментации проводили измерение концентрации кобаламинов в клеточных экстрактах c помощью ВЭЖХ. Штамм B. subtilis В1 продуцирует 0,037 мг/мл цианокобаламина, P. denitrificans Р5 - 0,042 мг/мл. Учитывая технологическую сложность процесса культивирования B. subtilis (чередование аэробных и анаэробных фаз) для дальнейших исследований предпочтительнее использовать штамм P. denitrificans.
Ключевые слова: продуцент, питательная среда, кобаламин, витамин B12 B. subtilis, P. denitrificans.
Сведения об авторах: М. В. Марченок, аспирант, биоинженер-исследователь (e-mail: marchenok_mv@dvfu.ru); А. Б. Подволоцкая, кандидат медицинских наук, доцент (e-mail: podvolotckaia.ab@dvfu.ru); Е. С. Фищенко, кандидат технических наук, доцент (e-mail: fischenko. es@dvfu.ru).
Для цитирования: Марченок М. В., Подволоцкая А. Б., Фищенко Е. С. Изучение возможности использования «диких» штаммов бактерий как возможных продуцентов витамина В12 (кобаламина) // Достижения науки и техники АПК. 2020. Т 34. № 7. С. 109-113. doi: 10.24411/0235-2451-2020-10719.
*Работа выполнена при финансовой поддержке Минпромторга России, Соглашение № 020-11-2018-1290 от24 декабря 2018 г.
Study of the possibility of using «wild» bacterial strains as possible producers of vitamin B12 (cobalamin)
M. V. Marchenok1,2, A. B. Podvolotskaya12, E. S. Fishchenko12
1Arnika, ul. Eniseiskaya, 23b, Vladivostok, Primorskii krai, 690039, Russian Federation
2Far Eastern Federal University, ul. Sukhanova, 8, Vladivostok, Primorskii krai, 690091, Russian Federation
Abstract. The purpose of the study was to find new promising microbial producers of vitamin B12 for its synthesis. We screened eight "wild" strains of microorganisms isolated from crop production as possible producers of cobalamins: 1 - Pseudomonas aeruginosa, 1 - Bacillus subtilis, 2 - Bacillus circulans, 3 - Pseudomonas fluorescens, 1 - Pseudomonas denitrificans. At the first stage, they were assessed by the accumulation of biomass under the same cultivation conditions. Strains B. subtilis B1 and P. denitrificans P5 had an advantage in terms of this indicator under aerobic conditions: the yield of dry biomass averaged 11.2 g/L and 12.6 g/L, respectively. At the second stage, the dynamics of bacterial biomass accumulation was studied in terms of optical density, depending on the sources of carbohydrates used (sucrose, glucose, maltose). The results on media with glucose and maltose did not differ statistically: 2.52 relative units (RU) and 2.46 RU for P. denitrificans P5 and 2.50 RU and 2.49 RU for B. subtilis B1. Significantly less biomass accumulated in nutrient media with the addition of sucrose. At the third stage, after fermentation, the concentration of cobalamins in cell extracts was measured using HPLC. B1 strain of B. subtilis produced 0.037 mg/mL of the cyanocobalamin; P5 strain of P. denitrificans produced 0.042 mg/mL. Considering the technological complexity ofthe B. subtilis cultivation process (alternation of aerobic and anaerobic phases), it is preferable to use the P. denitrificans strain for further research. Keywords: producer; nutrient medium; cobalamin; vitamin B12; Bacillus subtilis; Pseudomonas denitrificans.
Author Details: M. V. Marchenok, post graduate student, research bioengineer (e-mail: marchenok_mv@dvfu.ru); A. B. Podvolotskaya, Cand. Sc. (Med.), assoc. prof. (e-mail: podvolotckaia.ab@dvfu.ru); E. S. Fishchenko, Cand. Sc. (Tech.), assoc. prof. (e-mail: fischenko.es@dvfu.ru). For citation: Marchenok MV, Podvolotskaya AB, Fishchenko ES. [Study of the possibility of using «wild» bacterial strains as possible producers of vitamin B12(cobalamin)]. Dostizheniya nauki i tekhniki APK. 2020;34(7):109-13. Russian. doi: 10.24411/0235-2451-2020-10719.
Отрасль животноводства напрямую зависит от состояния кормовой промышленности в целом. В свою очередь, от спроса на продукты животноводства зависит потребность в кормовых добавках, различные ингредиенты для которых (аминокислоты, витамины, ферменты, пробиотики и др.) Россия импортирует, прежде всего, из Китая [1].
В современных условиях использование витаминов и аминокислот - одно из наиболее важных звеньев в цепочке ветеринарных и зоотехнических мероприятий, направленных на получение высокопродуктивного поголовья сельскохозяйственных животных. Большинство витаминов не накапливаются в организме, при этом потребность в них в процессе выращивания животных возрастает [2].
Витамин B12 (кобаламин) - один из факторов роста и развития сельскохозяйственных животных и птиц, он способствует усвоению аминокислот и активизации белкового обмена. Недостаточная обеспеченность свиней, птицы, молодняка жвачных животных витамином В12 вызывает у них злокачественную анемию, сопровождающуюся резким снижением продуктивности, прекращением роста и полным истощением организма из-за низкого усвоения белков и кормов растительного происхождения [3].
Коммерческая форма кобаламинов - цианокобаламин, его используют в концентрации 0,1 % или 1 % для всех категорий и видов животных, вводят с кормом или водой (Commission Regulation (EU) 37/2010). Производители, как правило, указывают в спецификациях уровень потребления активного вещества от 10 до 100 мкг/кг корма.
Компания Merck начала производство витамина B12 с использованием бактерии Pseudomonas denitrificans в 1952 г. в присутствии ионов кобальта и 5,6-диметилбензимидазола, в дополнении к таким прекурсорам как глицин, треонин и аминопропанол. Позднее, благодаря использованию молекулярно-генетических методов и случайному мутагенезу, выход витамина удалось увеличить более чем в 30 раз [4].
Ведущие производители витамина B12 - это Китай, США, Япония и страны Европы [5]. Рынок очень сильно зависит от производителей сырья и крупных биотехнологических компаний, выпускающих кормовые витамины [6].
Российская комбикормовая промышленность и животноводство в целом вынуждены использовать витамины иностранного производства, цены на которые очень сильно зависят от курса рубля к доллару. Повышение цен на витамины отрицательно сказывается на производителях кормовых премиксов (затраты на эти компоненты превышают 80 % себестоимости премиксов). Наиболее значимы в ценообразовании витамины A, E, B2, ниацин (PP, или B3) и кальпан (D-пантотеновая кислота, витамин B5) [7]. Улучшить ситуацию на рынке может развитие отечественного производства.
Незначительное количество российских охранных документов, посвященных микробиологическим способам получения цианокобаламина, можно связать с отсутствием на территории РФ биотехнологических производств кормового витамина B12. Хотя коллекции промышленных микроорганизмов в нашей стране до сих пор представляют научный, промышленный и коммерческий интерес [6].
Если использовать микроорганизмы-продуценты и проводить последующую ферментацию субстратов с добавлением в питательные среды предшественников витамина B12, можно синтезировать кобаламины в несколько стадий, тогда как химический синтез достаточно сложен и включает в себя порядка 70 стадий [8]. Поэтому для производства кобаламинов в коммерческих целях используют именно микробиологические способы.
Основные микроорганизмы, продуцирующие витамин B12 для коммерческого производства - P. denitrificans, Bacillus megaterium, Propionibacterium freudenreichii и Propionibacterium shermanii. Объем синтезированного витамина B12 с использованием этих продуцентов в процессе ферментации может превышать 200 мкг на 1 мл постферментационной жидкости [9, 10, 11]. Например, бактерии P. denitrificans способны синтезировать витамин В12 в концентрации 214 мг/л [12], Sinorhizobium meliloti - 156 мг/л [13], P. shermanii - 206 мг/л [14]. Многие из этих микроорганизмов имеют свои недостатки, к числу которых можно отнести длительные циклы брожения, сложные и дорогие среды для культивирования, а также отсутствие подходящих генетических систем для инженерии штаммов [15, 16, 17].
В целом, штаммы, применяемые в биотехнологии для синтеза витамина В12, должны отвечать следующим требованиям: расти на простых питательных средах, обладать высокой энергией роста, иметь опероны синтеза кобаламинов [10, 18].
Цель исследований - поиск новых перспективных микробных продуцентов витамина В12 для его синтеза.
Условия, материалы и методы. Работу проводили на базе R&D центра ООО «Арника» и Инновационного технологического центра Дальневосточного федерального университета с декабря 2019 г. по март 2020 г. В исследовании использовали дикие штаммы, выделенные из растениеводческой продукции (плоды, овощи, ягоды): Pseudomonas ssp. и Bacillus ssp. Всего изучали 8 штаммов перспективных бактерий-продуцентов, ассоциированных
с пищевыми продуктами: 1 - Pseudomonas aeruginosa, 1 - Bacillus subtilis, 2 - Bacillus circulans, 3 - Pseudomonas fluorescens, 1 - P. denitrificans. Культуры выделяли и первоначально идентифицировали классическими методами с дальнейшим подтверждением по стандартному протоколу секвенирования и анализа последовательностей нуклеотидов участка 16S рРНК [19].
Исследование проводили в три этапа. На первом этапе определяли выход биомассы бактерий на универсальной среде Luria Broth (HiMedia) (LB). На втором этапе изучали зависимость накопления биомассы от источника углеводов у двух отобранных на первом этапе штаммов B. subtilis и P. denitrificans. На третьем этапе проводили ферментацию с использованием выбранных штаммов на питательных средах, оптимизированных по углеводу, и оценивали выход витамина В12.
Для определения выхода биомассы на первом этапе колонии чистых культур инокулировали в колбы Эрлен-мейера общим объемом 0,1 л, содержащие 0,05 л жидкой питательной среды Luria Broth (HiMedia). Культивирование проводили в шейкер-инкубаторе ES-20 Biosan при температуре 30 °С и перемешивании 200 об/мин в течение 18 ч. По окончании инкубирования материал центрифугировали при 8000 об/мин. Супернатанты удаляли, а осадки высушивали в одинаковых условиях при 110 °C в течение 5 ч с последующим взвешиванием. После чего выбрали два штамма с максимальными показателями прироста биомассы.
На втором этапе подготовленные к инокуляции и стандартизованные по стандартумутности МакФарланда (5 ед.) суспензии отобранных культур засевали в соотношении 1:4 в колбы Эрленмейера общим объемом 500 мл, содержащие 0,2 л жидкой питательной среды. При работе с разными родами использовали различные варианты сред для подращивания культуры и ферментации:
для штамма B. subtilis 1 л среды включал 30 г углевода, 5 г глицерина, 24 г дрожжевого экстракта, 12 г триптона, 3 г MgSO4 ■ 7H2O, 3 г CaCO3, 17 mM KH2PO4, 72 mM K2HPO4; pH = 6,8 ед.
для штамма P. denitrificans 1 л среды содержал 30 г углевода, 10 г пептона; 5 г KH2PO4; 2,3 г (NH4)2SO4; 0,7 г (NH4)2HPO4; 0,2 г MnSO4 ■ H2O; 1,5 г MgSO4; 0,02 г ZnSO4 ■ 7H2O; pH = 7,0...7,2 ед.
В эксперименте использовали три варианта питательной среды для каждого вида бактерий, отличавшиеся добавлением одного из трех углеводов: глюкоза (3 %), сахароза (3 %), мальтоза (3 %).
Штаммы культивировали 25 ч на шейкер-инкубаторе при 30 °С и 300 об/мин. С самого начала инкубации каждые 4 ч отбирали пробы и измеряли оптическую плотность на спектрофотометре Shimadzu UV-1800. После ее стабилизации в трех последовательных измерениях (различия не более 5 %) культивирование останавливали и определяли содержание биомассы. Накапливаемую биомассу учитывали косвенным методом по разнице единиц оптической плотности в начале и в конце эксперимента. В динамике периодического роста определяли биомассу штаммов по показателю оптической плотности (ОП) суспензии при 600 нм с длиной оптического пути 0,7 см.
На третьем этапе исследования микроорганизмы подращивали на питательных средах с углеводом, отобранным на втором этапе. Культивирование штамма B. subtilis проводили в колбах Эрленмейера 12 ч при 30 °С и 180 об/ мин. Затем проводили ферментацию с использованием культуры B. subtilis при 30 °С, 24 ч в анаэробных условиях и 12 ч с полной аэрацией, 180 об/мин., в модифицированной среде TB (Terrific broth, Thermo Fisher). Состав среды на 1 л: 30 г глюкозы, 5 г глицерина, 24 г дрожжевого экстракта,
Таблица 1. Выход сухой биомассы штаммов-продуцентов, исследованных на первом этапе, Mср ± m
Штамм Микроорганизм Выход сухой биомассы, г/л
B1 B. subtilis 11,20 ± 0,09
B2 B. circulans 9,32 ± 0,09
B3 B. circulans 7,24 ± 0,09
P1 P. fluorescens 9,50 ± 0,04
P2 P. fluorescens 5,70 ± 0,08
P3 P. fluorescens 8,30 ± 0,06
P4 P. aeruginosa 8,90 ± 0,03
P5 P. denitrificans 12,60 ± 0,07
12 г триптона, 3 г MgSO4 ■ 7H2O, 3 г CaCO3, 17 mM KH2PO4, 72 mM K2HPO4, 100 мг CoCl2 -6H2O, 100 мг ALA, 100 мг 5,6-DMB; pH 6,8 ед.
Подращивание культуры штамма P. denitrificans проводили при 30 °С в шейкер-инкубаторе при 180 об/мин в течение 20 ч. Для основного процесса ферментации использовали жидкую среду следующего состава (г/л): глюкоза - 260; пептон - 40; бетаин - 20; (NH4)2SO4 - 1; MgSO4 -1,5; KH2PO4 - 0,75; ZnSO4 ■ 7H2O - 0,08; CoCl2 ■ 6H2O - 0,14; 5,6-DMB - 0,075, pH = 7,2-7,4. Ферментацию проводили при 32 °С в колбах Эрленмейера в шейкер-инкубаторе при 180 об/мин в течение 120 ч.
Культуры вносили во все питательные среды в пропорции 1:10, где 1 - объем посевного материала, 10 - объем среды. По окончании процесса ферментации измеряли концентрацию кобаламинов в пробах постферментационной жидкости.
Рис. 1. Рост штамма P. denitrificans Р5 в периодическом режиме культивирования: —среда с мальтозой; □ -среда с глюкозой; —- среда с сахарозой.
Содержание витамина В12 определяли методом ВЭЖХ. Образец бульона (25 мл), к которому добавляли 2,5 мл 8%-ного (w/v) NaNO2 и 2,5 мл ледяной уксусной кислоты, кипятили в течение 30 мин. Затем смесь фильтровали через мембранный фильтр 0,45 мкм и к 1 мл водной фазы добавляли 20 мкл 10%-ного NaCN (w/v) для преобразования коферментных форм витамина B12 в цианокобаламин. Полученную верхнюю водную фракцию отбирали для анализа. Исследования выполняли на хроматографе Shimadzu LC-20 Prominence, оснащенном детектором на диодной матрице. Разделение смеси проводили на обращенно-фазовой колонке С18 (Supelco), 250 х 4,6 мм, 5 мкм. В качестве подвижной фазы использовали смесь 250 mM фосфорной кислоты (компонент А) и ацетонитрила (компонент B). Элюирование проводили линейным градиентом от 0 % до 70 % компонента B. Продолжительность анализа составляла 15 мин., скорость потока подвижной фазы 1,7 мл/мин., температура термостата 30 °С. Детектирование осуществляли при длине волны 361 нм. Правильность идентификации соединения подтверждали совпадением времени удерживания пика
витамина в пробе и стандартном растворе цианокобала-мина (Sigma Aldrich).
При анализе результатов экспериментов использовали общепринятые методы статистической обработки данных (Н. А. Плохинский, М., 1978). Эксперименты выполняли в 3...4 независимых повторностях. Достоверность различий сравниваемых средних оценивали с использованием f-критерия Стьюдента при p < 0,05.
Результаты и обсуждение. В природе существуют два пути биосинтеза витамина B12: аэробный, или поздний путь включения кобальта, и анаэробный, или ранний путь включения кобальта в молекулу витамина. Один из генов аэробного пути биосинтеза кобаламина, участвующего в присоединении кобальта - cobN, подробно описанный у P. denitrificans [9]. Наиболее изученный анаэробный путь биосинтеза описан у Salmonella typhymurium [5]. Позднее появились сведения о биосинтезе, независящем от присутствия кислорода, у B. megaterium, Salmonella enterica и P. freudenreichii [18, 20]. Поэтому скрининг перспективных продуцентов В12 проводили преимущественно среди факультативных анаэробных и аэробных бактерий.
Речь идет исключительно о раннем или позднем включении молекул кобальта в процесс биосинтеза, что может в свою очередь влиять на процесс ферментации только с точки зрения времени внесения кобальта и других предшественников в составы сред для ферментации. Концентрацию кобаламинов в клеточных экстрактах целесообразно определять только после окончания процесса ферментации, это относится ко всем исследованным штаммам. Продолжительность ферментации может зависть от многих факторов, один из которых — скорость набора биомассы бактерий.
Известны исследования по биосинтезу витамина B12 с использованием в качестве штамма-продуцента культуры B. megaterium, по результатам которых высокие показатели прироста биомассы не прямо пропорциональны показателям по синтезированному витамину [21]. В то же время для аналогичных исследований с использованием в качестве штамма-продуцента культуры P. denitrificans прирост биомассы сопровождался увеличением объема синтезированного витамина B12 [15]. В своем исследовании мы решили не учитывать возможность повышенного объема синтезируемого витамина B12 на фоне низких показателей прироста биомассы культуры, посколькуработа проводится с разными штаммами двух разных родов бактерий.
По результатам тестирования наибольшим накоплением биомассы отличались штаммы B1 и P5 (табл. 1). Остальные из дальнейшей работы были исключены.
Штаммы B. subtilis В1 и P. denitrificans Р5 в периодической культуре имели сходный характер роста на средах с различными углеводами с четко выраженными фазами роста. У штамма P. denitrificans Р5 на всех средах лаг-фаза была одинаковой. При этом он быстрее вступал в стационарную
Рис. 2. Рост штамма B. subtШs В1 в периодическом режиме культивирования: —среда с мальтозой; □ - среда с глюкозой; —- среда с сахарозой.
Таблица 2. Кинетические характеристики штаммов-продуцентов P. denitrificans Р5 и B. subtilis В1
Штамм Среда Длительность лаг-фазы, ч Время до стационарной фазы, ч Накапливаемая биомасса (M ± m), отн. ед.
P. denitrificans с мальтозой 3 18 2,46 ± 0,04
Р5 с глюкозой 3 17 2,52 ± 0,03
с сахарозой 3 13 1,83 ± 0,03
B. subtilis В1 с мальтозой 3 15 2,49 ± 0,02
с глюкозой 3 19 2,50 ± 0,03
с сахарозой 3 17 1,72 ± 0,06
фазуроста на среде с сахарозой, но увеличение относительной биомассы в этом варианте было гораздо ниже, чем при использовании мальтозы и глюкозы: 1,83 отн. ед. против 2,46 и 2,52 отн. ед. соответственно (см. рис. 1, табл. 2).
Рис. 3. ВЭЖХ хроматограммы клеточных экстрактов штаммов: а) В. виЫШв В1, б) Р. denitrificans Р5; в) стандарт цианокобаламина.
У В. subtilis В1 на среде с использованием мальтозы и глюкозы характер кривых был различным, но относительное конечное количество биомассы через 25 ч статистически не различалось: 2,49 и 2,50 отн. ед., соответственно. При использовании сахарозы ее накопление было значительно меньше - 1,72 отн. ед. (рис. 2, см. табл. 2).
При использовании в качестве компонентов питательных сред рафинированных сахаров объем синтезированного витамина, по данным некоторых исследований, может достигать 200 мг/л, а объем сухой клеточной биомассы составлять приблизительно 30
г/л постферментационной жидкости [15]. Для снижения стоимости производства витамина В12 целесообразна замена очищенных углеводов (сахарозы, глюкозы, мальтозы) на мелассу, сироп или патоку, в состав которых входят перечисленные углеводы.
На третьем этапе исследований штамм Р. denitrificans Р5 достигал стационарной фазы в среднем за 19 ч только в условиях среды для подращивания культуры на первой стадии подготовки предкультуры. После переноса части подрощенной культуры в условия более богатой среды для ферментации (и при большем содержании предшественников витамина В12) рост культуры продолжается до окончания фазы ферментации, о чем может свидетельствовать пропорциональное увеличение оптической плотности на протяжении всех 120 ч ферментации.
Определение содержания цианокобаламина методом ВЭЖХ по окончании процесса ферментации показало, что оба штамма продуцируют кобаламины (рис. 3): В. subtilis В1 - 0,037 мг/мл, штамм Р. denitrificans Р5 - 0,042 мг/мл, что сопоставимо с результатами других исследователей [5, 21, 22].
Увеличение выхода витамина В12 возможно при случайном мутагенезе, в результате обработки штаммов микроорганизмов химическими реагентами или ультрафиолетом. Методами генетической инженерии возможно получить штаммы-продуценты витамина В12, устойчивые к высоким концентрациям токсичных интермедиатов, которые присутствуют в питательной среде [18].
Культивирование В. subtilis более сложное, трехфазное, с чередованием аэробных и анаэробных стадий, в отличие от Р. denitrificans для которого проводится только аэробное культивирование. Работа с Р. denitrificans не требует дополнительных материальных ресурсов для создания анаэробных условий. Это отличие имеет важное значение при выборе штамма для селекции.
Выводы. В результате исследований обнаружены перспективные штаммы В. subtilis и Р. denitrificans, выделенные из растениеводческой продукции, которые можно использовать непосредственно для синтеза кобаламинов и включать в селекционный процесс для отбора более продуктивных форм.
Наибольший прирост сухой клеточной биомассы обоих исследуемых штаммов зафиксирован на средах с использованием глюкозы. В эксперименте со штаммом В. subtilis В1 он составил 2,50 отн. ед., со штаммом Р. denitrificans Р5 - 2,52 отн. ед.
Концентрация витамина В12 в клеточном экстракте штамма В. subtilis В1, выделенном из постферментационной жидкости, была равна 0,037 мг/мл, штамма Р. denitrificans Р5 - 0,042 мг/мл.
Учитывая технологическую сложность процесса культивирования В. subtilis (чередование аэробных и анаэробных фаз) для дальнейших исследований предпочтительнее использовать штамм Р. denitrificans.
Литература.
1. Хализова З. Н., Зыков С. А. Состояние и перспективы развития отрасли кормопроизводства в России // Эффективное животноводство. 2019. № 3. С. 14-18.
2. McDowell L. R. Vitamin nutrition of livestock animals: Overview from vitamin discovery to today//Canadian Journal of Animal Science. 2006. Vol. 86. Is. 2. P. 171-179. doi: 10.4141/A05-057.
3. Нормы и рационы кормления сельскохозяйственныхживотных. Справочное пособие/под ред. А. П. Калашникова, В. И. Фисинина, В. В. Щеглова и др. М.: Знание, 2003.456 с.
4. Survase S. A., Bajaj I. B., Singhal R. S. Biotechnological production of vitamins// Food Technologyand Biotechnology. 2006. Vol. 44. Is. 3. P. 381-396.
5. Fang H., Kang J., Zhang D. Microbial production of vitamin B12: a reviewand future perspectives // Microbial Cell Factories. 2017. Vol. 16. Is. 1. Article 15. doi: 10.1186/s12934-017-0631-y.
6. Грачев Д. Рынок кормовых добавок требует кардинальных перемен//Комбикорма. 2019. № 1. С. 13-16.
7. Лавренова В. Рынок кормовых витаминов // Ценовик. 2019. № 2. C. 26-29.
8. Craig G. W. Total synthesis of vitamin B 12 — A fellowship of the ring // Journal of Porphyrins and Phthalocyanines. 2015. Vol. 20. No. 1. P. 1-20. doi: 10.1142/S1088424615500960.
9. Escalante-Semerena J. C., Warren M. J. Biosynthesis and use of cobalamin (B12) // EcoSal Plus. 2008. Vol. 3. Is. 1. doi: 10.1128/ ecosalplus.3.6.3.8.
10. The metabolic characteristics of high-production vitamin B12 by Pseudomonas denitrificans under dissolved oxygen step-wise reduction / W. Peng, X. Cheng, H. Zhang, et al. // Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 2014. Vol. 89. Is. 9. P. 1396-1401. doi: 10.1002/ jctb.4219.
11. Hedayati R., Hosseini M., Najafpour G. D. Optimization of semi-anaerobic vitamin B12 (cyanocobalamin) production from rice bran oil using Propionibacterium freudenreichii PTCC1674// Biocatalysis and Agricultural Biotechnology. 2020. Vol. 23. Article 101444. doi: 10.1016/j. bcab.2019.101444.
12. An effective and simplified pH-stat control strategy for the industrial fermentation of vitamin B12 by Pseudomonas denitrificans / K.. Li, D. Liu, J. Chu, et al.//Bioprocess and Biosystems Engineering. 2008. Vol. 31. Is. 6. P. 605-610. doi: 10.1007/s00449-008-0209-5.
13. Engineering a vitamin B12 high-throughput screening system by riboswitch sensor in Sinorhizobium meliloti/Y. Cai, M. Xia, H. Dong, et al. //BMC Biotechnology. 2018. Vol. 18. Is. 1. No. 27. doi: 10.1186/s12896-018-0441-2.
14. Sych M. J., Lacroix C., Stevens M. J. A. Vitamin B12 - physiology, production and application // Industrial Biotechnology of Vitamins, Biopigments, and Antioxidants. Wlley-VCH Verlag GmbH & Co, 2016. P. 129-160. doi: 10.1002/9783527681754.ch6.
15. Industrialvitamin B12 production by Pseudomonas denitrificans using maltose syrup and corn steep liquor as the cost-effective fermentation substrates / W. Xia, W. Chen, W.-F. Peng, et al. // Bioprocess and Biosystems Engineering. 2015. Vol. 38. Is. 6. P. 1065-1073. doi: 10.1007/ s00449-014-1348-5.
16. Metabolic engineering of Escherichia coli for de novo biosynthesis of vitamin B12/H. Fang, D. Li, J. Kang, et al.//Nature Communications. 2018. Vol. 9. Is. 1. P. 4917. doi: 10.1038/s41467-018-07412-6.
17. Кузнецова Т. В., Саубенова М. Г., Имашпаева Г. А. Выделение и селекция пропионовокислых бактерий, перспективных для использования в биотехнологии // Приволжский научный вестник. 2015. № 9 (49). С. 16-20.
18. Microbial production of vitamin B12 / J. H. Martens, H. Barg, M. Warren, et al. //Applied Microbiology and Biotechnology. 2002. Vol. 58. Is. 3. P. 275-285. doi: 10.1007/s00253-001-0902-7.
19. Janda J. M., Abbott S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls // Journal of Clinical Microbiology. 2007. Vol. 45. No. 9. P. 2761-2764. doi: 10.1128/JCM.01228-07.
20. Optimization of medium components in vitamin B12 biosynthesis / R. V. Roman, E. Iluc, A. Mustea, et al. // Romanian Biotechnol Lett. 2001. Vol. 6. P. 343-350.
21. Development of a two-step cultivation strategy for the production of vitamin B12 by Bacillus megaterium/Y. Mohammed, B. Lee, Z. Kang, et al. //Microbial Cell Factories. 2014. Vol. 13. Article 102. doi: 10.1186/s12934-014-0102-7.
22. Microbiological studies on the production of vitamin B12 from two mixed cultures under solid state fermentation condition / H. M. Atta, R. A. Arafa, M. S. Salem, et al. //Journal of Applied Sciences Research. 2008. Vol. 4. Is. 11. P. 1463-1477.
References
1. Khalizova ZN, Zykov SA. [State and development prospects of the feed industry in Russia]. Effektivnoe zhivotnovodstvo. 2019;(3):14-8. Russian.
2. McDowell LR. Vitamin nutrition of livestock animals: Overview from vitamin discovery to today. Canadian Journal of Animal Science. 2006;86(2):171-9. doi: 10.4141/A05-057.
3. Kalashnikov AP, Fisinin VI, Shcheglov VV, et al., editors. Normy i ratsiony kormleniya sel'skokhozyaistvennykh zhivotnykh. Spravochnoe posobie [Rates and rations for feeding farm animals. Reference manual]. Moscow: Znanie; 2003.456p. Russian.
4. Survase SA, Bajaj IB, Singhal RS. Biotechnological production of vitamins. Food Technologyand Biotechnology. 2006;44(3):381-96.
5. Fang H, Kang J, Zhang D. Microbial production of vitamin B12: a reviewand future perspectives. Microbial Cell Factories. 2017;16(1): Article 15. doi: 10.1186/s12934-017-0631-y.
6. Grachev D. [The market for feed additives requires dramatic changes]. Kombikorma. 2019;(1):13-6. Russian.
7. Lavrenova V. [The market for feed vitamins]. Tsenovik. 2019;(2):26-9. Russian.
8. Craig GW. Total synthesis of vitamin B 12 — A fellowship of the ring. Journal of Porphyrins and Phthalocyanines. 2015;20(1):1-20. doi: 10.1142/S1088424615500960.
9. Escalante-Semerena JC, Warren MJ. Biosynthesis and use of cobalamin (B12). EcoSal Plus. 2008;3(1). doi: 10.1128/ecosalplus.3.6.3.8.
10. Peng W, ChengX Zhang H, etal. The metabolic characteristics ofhigh-production vitamin B12 by Pseudomonas denitrificans under dissolved oxygen step-wise reduction. Journal of Chemical Technologyand Biotechnology. 2014;89(9):1396-401. doi: 10.1002/jctb.4219.
11. Hedayati R, Hosseini M, Najafpour GD. Optimization of semi-anaerobic vitamin B12 (cyanocobalamin) production from rice bran oil using Propionibacterium freudenreichii PTCC1674. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology. 2020;23: Article 101444. doi: 10.1016/j. bcab.2019.101444.
12. Li K, Liu D, Chu J, et al. An effective and simplified pH-stat control strategy for the industrial fermentation of vitamin B12 by Pseudomonas denitrificans. Bioprocess and Biosystems Engineering. 2008;31(6):605-10. doi: 10.1007/s00449-008-0209-5.
13. Cai Y, Xia M, Dong H, et al. Engineering a vitamin B12 high-throughput screening system by riboswitch sensor in Sinorhizobium meliloti. BMC Biotechnology. 2018;18(1):27. doi: 10.1186/s12896-018-0441-2.
14. Sych MJ, Lacroix C, Stevens MJA. Vitamin B12-physiology, production and application. In: Industrial Biotechnology of Vitamins, Biopigments, and Antioxidants. Wlley-VCH Verlag GmbH & Co; 2016. p. 129-60. doi: 10.1002/9783527681754.ch6.
15. Xia W, Chen W, Peng W, et al. Industrial vitamin B12 production by Pseudomonas denitrificans using maltose syrup and corn steep liquor as the cost-effective fermentation substrates. Bioprocess and Biosystems Engineering. 2015;38(6):1065-73. doi: 10.1007/s00449-014-1348-5.
16. Fang H, Li D, Kang J, et al. Metabolic engineering of Escherichia coli for de novo biosynthesis of vitamin B12. Nature Communications. 2018;9(1):4917. doi: 10.1038/s41467-018-07412-6.
17. Kuznetsova TV, Saubenova MG, Imashpaeva GA. [Isolation and selection of propionic acid bacteria that are promising for use in biotechnology]. Privolzhskii nauchnyi vestnik. 2015;(9):16-20. Russian.
18. Martens JH, Barg H, Warren M, et al. Microbial production of vitamin B12. Applied Microbiology and Biotechnology. 2002;58(3):275-85. doi: 10.1007/s00253-001-0902-7.
19. Janda JM, Abbott SL. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls. Journal of Clinical Microbiology. 2007;45(9):2761-4. doi: 10.1128/JCM.01228-07.
20. Roman RV, Iluc E, Mustea A, et al. Optimization of medium components in vitamin B12 biosynthesis. Romanian Biotechnol Lett. 2001;6:343-
50.
21. MohammedY, Lee B, KangZ, etal. Development of a two-step cultivation strategyforthe production ofvitamin B12byBacillus megaterium. Microbial Cell Factories. 2014;13: Article 102. doi: 10.1186/s12934-014-0102-7.
22. Atta HM, Arafa RA, Salem MS, et al. Microbiological studies on the production of vitamin B12 from two mixed cultures under solid state fermentation condition. Journal of Applied Sciences Research. 2008;4(11):1463-77.
