CC BY
13
for ihc TG5 gene; the minimum urea content in individuals with a heterozygous PRLAB genotype for the PRL gene. According to the studied genes, the highest total protein content was found in animals with the complex genotype CSN3aaGHitTG5tcBBBLGPRL,)b(n=l) - 122.00 g/1. albumins
- in animals with the complex genotype CSN3ABGHLLTG5K BLG WJ>RL U (n=l) - 57,00 g/1, glucose
- in animals with the complex genotype CSN3AAGHuTG5ccBBBLGPRL,A (n=l) - 5.75 mmol/1: the minimum urea content in animals with the complex genotype CSN3A/4GHLLTG5lcBLGABPRLAti (n=l) - 4.01 mmol/1. The different frequency of occurrcnce of genotypes, both for individual genes and for their complexes, necessitates further research to refine the results obtained.
УДК 619:616.98:579.8
РАЗРАБОТКА МЕТОДА ИММУНОФЕРМЕНТНО! О АНАЛИЗА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ АНТИГЕНА ¡V1.AGALACTIAE ОВЕЦ И КОЗ В БИОСУБСТРАТАХ
*Кулибсков Ф.М. - д.б.н., Дильбази Г.Г. - к.в.н. * Институт Микробиологии Национальной Академии Наук Азербайджана Ветеринарный Научно-Исследовательский Институт
Ключевые слова: микоплазма агалактии, иммуноферментпый анализ, биосубстраты, антиген, бактерия
Key words: mycoplasma agalactia, enzyme immunoassay, biosubstrates, antigen, bacterium
Развитие овцеводства является одной из важнейших задач сельского хозяйства, направленных на увеличение производства продуктов животноводства. Успешному решению этой проблемы в Российской Федерации и Азербайджанской Республике препятствуют инфекционные болезни и в частности, инфекционная агалактия и листериоз овец. Из известных в настоящее время 102 видов бактерий рода Mycoplasma ля овец и коз наиболее патогенным является Mycoplasma agalactiae (Х.З. Гаффаров и др., 1994; Ф.М. Кулибеков, 2012; Ф.М. Кулибеков, Г.Г. Дильбази, 2015;Talavera S., Goncer А., 1985; Kennedy S., Ball U.S., 1987; Gaillard-Periin G., 1985; Sarris K. et al., 1987; Montagna C.O., 1988; Sanchis R. et al., 2000). Как сообщают ряд исследователей (Кулибеков Ф.М., Дильбази Г.Г.), под руководством профессора Фарзалиева М.М. в условиях неблагополучных по агалактии овец и коз хозяйствах Азербайджанской Республики были выделены микоплазмы. Изучение роли микоплазм в этиологии инфекционной агалактии овец, выделение и изучение иммунобиологических свойств
эпизоотических штаммов М. agalactiae и на их основе создание средств специфической
профилактики и лабораторной диагностики указанной болезни, является весьма актуальной проблемой.
Несмотря на значительный период изучения этой болезни, результаты исследований по разработке средств специфической профилактики и лабораторной диагностики,
свидетельствуют о том, что эта проблема требует дальнейшей разработки.
Целью настоящей работы явилась разработка метода иммуно- ферментного анализа для выявления антигена возбудителя М^а1аснае в биосубстратах и получение мембранного антигена пригодного при гинериммунизации овец для получения специфических диагностических сывороток. Учитывая при этом что, основной задачей при получении иммуноферментных конъюгатов является сохранение высокой каталитической и иммунологической активности
образовавшейся гибридной молекулы белка и фермента. Качество их определяется активностью фермента, высокой специфической активностью иммуноглобулина, используемого для конъюгации, оптимальным соотношением фермента и иммуноглобулина в конъюгате.
Материалы и методы исследований.
В исследованиях использовали иммуноглобулины из гипериммунных сывороток крови овец. При этом для гипериммунизации овец получали мембранный антиген из биомассы аттснуированного штамма М^а1асПае Л-319 в описании Х.З. Гаффа-рова и соавт. (1994) путем разрушения клеток микоплазм на ультразвуковом дезинтеграторе типа УЗДН-20. Предварительно осажденные клетки ресуспендиро-вали в физрастворе, разбавленном в 20 раз, вносили РНК-азу и ДПК-азу до 1 мкг/см для удаления рибосом и ДНК с поверхности цитоплазматических мембран. Разрушение микоплазм проводили при 20 КГц в течение 4 мин в 2 огапа ио 2 мин с минутным интервалом при 2иС. С целью удаления адсорбированных неснецифических белков цитоплазматические мембраны очищали иммуносорбентом. приготовленным на основе антисыворотки к питательной среде, на которой была вьтрашена М.аега1асиае. Для сравнительной оценки эффективности используемого мембранного антигена одновременно испытали антигенные препараты, полученные путем дезинтегрирования суспензии микоплазм смесью неполного детергента Твина-40 и этилового эфира. Контрольный (отрицательный) антиген готовили из неинфици-рованной обогащенной питательной среды для микоплазм путем концентрирования ее с помощью ПЭГ-6000 и последующего диализа против 0,2 М фосфатного буфера. Стандартизированные по белку на спектрофотометре СФ-46 мембрашгые и контрольные препараты использовали в качестве иммунизирующего антигена. Специфические к М.а§а1асйае сыворотки получали путем иммунизации кроликов и овец мембранными антигенами с содержанием белка 3,3-12,5 мг/см3 по схемам, предложенным Х.З. Гаффаровьгм и др. (1994). В качестве контроля использовали сыворотки крови клинически здоровых интакт-ных животных. Уровень антител в сыворотках крови животных определяли в ИФА и РСК. Необходимые для постановки непрямого варианта ИФА меченные ферментом пероксидазой хрена антивидовые глобулины кролика и барана приобретали из
ВНИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи. Иммуноглобулин G для сенсибилизации планшет получали двухкратным осаждением 50%-ным раствором сульфата аммония с последующей ионообменной хроматографией на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой из гипериммунных сывороток овец.
Результаты исследований. Как известно принцип непрямого сэндвич-метода ИФА для определения антигена включает следующие этапы: сенсибилизация планшета специфическими антителами; внесение искомого антигена; внесение специфических антител; внесение антивидового конъюгата (энзиммеченый антиглобулин); проявление реакции ферментным субстратом. Определяли оптимальную концентрацию сорбирующих диагностических антител. Они составляли 8-10 мг/см. Субстратной смесью служил 0,04%-ный раствор ортафеии леи диамина в 0,1 М цит-ратно-солевом буфере, содержанием 0,04% перекиси водорода. В качестве твердой фазы были использованы отечественные полистироловые планшеты для иммунологических реакций. Учет результатов ИФА производили визуально и фотометрически при длине волны 492 им. Испытание пригодности компонентов набора препаратов для выявления антигена возбудителя инфекционной агалактии осуществляли путем исследований суспензий клеток M.agalactiae, смывов их колоний, а также оболочек и органов инфицированных 50 куриных эмбрионов. В качестве контроля служили оболочки и органы интактных эмбрионов, обогащенная питательная среда для микоплазм, смыв с поверхности 1,3%-пый шаровой среды и контрольные положительные и отрицательные антигены. За тигр антигенов и сывороток принимали то их наивысшее разведение, значение оптической плотности (ОН) которого в 2,1 и более раза превышала ОН ин-гредиентов в контрольных лунках. При этом учитывали отношение величины оптической плотности (OI I492)
положительного контроля (Р) к величине ОП492 отрицательного контроля (N) при различных разведениях сорбируемых специфических антител и конъюгатов со
стандартной дозой мембранного антигена M.agalactiae (1:600-1:800). При выбранных оптимальных условиях соотношение P/N было близко к 4.. а оптическая плотность для отрицательного контрольного антигена была от 0,16 до 0,25. В желточных оболочках развивающихся эмбрионов кур, зараженных M.agalactiae антиген M.agalactiae обнаруживали в титре 1:32 в 33 случаях, а в титре 1:128 - в 10, а в печени эмбрионов в титре 1:64 - 1:256 в 7 случаях. Взвеси оболочек и органов у иптактных эмбрионов не проявляли положительной реакции в ИФА. При исследовании суспензии из органов экспериментально зараженных
M.agalactiae овец, антиген возбудителя выявляли в лимфатических узлах в титре 1:32-1:64 и в суставной жидкости - 1:64-1:128. При исследовании в качестве контроля M.bovis с применением специфических антител к М. agalactiac получены отрицательные результаты. При исследовании в тесг-сисгеме ИФА смывов колоний с шаровой поверхности и бульонной культуры возбудителя инфекционной агалактии было обнаружено, что антиген M.agalactiae выявляется в титрах 1:80 в жидкой среде и в разведении 1:160 в смыве колоний с агаровой поверхности.
Заключение. Таким образом, изучена и установлена эффективность метода иммуноферментного анализа для выявления антигена возбудителя M.agalactiae в биосубстратах. Установлено, что мембранный антиген из клеток
микоплазмы агалактии пригоден для гипериммунизации овец и обеспечивает по.тучение специфических
диагностических сывороток с высоким титром антител.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Гаффаров, Х.З. Диагностика инфекционной агалактии овец и коз методом иммуноферментного анализа / Х.З. Гаффаров, Р.Г. Гиззатуллин, М.В. Летова, Л.А. Жандарова // Вопр.инфекц.патологии животных. - 1994. - С.13-18.
2. Кулибеков. Ф.М. Оптимальная среда для культивирования возбудителя инфекционной агалактии мелкого рогатого скота / Ф.М. Кулибеков, Г.Г. Дильбази // Ветеринарный врач. - 2011.- №2. - С.23-25.
3. Кулибеков, Ф.М. Разработка и усовершенствование лабораторной диагностики и специфической профилактики инфекционной агалактии и листериоза овец //Автореферат дисс. д.б.н., Казань. 2012. - 46с.
4. Кулибеков Ф.М. Некоторые показатели иммуногенеза при вакцинации овец против инфекционной агалактии / Ф.М. Кулибеков, Г.Г. Дильбази // Аграрная наука. - 2015. - №2 -С. 19-21
5. Sanchis R., Abadie G., Lambert M., Dufour P., Guibert J.-M., Pepin M. Inoculation of lactating ewes by the mtramammary route with Mycoplasma agalactiae: compaparative pathogenicity of six field strains //Veter.Res., 2000, Vol.31, N3. -P.218-237.
РАЗРАБОТКА МЕТОДА ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ АНТИГЕНА М.АОАЬАСТ1АЕ ОВЕЦ И КОЗ В БИОСУБСТРАТАХ
Кулибеков Ф.М., Дильбази Г.Г.
Резюме
Изучено, что паразитируя в организме, микоплазма агалактии вызывает обширный спектр проявления болезни: аборты, пневмонии, артриты, конъюнктивиты, маститы. У инфицированных животных миконлазма способствует бесплодию, снижает молокоотдачу и другие продуктивные качества, племенной ценности, нередко приводит и к гибели. Поэтому разработка эффективного метода иммуноферментного анализа для выявления антигена возбудителя М^а1аспае в биосубстратах представляет большой экономический и научный интерес.
DEVELOPMENT OF THE METHOD OF IMMUNOFERMAL ANALYSIS FOR DETECTING ANTIGEN M.AGALACTIAE SHEEP AND GOAT IN BIODIESTRICS
Kulibekov F.M., Dilbazi G.G.
Summary
It is studied that, parasitizing in the body, mycoplasma agalactia causes a wide range of manifestations of the disease: abortions, pneumonia, arthritis, conjunctivitis, mastitis. In infected animals mycoplasma promotes infertility, rcduces milk yield and other productive qualities, pedigree value, often leads to death. Therefore, the development of an effective method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of the M.agalactiae pathogen antigen in biosubstrates is of great economic and scientific interest.
УДК 619:616.98:578.835.2-085.371(470)
ПРОФИЛАКТИЧЕСКАЯ ВАКЦИНАЦИЯ ЖИВОТНЫХ ПРОТИВ ЯЩУРА В СУБЪЕКТАХ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ: РЕАЛИИ И ПЕРСПЕКТИВЫ
Лозовой Д.А. - к.в.н., директор, Рахманов A.M. - д.в.н., профессор ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»
Ключевые слова: ящур, эпизоотическая ситуация, плановая вакцинация, субъекты РФ. сорбированная вакцина, эмульсионная вакцина
Key words: foot-and-mouth disease (FMD), epidemic situation, routine vaccination, Subjects of the Russian Federation, sorbed vaccine, emulsion vaccine
Яшур относится к особо опасным трансграничным высококонтагиозным вирусным заболеваниям животных и подлежит обязательной нотификации. В соответствии с современной международной классификацией, он вюпочен в список болезней МЭБ в категорию «Болезни, инфекции и инфестации нескольких видов животных» вследствие того, что им могут болеть сельскохозяйственные и дикие животные более 100 видов, принадлежащих к 33 семействам, относящихся к 14 отрядам (КРС, MPC, свиньи, буйволы, верблюды, яки. олени, косули, лоси, кабаны и др.) [1, 6, 10].
На борьбу с ящуром во всем мире ежегодно тратится около 8 млрд долларов [9|. Анализ данных МЭБ свидетельствует о том, что несмотря на принимаемые меры, эпизоотическая ситуация по ящуру в мире остается довольно напряженной. По официальным данным, в 2015 - 2016 гг. неблагополучными по ящуру были 67 стран, из них 36 африканских, 29 азиатских и 2 европейских [2,7]. При этом регистрировали
ящур 6-ти известных типов, в т.ч. типа О -в 40 странах, типа А - в 24 странах, типа Азия-1 - в 6 странах, типа SAT-1 - в 11 странах, типа SAT-2 - в 12 странах, типа SAT-3 - в 2 странах. В 16 странах вирус не был типирован. В ряде государств выделяли вирус ящура 2-4 типов (Афганистан, Иран, Китай, Монголия, Пакистан. Турция, ДР Конго, Египет, Кения, Танзания, Эфиопия). В некоторых странах ящур получал значительное распространение. В 2015 -2016 гг. среди КРС и MPC в Турции было зарегистрировано 572 очага ящура, в Афганистане- 514 очагов, в Пакистане — 741, в Иране - 1260 очагов типов О, А, Азия-1, в Египте - 130 очагов типов О, A, SAT-2, в Ираке-741, Непале - 110, ()мане-280. в Южной Корее -179 очаг ов типа О.
За последние годы в России отмечались в основном случаи заносного ящура типов О и А в регионах, граничащих с Китаем, Монголией и Грузией [4, 5]. В 2016 г. в РФ в Забайкальском крае, который гранита! с Китаем, среди КРС зарегистрировано 3 венышки ящура типа О. Возбуди-
