CC BY
1DOI 10.24412/cl-37235-2024-1-94-98
РАЗРАБОТКА КЛЕТОЧНОЙ МОДЕЛИ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ СЕМЕЙНОЙ СРЕДИЗЕМНОМОРСКОЙ ЛИХОРАДКИ
Л.В. Карапетян1'2, В.А. Айрапетян 12, Л.Г. Гукасян2, С.А. Аджемян1'2,
A.К. Казарян1'2, С.А. Акобян2, Г.В. Хачатрян1'2, Т.К. Сирунян 12,
B.С. Варданян3, Е.В. Григорьева4, С.М. Закиян4, А.А. Аракелян1'2,
Р.В. Захарян1'2
1 Российско-Армянский (Славянский) университет 2Институт молекулярной биологии НАН РА 3Институт хирургии имени А.Л. Микаеляна
4ФИЦИнститут цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск, РФ lana.karapetyan00@gmail. com
АННОТАЦИЯ
В данной статье впервые получены клеточные линии здорового человека для изучения семейной средиземноморской лихорадки (ССЛ) путем клеточного репрограммирования.
Плюрипотентные клеточные линии здоровых и больных ССЛ могут быть использованы для оценки функциональности различных генетических вариантов, присутствующих в геноме больных ССЛ, что в целом может способствовать лучшему пониманию молекулярных механизмов данного заболевания.
Ключевые слова: Семейная средиземноморская лихорадка - ССЛ, клеточное репрограммирование, секвенирование, клеточные линии.
Введение
Семейная средиземноморская лихорадка (ССЛ) - это аутосомно-рецес-сивное наследственное заболевание, которое в основном встречается в популяциях Средиземноморья. Согласно статистическим данным, у армян частота встречаемости составляет 14100 случаев на 10 000 населения и варьируется в зависимости от региона. Несмотря на тот факт, что основной причиной развития заболевания являются точечные мутации гена MEFV, кодирующий белок пирин, молекулярные механизмы ССЛ все еще частично описаны [1].
Исходя из вышесказанного, была поставлена цель разработать клеточную модель, из мононуклеарных клеток периферической крови здорового человека путем клеточного репрограммирования.
Материалы и методы
Кровь больных предоставлялась ревматологическим отделением Инсти-
тута хирургии имени А.Л. Микаеляна, согласно предварительной договоренности. Был проведен забор венозной крови здоровой армянки (24 года) с использованием EDTA в качестве антикоагулянта [2]. Принимая во внимание, что количество жизнеспособных мононуклеарных клеток периферической крови (PBMCs) зависит от времени забора крови до выделения, пробирки с кровью в течение часа доставляли в лабораторию при температуре, близкой к температуре тела человека. Непосредственно после осуществляли выделение PBMCs основные этапы репрограммирования клеток были проведены совместно с лабораторией Эпигенетики развития института цитологии и генетики Сибирского отделения Российской Академии Наук (СО РАН) в Новосибирске.
Процесс репрограммирования клеток проводили согласно разработанному протоколу. В частности, периферическую кровь наливали в соотношении 1:1 на фиколл гистопак-1077 (Histopaque-1077 или Биолот, кат. N° 1.2.8.1.) комнатной температуры в 15 мл пробирку. Сначала наливали фиколл и затем сверху медленно добавляли кровь с целью избегания смешивания. Далее проводили этап центрифугирования, в результате которого происходило разделение на фазы. В интерфазе скапливались мононуклеарные клетки крови. Затем клетки из интерфазы перенесли в свежий раствор PBS, доводили объем до 10 мл и центрифугировали. Подсчёт клеток проводился на этапе очистки PBS, когда клетки значительно разведены.
Для долгосрочного хранения мононуклеары замораживали в 90% раствор KnockOut serum replacement (KoSR, Thermo Fisher), 10% DMSO (Sigma) по 45 *106 клеток в 1 ампулу. Для этого к осадку клеток добавляли KoSR из расчета 900 мкл на 4-5 *106 клеток.
PBMCs здоровой армянки были трансфицированы эписомальными векторами, экспрессирующими OCT4, SOX2, L-MYC, KLF4, LIN28 и Trp53 [2].
К II « H II X И N IU к Н 1! II и II и II II v. и
К Ii Ii II II V It ¡1 II II H II If II И
RAUiOOl-Д RAUiOOl-B RAUiOOl-C
Рис. 3. Кариотип клеточных линий.
>. и II Ii И II Ii I II и |> H .. Ii
H .. « » .. R ..,..« il
Рис. 1. Монослой плюрипотент-ных стволовых кленок.
Рис. 2. Наличие щелочной фос-фотазы в клетках.
Было получено 14 стабильных линий индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), культивированных на эмбриональных фибробла-стах мыши. Три из полученных линий были детально проанализированы. Клетки интенсивно пролиферировали в плотный монослой плюрипотентных стволовых клеток (рис.1). Показана экспрессия эндогенной щелочной фосфа-тазы (Рис.2) и нормальный кариотип 46,ХХ у клеточных линий КАШ001-А на 11-м пассаже, у ЯАШООЬВ на 13-м пассаже и у ЯАиЮ01-С на 15-м пассаже
В недифференцированном состоянии ИПСК экспрессировали маркеры плюрипотентности NANOG, OCT4 и SOX2, а также поверхностный антиген: TRA-1-60 (Рис.4). Количественная ПЦР недифференцированных клеток показала значительное увеличение экспрессии генов (Рис.5) NANOG, SOX2 и OCT4 по сравнению с экспрессией в PBMCs (отрицательный контроль). В качестве положительного контроля использовали линию эмбриональных стволовых клеток HUES9 (HVRDe009-A).
Иммунофлуоресцентный анализ дифференцированных производных показал наличие всех трех зародышевых листков: мезодермы (гладкомышечный а-актин (aSMA), NK2 Homeobox 5 (NKX2.5)), эктодермы (Tubulin ß 3 (или TUBB3/TUJ1), MAP2) и эндодермы (альфа-фетопротеин (AFP), ядерный фактор гепатоцитов 3 бета (HNF3ß/FOXA2)) (Рис.6). ПЦР-анализ клеток на 1314-м пассажах показал отсутствие эписомальных векторов. На 13-14-м пассажах клетки были свободны от микоплазменной контаминации (Рис.7).
(Рис. 3).
Рис.4 Маркеры плюрипотетности. Рис.5. Экспрессия генов NANOG, SOX2 и
0СТ4.
Рис.6. Иммунофлуоресцентный анализ.
Рис. 7. ПЦР-анализы.
В результате данного исследования мы получили клеточные линии здорового лица, что может в дальнейшем способствовать изучению молекулярных механизмов ССЛ путем оценки функционального вклада отдельно взятых генетических вариантов.
Исследование выполнено при финансовой поддержке Комитета по высшему образованию и науке РА в рамках научного проекта № 21SCG-1F010 (Р1: Яок^апа 2акЬагуап).
ЛИТЕРАТУРА
1. Lancieri M., Bustaffa M., Palmeri S., Prigione I., Penco F., Papa R., Volpi S., Caorsi R., GattornoM. An Update on Familial Mediterranean Fever. Int J Mol Sci.; 24(11):9584, 2023, DOI: 10.3390/ijms24119584.
2. Grigor'eva E., Malakhova A., Ghukasyan L., Hayrapetyan V., Atshemyan S., Vardanyan V., Zakian S., Zakharyan R. andArakelyan A. Generation of three induced pluripotent stem cell lines (RAUi001-A, RAUi001-B and RAUi001-C) from peripheral blood mononuclear cells of a healthy Armenian individual. Stem Cell Res. 71:103147, 2023, DOI: 10.1016/j.scr.2023.103147.
DEVELOPMENT OF A CELL MODEL FOR THE STUDY OF FAMILIAL MEDITERRANEAN FEVER
L. Karapetyan1'2, V. Hayrapetyan12, L. Ghukasyan2, S. Atshemyan1'2, H. Ghazaryan1'2, S. Hakobyan2, G. Khachatryan12, T. Sirunyan 12, V. Vardanyan3, E. Grigor'eva4, S. Zakian4, A. Arakelyan 12, R. Zakharyan12
1Russian-Armenian (Slavonic) University 2Institute of Molecular Biology NAS RA 3Mikayelyan Institute of Surgery 4Federal Research Center Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch of Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, RF
ABSTRACT
In this study, for the first time cell lines of healthy Armenian individual have been developed using cell reprogramming approaches. Pluripotent cell lines from healthy individual will be used to assess the functionality of different genetic variants present in the genome of Familial Mediterranean Fever (FMF) patients, which in general might contribute to a better understanding of the molecular mechanisms of this disease. Keywords: Familial Mediterranean fever - FMF, cell reprogramming, sequencing, cell lines.
