CC BY
122
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 576.363:578.828:577.214
Получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из фибробластов кожи плода человека
С. П. Медведев1, А. А. Малахова1, Е. В. Григорьева1, А. И. Шевченко1, Е. В. Дементьева1, И. А. Соболев1, И. Н. Лебедев2, А. Г. Шилов1, И. Ф. Жимулев3, С. М. Закиян1,4* 1Институт цитологии и генетики СО РАН, 630090, Новосибирск, просп. ак. Лаврентьева, 10 2НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН, 634050, Томск, ул. Набережная реки Ушайки, 10 3Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, 630090, Новосибирск, просп. ак. Лаврентьева, 8
4Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН, 630117, Новосибирск, ул. ак. Тимакова,2 *E-mail: zakian@bionet.nsc.ru Поступило в редакцию 10.04.2010 г.
РЕФЕРАТ Получение и исследование аутологичных стволовых клеток человека являются актуальной задачей современной клеточной биологии и биомедицины. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки могут быть получены из соматических клеток человека путем сверхэкспрессии набора определенных генов. В данной работе проведено репрограммирование фибробластов кожи плода человека путем трансдукции ретровирусными векторами, несущими кДНК генов Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc мыши. В результате получены клетки, обладающие характерными для эмбриональных стволовых клеток человека экспрессией белков и паттерном транскрипции генов. Показано, что полученные индуцированные плюрипотентные стволовые клетки способны дифференцироваться in vitro в производные эктодермы, мезодермы и энтодермы.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, репрограммирование, ретровирусные векторы.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ЭСК - эмбриональные стволовые клетки, ИПСК - индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, ПЦР - полимеразная цепная реакция, ОТ-ПЦР - обратная транскрипция с последующей по-лимеразной цепной реакцией.
Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека являются уникальной моделью для исследований во многих областях биомедицины, в т.ч. для изучения молекулярных основ плюрипотентности и репрограммирования клеток - процессов, происходящих во время раннего эмбриогенеза человека [1]. Кроме того, существуют большие перспективы использования индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в токсикологических и фармакологических исследованиях, а также в регенеративной медицине [2-4].
Задачей данной работы было получение стабильных линий плюрипотентных клеток из фибробластов кожи плода человека в результате трансдукции ретровирусными векторами, экспрессирующими гены Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc мыши.
В качестве исходной линии клеток для получения ИПСК нами были взяты фибробласты кожи плода человека (9-я неделя беременности) линии MA N1. Фибробласты транс-дуцировали ретровирусами, полученными в результате котрансфекции конструкций pMXs-Oct4, pMXs-Sox2, pMXs-Klf4 и pMXs-c-Myc, несущих кДНК генов Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc мыши [5], и плазмиды, экспрессирующей гли-копротеин G вируса везикулярного стоматита (VSV-G), в клетки упаковочной линии HEK293 Phoenix, несущей
в геноме вирусные гены Gag и Pol. Для контроля трансдукции использовали ретровирус, полученный на основе конструкции pMX-GFP (Cell Biolabs, США), кодирующей флуоресцирующий белок GFP. Трансдуцировали 1 млн фибробластов. Через 48 ч после трансдукции клетки пересаживали на слой фидера (митотически неактивные фибробласты мыши, обработанные митомицином C) в среде для культивирования ЭСК человека с добавлением 2-про-пилвалериановой кислоты (VPA, концентрация 0.5 мМ). В течение второй недели после трансдукции появилось около 500 гранулярных колоний клеток, морфологически отличающихся от фибробластов. Однако данные колонии были отрицательны при окраске на щелочную фосфатазу (Alkaline Phosphatase, AP) (одного из маркеров плюрипо-тентных клеток). Вероятно, данные клетки соответствуют начальным стадиям репрограммирования [6]. В течение 15-30 сут после трансдукции продолжали отбор ЭСК-подобных клонов. Отбор проводили по морфологическому критерию. Схема эксперимента представлена на рис. 1. Среди 200 клонов, которые продолжали культивировать, стали появляться AP-позитивные. Всего в результате эксперимента было получено 18 стабильных ЭСК-подобных линий, четыре из которых (hiPS-A24, hiPS-A29, hiPS-21L и hiPS-30L) были подробно охарактеризованы. Клетки дан-
Переход
Трансдукция:
PMXSfCt4 на среду для РМЛ™.2 чЭСК+0.5 мМ VPA
pMMXScf и клой фидерт
1 |
дни 0 эксперимента
Трансдукция 1 млн фибробластов кожи плода человека — MA N1
оявление гранулярных колоний
Отбор клонов ИПСК
15
30 30
Появление ~500 первичных гранулярных колоний
Культивирование ~200 ЭСК-подобных колоний
I
Охарактеризовано 4 линии ИПСК hiPS-A24 hiPS-A29 hiPS-21L hiPS-30L
Рис. 1. Схема эксперимента по получению индуцированных плюрипотентных клеток из эмбриональных фибробластов человека.
Получение 18 стабильных ЭСК-подобных линий ИПСК
ных клонов имеют большое ядерно-цитоплазматическое отношение, растут плотными колониями, т.е. обладают морфологическими характеристиками ЭСК человека (рис. 2А), они АР-позитивны (рис. 2Б). С помощью ПЦР было определено, что все четыре линии содержат в геноме встройки использованных ретровирусных конструкций (pMXs-Oct4, pMXs-Sox2, pMXs-Klf4 и pMXs-c-Myc). С помощью имму-ноцитохимического метода было обнаружено, что в данных клетках экспрессируются маркеры плюрипотентных клеток: поверхностные антигены ТИА-1-60, ТИА-1-81 и SSEA-4, а также транскрипционные факторы NANOG и ОСТ4 (рис. 3). С помощью ОТ-ПЦР (обратная транскрипция с последующей полимеразной цепной реакцией) была исследована транскрипция 25 генов, являющихся маркерами ЭСК человека (рис. 4А). Было обнаружено, что все четыре клона очень сходны по паттерну экспрессии генов с линией ЭСК человека HUES9, которая была взята в качестве позитивного контроля. В индуцированных плюрипотентных стволовых клетках, полученных из фибробластов кожи плода,
а
б
Рис. 2. А - морфология колоний ИПСК, полученных из эмбриональных фибробластов человека; Б - окраска колоний ИПСК, демонстрирующая экспрессию щелочной фосфатазы (одного из маркеров плюрипотентных клеток). Масштабная линейка - 100 мкм.
экспрессируются такие надежные маркеры плюрипотентных клеток, как гены OCT4, NANOG, SOX2, FGF4, REX1, DNMT3B, NODAL и др. (рис. 4А). Единственное различие было обнаружено по транскрипции гена GDF3. Из четырех проанализированных линий ИПСК данный ген транскрибируется только в hiPS-21L. Из 25 маркерных генов в фи-бробластах MA N1 наблюдается транскрипция только генов KLF4 и c-MYC (рис. 4А). Клетки ИПСК hiPS-A24, hiPS-A29, hiPS-21L и hiPS-30L при переводе в суспензионную культуру формируют эмбриоидные тельца (рис. 4Б). ОТ-ПЦР-
DAPI
OCT4 щ
NANOG ¿щ
SSEA-4 ff/
TRA-1-60 Вт
TRA-1-81 - V rCC* 1 j ♦ 1 дд^. Дру tBvV иИЕ-
Рис. 3. Иммуно-цитохимическое окрашивание колоний ИПСК антителами к белкам транскрипционных факторов ОСТ4 (зеленый цвет) и NANOG (красный цвет), а также поверхностным антигенам: SSEA-4, TRA-1-60 и TRA-1-81 (красный цвет). Ядра клеток окрашены DAPI (синий цвет). Масштабная линейка - 100 мкм.
2
F
ТОМ 2 № 2 (5) 2010 | ACTA NATURAE | 109
А
NANOG OCT3/4 SOX2 KLF4 c-MYC REX1 GDF3 CD9 TDGF1 UTF1 DNMT3B LEFTB NODAL FGF4 IFITM1 GABRB3 hTERT PODXL GRB7 ESG1 DPPA4 DPPA2 EBAF GAL BRIX GAPDH GAPDH (RT-)
MAN1 ON 1Л rs < ON fN < О m
Ш D I uo OL UO OL UO OL uo OL
->-
шшШ'
Число циклов амплификации
30
Б
25 25 25 25 35 25 35 35 25 25 35 35 25
25 35 20 25 35 25 35 25 25 25 25 25
О Ol
NANOG OCT3/4X MAP2 PAX6\ GFAP
brachyury\
SOX17 FOXA2 CKw\ CK8\ AFP GAPDH GAPDH (RT-) I
Рис. 4. А - ОТ-ПЦР-анализ транскрипции генов, являющихся маркерами эмбриональных стволовых клеток человека, в эмбриональных фибробластах (МА N1), эмбриональных стволовых клетках человека (HUES9) и четырех линиях индуцированных плюрипотентных стволовых клеток: hiPS-A24, hiPS-А29, hiPS-21L и hiPS-30L; Б - эмбриоидные тельца, сформировавшиеся при переводе клона ИПСК hiPS-30L в суспензионную культуру; масштабная линейка - 100 мкм; В - ОТ-ПЦР-анализ транскрипции генов, являющихся маркерами дифферен-цировки клеток в производные трех зародышевых листков (эктодермы, мезодермы и энтодермы), после in vitro-дифференцировки клеток клона hiPS-30L через образование эмбриоидных телец.
ЭКТОДЕРМА МЕЗОДЕРМА ЭНТОДЕРМА
ß-III-тубулин коллаген I а-фетопротеин
k v - v..". p Щд!\ ■ . V : . Iii / : •
¿'"" г * . " I IJmt*Л. гОД. L* * ' 4
GFAP фибронектин цитокератин 18
^ L JU * УщЯЮ? 3fc > ' J. * i -*■ - V* i1. ■■ í-»177.' ■-- ' fee г- V Ci
GATA6
Рис. 5. Экспрессия маркеров производных трех зародышевых листков (эктодермы, мезодермы и энтодермы) при спонтанной дифференцировке в эмбриоидных тельцах ИПСК, полученных из фибробластов кожи плода человека. Масштабная линейка - 100 мкм.
дермы (а-фетопротеин и цитокератин 18) (рис. 5). Кроме вышеперечисленных выявлены клетки, экспрессирующие маркер энтодермы и мезодермы GATA6, а также белок не-стин, который является маркером производных эктодермы и мезодермы (рис. 5). Таким образом, было показано, что полученные ИПСК человека обладают широким потенциалом дифференцировки in vitro. Кариотипический анализ полученных линий ИПСК показал, что они имеют нормальный набор хромосом - 46, XY.
Таким образом, было показано, что экспрессия генов Oct4, Sox2, c-Myc и Klf4 мыши в клетках человека способна вызывать репрограммирование и образование стабильных клонов ИПСК, по своим характеристикам аналогичных ЭСК человека. Репрограммирование фибробластов с помощью ретровирусных конструкций является воспроизводимым методом, позволяющим получать в относительно короткий срок большое количество клонов плюрипотент-ных клеток. •
Работа поддержана Программой Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».
анализ клеток, получившихся после культивирования эм-бриоидных телец, показал наличие маркеров производных всех трех зародышевых листков: эктодермы (MAP2, PAX6, GFAP), мезодермы (BRACHYURY) и энтодермы (SOX17, FOXA2, CK8, CK18, AFP) (рис. 4В). Иммуноцитохимиче-ский анализ клеток дезагрегированных эмбриоидных телец выявил наличие различных клеточных производных, экспрессирующих маркеры эктодермы (ß-III-тубулин и GFAP), мезодермы (коллаген I и фибронектин) и энто-
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Yamanaka S. // Cell. 2009. V. 137. P. 13-17.
2. Park I.H., Arora N., Huo H., et al. // Cell. 2008. V. 134. P. 877-886.
3. Ebert A.D., Yu J., Rose F.F., Jr., et al. // Nature. 2009. V. 457. P. 277-280.
4. Lee G., Papapetrou E.P., Kim H., et al. // Nature. 2009. V. 461. P. 402-406.
5. Takahashi K., Yamanaka S. // Cell. 2006. V. 126. P. 663-676.
6. Takahashi K., Tanabe K., Ohnuki M., et al. // Cell. 2007. V. 131. P. 861-872.
нестин
B
