CC BY
102
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ♦ и ммунология ♦
УДК 619: 616.98: 578.831.3: 636.5: 616-073
Разработка иммуноферментной тест-системы для определения антител к метапневмовирусу птиц подтипов А и В
П.С. Ярославцева (yaroslavtseva@arriah.ru), М.А. Волкова, кандидат биологических наук (volkovama@arriah.ru), Н.С. Мудрак, доктор биологических наук (mudrak@arriah.ru)
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ») (Владимир).
Разработана тест-система на основе иммуноферментного метода для выявления антител к МПВ птиц подтипов А и В при тестировании сывороток в одном разведении. Чувствительность и специфичность разработанной тест-системы относительно коммерческого набора «BioChek» (Нидерланды) составила 96 % и 100 %, соответственно; относительно набора «IDEXX» (США) — 92 % и 100 %, соответственно. Тест-система позволяет оценить уровень антител к МПВ птиц и может быть использована для диагностики инфекции и оценки поствакцинального иммунитета.
Ключевые слова: антиген, ИФА, метапневмовирус-ная инфекция птиц, тест-система Сокращения: АБТС — 2,2'-азино-ди[3-этил] бензти-азолинсульфоновая кислота, БСА — бычий сывороточный альбумин, ИФА — иммуноферментный анализ, КК ФЭК — культура клеток фибробластов эмбрионов кур, МПВ — метапневмовирус, МПВИ — метапневмовирусная инфекция, ОП — оптическая плотность, ПААГ — полиакриламидный гель, СПФ — свободные от патогенной флоры, ТЦД — тканевая цитопатическая доза
Введение
Метапневмовирус птиц — РНК-содержащий вирус, относящийся к семейству Paramyxoviridae, роду Metap-neumovirus, виду Avian metapneumovirus (aMPV). aMPV является возбудителем респираторного заболевания кур и индеек всех возрастов, характеризующегося воспалительными процессами верхних дыхательных путей. МПВИ сопровождается опуханием инфраорбитальных синусов, конъюнктивитами, ринитами, чиханием и кашлем. Выделяют 4 подтипа вируса: А, В, С и D [3]. Экономический ущерб от МПВИ обусловлен повышенной выбраковкой некондиционной птицы, снижением прироста живой массы и яичной продуктивности [4].
Существующие тест-системы для выявления антител к МПВ посредством ИФА могут значительно различаться по целому ряду параметров, что в первую очередь зависит от свойств производственного штамма вируса, используемого для получения антигена. В ФГБУ ВНИИЗЖ при производстве иммуноферментных наборов используют инактивированный МПВ птиц подтипа В. Тест-систему разрабатывали с учетом эпизоотологической ситуации на территории России и стран ближнего зарубежья. Для получения антигена были выбраны отечественные штаммы МПВ птиц наиболее распространенных подтипов А и В [1].
Цель исследования
Разработать иммуноферментную тест-систему для выявления антител к МПВ птиц при тестировании сывороток в одном разведении с использованием в качестве сенсибилизирующих антигенов МПВ птиц подтипов А и В.
Материалы и методы
Вирус. Изолят МПВ птиц подтипа В aMPV/B/12/2010 (титр инфекционной активности 6,5 ТЦД50/мл). Изолят МПВ птиц подтипа А aMPV^^^M (титр инфекционной активности 6,1 ТЦД50/мл). Изоляты депонированы в Коллекцию штаммов микроорганизмов ФГБУ ВНИИЗЖ. Вирус культивировали на КК ФЭК.
Антиген. В качестве сенсибилизирующего антигена использовали очищенные и концентрированные (методом двойного ультрацентрифугирования в градиенте концентрации сахарозы) препараты МПВ подтипов А и В, инак-тивированные аминоэтилэтиленимином. Концентрацию белка определяли по методу Бредфорд. Степень чистоты антигена оценивали электрофорезом в ПААГ [2].
Положительные и отрицательные контрольные сыворотки. Для получения гипериммунной сыворотки использовали очищенные концентрированные инактиви-рованные препараты МПВ птиц подтипов А и В. Кур обескровливали в том случае, если активность сыворотки в ИФА была не ниже 1:6400. В качестве отрицательного контроля использовали сыворотку от СПФ-цыплят [2].
Непрямой вариант ИФА. Титр антител к МПВ птиц определяли в непрямом варианте ИФА с использованием планшетов («Nunc», «MaxiSorp», Дания), сенсибилизированных антигеном МПВ в 0,1 М карбонатно-бикар-бонатном буфере (рН 9,5), блокированных 1%-м раствором БСА в 0,05 М трис-НС буфере с 0,2 М NaCl, 0,1 % твин-20 (рН 7,6) (ТБР-Т). Для разведения тестируемых и контрольных проб, антикуриного конъюгата и межэтапной промывки использовали ТБР-Т буферный раствор. Все компоненты в реакции добавляли в объеме 100 мкл, инкубировали при 37 оС. Исследуемые и контрольные сыворотки тестировали в разведении 1:400. Для обнаружения образовавшихся комплексов использовали козьи антитела к IgG кур, меченные пероксидазой («Synbiotics», США), в рабочем разведении. В качестве субстрата использовали раствор АБТС, содержащий пе-роксид водорода. Реакцию останавливали добавлением в каждую лунку 1%-го додецилсульфата натрия и учитывали спектрофотометрически при длине волны 405 нм с использованием компьютерной программы «СИНКО-ИФА» (свидетельство о регистрации №2000611338).
Разработка иммуноферментной тест-системы для определения антител к метапневмовирусу птиц подтипов А и В
1. Определение оптимальной комбинации антигенов для выявления антител к МПВ подтипов А и В
Концентрация вирусного белка, мг/0,05 мл
Пробы МПВ А + МПВ В по 0, 025 каждый МПВ А + МПВ В по 0, 05 каждый МПВ А + МПВ В по 0,1 каждый МПВ А по 0,1 МПВ В по 0,1
Титр антител к МПВ птиц в ИФА
Положительная контрольная сыворотка к МПВ птиц: подтипа А подтипа В 800 3200 3200 6400 6400 6400 6400 3200 1600 6400
Нормальная сыворотка крови кур (отрицательный контроль) <100 <100 <100 <100 <100
Примечание. * титр антител — величина, обратная разведению сыворотки
Результаты и обсуждение
При разработке тест-системы для обнаружения антител к МПВ птиц подтипов А и В необходимо было определить оптимальную концентрацию каждого антигена, наносимого на планшет, параметры расчета титра антител по одному разведению сыворотки, допустимые значения ОП положительного и отрицательного контроля, позитивно-негативный порог реакции.
Для выявления антител к подтипу А и подтипу В МПВ на планшет наносили одновременно два антигена. Оптимальное количество вирусного белка, необходимого для иммобилизации планшетов антигенами подтипов А и В, предварительно определяли в непрямом варианте ИФА. В качестве рабочего определили количество белка, равное 0,1 мг/0,1 мл для каждого антигена. Для иммобилизации планшетов использовали различные количественные комбинации. Данные представлены в таблице 1.
В качестве оптимальной комбинации антигенов было выбрано 0,1мг/0,05мл МПВ А+0,1мг/0,05мл МПВ В.
Для определения параметров расчета титра антител к МПВ птиц при тестировании в одном разведении сывороток было исследовано в непрямом варианте ИФА в трех повторностях 77 сывороток с различным титром антител, определенным ранее методом последовательных разведений. В качестве рабочего разведения сывороток использовали 1:400, которое ранее было выбрано для определения антител к МПВ птиц с помощью коммерческого набора «ВНИИЗЖ». Построенная линия регрессии для разведения 1:400 отражала зависимость между lgT ИФА, определенным методом последовательных разведений, и вычислением lg S/P-отношения (sample/positive: S/P = ОП пробы — ОП отрицательного контроля / ОП положительного контроля — ОП отрицательного контроля), определенное для каждой сыворотки в разведении 1:400.
Коэффициент корреляции составил 0,97297. Уравнение зависимости имело вид: lgT=3,8986+1,823 • lgS/P.
Уравнение регрессии будет верным при определенных значениях ОП контрольных сывороток. Для определе-
2. Результаты измерения ОП положительного (РСХ) и отрицательного (NCX) контролей
Показатель Среднее значение Доверительный интервал 95 % Минимум Максимум
Отрицательный контроль (NCx) 0,124 0,113...0,134 0,083 0,196
Положительный контроль (PCx) 0,831 0,776...0,887 0,600 1,239
Значение (PCx) — (NCx) 0,712 0,654.0,770 0,49 1,138
ния данной величины были проанализированы по 34 значения ОП положительной и отрицательной контрольных сывороток в разведении 1:400, полученные при постановке ИФА на 17 планшетах (табл. 2).
Проведенный анализ показал, что оптимальные значения ОП для отрицательного контроля должны быть не выше 0,200, для положительного контроля — не ниже 0,600. Минимальная разница ОП положительного и отрицательного контролей должна быть не меньше 0,45.
Для определения позитивно-негативного порога в ИФА было исследовано 90 заведомо отрицательных сывороток крови кур в трех повторностях в различные дни. Среднее арифметическое значение ОП в разведении 1:400 составило 0,067, стандартное отклонение — 0,0322. На основании статистического анализа результат реакции считали отрицательным при S/P < 0,1314; положительным — при S/P < 0,1922 и сомнительным, если 0,1314 < (S/P) < 0,1922.
Воспроизводимость метода определяли посредством тестирования трех групп сывороток крови кур в трех повторностях на трех различных планшетах (табл. 3). Полученные результаты показали, что среднее значение коэффициента вариации титра антител, определенное для каждой группы, не превышало 4 %, а среднее значение стандартного отклонения было не выше 0,5 log2.
Специфичность и чувствительность разработанной тест-системы сравнивали с коммерческими наборами фирм «IDEXX» (США) и «BioChek» (Нидерланды).
Специфичность тест-системы определяли при тестировании сывороток крови от группы СПФ-цыплят 3-х недельного возраста (табл. 4). Все тест-системы показали при этом 100%-ю специфичность.
3. Результаты определения воспроизводимости метода
Группа Показатель Среднее значение по одному планшету3 Среднее значение
сывороток 1-й 2-й 3-й по трем планшетам"
Титр антител, 1од2 9,52 (7,87...10,86)° 9,37 (8,14.10,67) 9,65 (8,31.10,79) 9,51 (8,11.10,77)
1-я Стандартное отклонение, 1од2 0,196 (0,05.0,451) 0,344 (0,056.0,733) 0,369 (0,055.0,594) 0,364 (0,234.0,479)
СУ, % 2,078 (0,5.5,29) 3,65 (0,64.7,9) 3,88 (0,26.6,7) 3,83 (2,69.4,96)
Титр антител, 1од2 11,90 (10,77.12,75) 11,57 (11,08.12,53) 11,93 (10,83.12,69) 11,80 (10,88.12,66)
2-я Стандартное отклонение, 1од2 0,285 (0,121.0,471) 0,321 (0,04.0,556) 0,396 (0,05.0,567) 0,391 (0,283.0,591)
СУ, % 2,38 (0,96.3,74) 2,8 (0,32.4,96) 2,05 (0,04.4,74) 3,31 (2,24.5,02)
Титр антител в ИФА, 1од2 13,13 (12,88.13,6) 12,81 (12,06.13,34) 13,15 (12,8.13,47) 13,03 (12,63.13,38)
3-я Стандартное отклонение, 1од2 0,209 (0,061.0,340) 0,273 (0,09.0,665) 0,293 (0,162.0,425) 0,332 (0,094.0,639)
СУ, % 1,59 (0,47.2,55) 2,16 (0,18.5,68) 1,68 (1,25.3,3) 2,55 (0,73.4,78)
Примечание. а — среднее значение по 9 сывороткам, в — среднее значение по 27 сывороткам, с — минимум-максимум, СУ — коэффициент вариации, %
П.С. Ярославцева, М.А. Волкова, Н.С. Мудрак
4. Титры антител к МПВ птиц в сыворотках крови от СПФ-цыплят 3-х недельного возраста
Название тест-системы Положительные / исследованные пробы Среднее значение титра антител Минимум-максимум
«МПВ А + В» 0/40 17 0...83
«BioChek» 0/40 531 0...1538
«IDEXX» 0/40 28 0.78
5. Результаты исследования сывороток крови кур к МПВ птиц с использованием коммерческих наборов
Пробы «IDEXX» «BioChek» «МПВ А + В» «ВНИИЗЖ»
Положительные 139 133 127 115
Отрицательные 17 23 29 41
Всего 156
6. Титры антител к МПВ птиц подтипов А и В в сыворотках крови кур в ИФА, определенные с использованием сравниваемых тест-систем
9-е сутки после заражения МПВ подтипа А 7-е сутки после заражения МПВ подтипа В
«МПВ А + В» «ВНИИЗЖ» «МПВ А + В» «ВНИИЗЖ»
1236 548 1721 1960
2683 966 2214 2555
750 283 7219 7425
4900 2086 643 726
3203 1001 4968 5041
710 286 5002 5166
1952 424 1132 1323
1648 395 2253 2370
Примечание. Значение титров для набора ВНИИЗЖ: 300<0т, 600<ПЛ, 300<СМ<600, где ОТ — отрицательные пробы, ПЛ — положительные и СМ — сомнительные
Для подтверждения специфичности разработанной тест-системы были использованы также специфические сыворотки крови к вирусам инфекционной бурсальной болезни, инфекционного бронхита кур, ньюкаслской болезни, инфекционного энцефаломиелита, инфекционного ларинготрахеита, синдрома снижения яйце-носкости-76, гриппа птиц и реовирусу. Было показано, что активность антигена МПВ птиц подтипов А и В с гетерологичными сыворотками не превышала фоновый уровень (реакция с неиммунной сывороткой).
По способности выявлять антитела к МПВ птиц в полевых сыворотках крови разработанную тест-систему сравнивали с коммерческими наборами фирм «ГОЕХХ» (США), «ВюСЬек» (Нидерланды), «ВНИИЗЖ» (Россия). С этой целью было исследовано 156 сывороток крови от птиц разного возраста из хозяйств, применяющих вакцинацию против МПВИ (таблица 5).
Таким образом, чувствительность и специфичность тест-системы «МПВ — А+В» относительно набора «ВюСЬек» составила 95,6 % и 100 %, соответственно.
Чувствительность и специфичность разработанной тест-системы «МПВ — А+В» относительно набора «IDEXX» составила 92 % и 100 %, соответственно.
Разработанную тест-систему сравнивали с набором «ВНИИЗЖ» при исследовании сывороток крови, полученных от инфицированных МПВ птиц подтипами А и В с подтвержденным диагнозом. При исследовании слабоположительных проб на ранних сроках после заражения разработанная тест-система показал более высокую чувствительность, частичные данные приведены в таблице 6.
Выводы
Разработанная тест-система позволяла получить воспроизводимые результаты и выявлять специфические антитела к МПВ во всех положительных пробах, статус которых был подтвержден другими коммерческими наборами, и показала, таким образом, высокую специфичность и чувствительность.
Библиография
1. Никонова З.Б. Разработка и применение методов диагностики Метапневмовирусной инфекции птиц. / З.Б. Никонова. — Владимир: ФГБУ «ВНИИЗЖ», 2012. — 135 с.
2. Ярославцева, П.С. Получение иммуноспецифических компонентов для диагностических тест-систем метапневмовируса птиц подтипов А и В. / П.С. Ярославцева, Н.С. Мудрак, М.А. Волкова // В мире научных открытий: материалы 3-й Всерос. студенч. науч. конф. (с междунар. участием). — Ульяновск, 2014. — Т. 5. — Ч. 2. — С. 364-367.
3. Cook, J.K.A. Avian rhinotracheitis / J.K.A. Cook // Rev. Sci. Techn. Off. Intern. Epiz. — 2000. — V. 19. — № 2. — P. 602-613.
4. Grant, M. An enzyme-linked immunosorbent assay for the serodiagnosis of turkey rhinotracheitis infection / M. Grant, C. Baxter-Jones, G.P. Wilding. // Vet. Rec. — 1987.—V.120. — P. 279-280.
5. Rautenschlein, S. Local and systemic immune responses following infection of broilertype chickens with avian metapneumovirus subtypes A and B / S. Rautenschlein, Y.H. Aung, Haase C. // Veterinary Immunology and Immunopathology. — 2011. — Vol. 140. — P. 10-22.
SUMMARY
Yaroslavtseva P.S., Volkova M.A., Mudrak N.S.
Federal Centre for Animal Health (ARRIAH) (Vladimir).
Development of an Enzyme-linked Immunosorbent Assay System for Detecting Antibodies to Avian Metapneumovirus Subtype A and B. A test-system on basis of indirect enzyme-linked immunosorbent assay for detecting antibodies to avian metapneumovirus subtype A and B have developed. Sensitivity and specificity of the test system compare with commercial kit «BioChek» (Netherlands) was 96 % and 100 % and compare with the «IDEXX» (USA) kit—92 % and 100 %, respectively. The ELISA test system has aimed to determine the level of antibodies to avian metapneumovirus (aMPV) and can be used for diagnosis of aMPV and evaluation of postvaccinal immunity.
«Российский ветеринарный журнал. Мелкие домашние и ликие животные» —
научно-практическое издание для специалистов в области ветеринарной медицины и биотехнологии.
Главный редактор — д-р вет. наук, профессор, руководитель Центра ветеринарной хирургии «ВетПрофАльянс» — С.А. Ягников. Издается с 2005 г. при поддержке «УМО высших учебных заведений РФ по образованию в области зоотехнии и ветеринарии», входит в Перечень ВАК ведущих рецензируемых научных журналов и изданий. Подписка на журнал осуществляется через редакцию и каталог Почта России. Издательский дом «Логос Пресс», 127018, Москва, ул. 2-я Ямская, д. 2. Http://logospress.ru/, e-mail: info@logospress.ru. Тел/факс: +7 (495) 220-48-16, +7 (495) 689-85-16.
