CC BY
324
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ♦ л абораторные методы ♦
УДК 619: 616.98: 578.826.1: 616-074
Оценка эффективности метода ИФА для выявления антител к вирусу ССЯ-76
М.А. Волкова, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник референтной лаборатории вирусных болезней птиц (volkovama@arriah.ru), Ир.А. Чвала (chvala_ia@arriah.ru), кандидат биологических наук, старший научный сотрудник референтной лаборатории вирусных болезней птиц, Н.С. Мудрак (mudrak@arriah.ru), доктор биологических наук, главный научный сотрудник референтной лаборатории вирусных болезней птиц Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ») (600901, г. Владимир, мкр. Юрьевец).
Синдром сниженияяйценоскости-76 (ССЯ-76) — инфекционная болезнь кур-несушек, вызываемая Duck adenovirus A. ССЯ-76 характеризуется размягчением, отсутствием или депигментацией скорлупы яиц и приводит к значительному снижению яичной продуктивности. В лабораторной практике для выявления антител к вирусу ССЯ-76 в сыворотках крови кур широко используют ИФА и РТГА.
Цель исследования. Определить основные валидационные характеристики метода ИФА для выявления антител к вирусу ССЯ-76 в сыворотках крови кур в рамках подготовки к аккредитации лаборатории по ГОСТ ИСО/МЭК 17025 и провести оценку эффективности его применения в лабораторных условиях.
Материалы и методы. Для выявления антител к вирусу ССЯ-76 в сыворотках крови кур методом РТГА и ИФА использовали коммерческие наборы производства ФГБУ «ВНИИЗЖ».
Результаты. Специфичность и чувствительность метода ИФА относительно РТГА составила 99,36 и 98,88 %, соответственно. При оценке воспроизводимости метода коэффициент вариации между разными сериями анализа не превышал 8 %. Точность выявления антител в ИФА по сравнению с РТГА была 99,25 %.
Заключение. Высокая повторяемость и воспроизводимость, а также хорошая согласованность результатов ИФА с РТГА позволяет использовать ССЯ-76-ИФА для проведения серологических исследований с целью лабораторной диагностики ССЯ-76, оценки иммунного статуса птиц и контроля поствакцинального иммунитета..
Ключевые слова: синдром снижения яйценоскости-76, иммуноферментный анализ, реакция торможения гемагглютинации, валидация
Сокращения: ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота, ИФА — иммуноферментный анализ, КВ — коэффициент вариации, ОП — оптическая плотность, отр — отрицательный, пол — положительный, РТГА — реакция торможения гемагглютинации, см — сомнительный, СПФ — свободные от патогенных факторов, ССЯ-76 — синдром снижения яйценоскости
Введение
Синдром снижения яйценоскости-76 (ССЯ-76) — инфекционная болезнь кур-несушек, характеризующаяся размягчением, отсутствием или депигментацией скорлупы яиц и сопровождающаяся значительным снижением яйценоскости. Впервые ССЯ-76 описан Van Eck et al. в 1976 г. [9]. Заболевания, вызываемые этим вирусом, регистрировали в Европе, Африке, Ираке, США, Японии и России [4, 5, 7].
Возбудитель ССЯ-76 — это ДНК-содержащий Duck adenovirus A, относящийся к семейству Adenoviridae, роду Atadenovirus, выделен от уток, но является патогенным для кур. Вирус ССЯ-76 проявляет гемагглю-тинирующую активность с эритроцитами кур, уток и гусей. Вирус имеет группоспецифический антиген, общий для представителей рода Atadenovirus, антигенный перекрест с вирусами рода Aviadenovirus отсутствует [6].
У кур через 2.. .3 недели после инфицирования, а также у цыплят, вылупившихся из яиц, снесенных больными курами, наблюдается выработка специфических антител. Переболевшие куры приобретают продолжительный напряженный иммунитет. Для специфической профилактики применяют главным образом инак-
тивированные вакцины, разработаны и применяются также генно-инженерные вакцины [1]. Для серологической диагностики ССЯ-76 и контроля напряженности поствакцинального иммунитета используют РТГА, реакцию нейтрализации и ИФА [3, 9].
В настоящее время подтверждением технической компетентности лаборатории и достоверности проводимых в ней исследований является аккредитация, то есть независимая экспертная оценка качества выполняемых диагностических работ. Современные требования по аккредитации, предъявляемые к испытательным лабораториям ветеринарного профиля, подразумевают валидацию и оценку эффективности используемых методов (в том числе коммерческих наборов) в соответствии с ГОСТ ИСО/МЭК 17025 [2]. К основным валидационным характеристикам метода относятся специфичность, чувствительность, а также правильность (точность) и воспроизводимость результатов исследования [8]. Для оценки эффективности метода используют несколько способов, в том числе сравнение с результатами, полученными другим методом, и межлабораторные сличительные испытания [2].
Цель исследования
Определить основные характеристики метода ИФА для выявления антител к вирусу ССЯ-76 в сыворотках крови кур и провести оценку эффективности его применения в лабораторных условиях.
Материалы и методы
РТГА. Выявление антител к вирусу ССЯ-76 методом РТГА проводили с использованием коммерческого набора производства ФГБУ «ВНИИЗЖ» по инструкции производителя. Результат реакции считали положительным при титре антител 4 1с^2 и выше.
-Л .я .7
Разведение сыворотки, Log2
□ титр 6 РТГА СТ"':; в ИФА
Рис. 1. Определение чувствительности ССЯ-76-ИФА в сравнении с РТГА при параллельном тестировании серии двукратных разведений гипериммунной сыворотки крови кур к вирусу ССЯ-76 (жирной и пунктирной линиями обозначен позитивно-негативный порог для ИФА и РТГА, соответственно)
Fig. 1. Detection of EDS-76 ELISA sensitivity in comparison with HI by parallel testing of series twofold dilutions of hyperimmune EDS-76 virus serum (bold and dotted lines indicate the positive-negative threshold for ELISA and HI, accordingly)
15345 J I i I 136Д7 13714
■ Iii*
До
вакцинации
21
SO
120
зо 60
Возраст птиц, сутки
Рис. 2. Результаты определения уровня антител к вирусу ССЯ-76 в сыворотках крови кур-несушек до и в различные сроки после вакцинации инактивированной вакциной против ССЯ-76 Fig. 2. Results of detection of the EDS-76 antibody level in sera of layers before and at different times after immunization of EDS-76 inactivated vaccine
25000 20000 gi.™-;! ^ 10000
■ 5000 0
7340 8547
330 20
12
40
BS
241
267
307
120 1S6 208
Возраст птиц, сутки
Рис. 3. Результаты определения уровня антител к вирусу ССЯ-76 в сыворотках крови ремонтного молодняка, молодок и кур-несушек Fig. 3. Results of detection of the EDS-76 virus antibody level in sera of rearing, pullets and layers
2500 2000 1500 1000 500 О
1076 206
I
ob . 5 <± _ . 3 ± _ S
94 152 167 174 180 200
Возраст птиц, сутки
Рис. 4. Результаты определения уровня антител к вирусу ССЯ-76 в сыворотках крови кур яичного направления: 1 — средний титр антител по группе, 2 — средний титр антител положительных проб Fig. 4. Results of detection of the EDS-76 virus antibody level in chicken sera from layer hens: 1) mean antibody titer, 2) mean antibody titer of positive samples
ИФА. Антитела к вирусу ССЯ-76 в непрямом варианте ИФА выявляли с использованием коммерческого набора производства ФГБУ «ВНИИЗЖ» по инструкции производителя. Результат реакции считали положительным при титре антител 1100 и выше (за титр принимали величину, обратную разведению сыворотки).
Основные характеристики метода ИФА определяли в сравнении с традиционным методом исследования — РТГА.
Результаты и обсуждение
Определение специфичности. Для определения специфичности ССЯ-76-ИФА сыворотки крови от группы СПФ-цыплят 3-х недельного возраста исследовали в ИФА и РТГА (табл. 1). Оба метода показали при этом 100%-ю специфичность.
Для подтверждения специфичности ССЯ-76-ИФА были использованы также специфические сыворотки крови кур к вирусам инфекционной бурсальной болезни, инфекционного бронхита кур, ньюкаслской болезни, инфекционного энцефаломиелита, инфекционного ла-ринготрахеита, гриппа птиц, реовирусу и микоплазмам («Synbiotics», США). Было показано, что активность антигена вируса ССЯ-76 с гетерологичными сыворотками не превышала фоновый уровень (реакция с неиммунной сывороткой).
Определение пороговой чувствительности. Данные, представленные на рисунке 1, показывают, что ССЯ-76-ИФА демонстрирует высокую пороговую чувствительность в сравнении с традиционным тестом РТГА при выявлении специфических антител к вирусу ССЯ-76. Минимальному положительному результату в РТГА, равному 4 log2, соответствовало значение титра антител в ИФА, равное 10,09 log2 (1088). Это соответствует пороговым значениям, установленным в инструкции по применению набора для выявления антител к вирусу ССЯ-76 в ИФА (положительные пробы должны иметь титр антител выше 1100).
Определение воспроизводимости и правильности результатов. Воспроизводимость ИФА оценивали по коэффициенту вариации в пределах одной постановки и между постановками, повторно исследуя 3 образца сыворотки крови с различной концентрацией антител. Коэффициент вариации в пределах одной постановки оценивали по 12 определениям, коэффициент вариации между постановками — по 6 определениям, выполненным в течение разных дней (табл. 2).
Вариабельность в пределах одного анализа (один планшет) для измерения в двенадцати повторностях была менее 6 %. Вариабельность между сериями анализа, определенная по измерениям в шести повторностях в четырех разных сериях анализов (на 4 планшетах), была менее 8 %.
Определение правильности (точности) результатов ССЯ-76-ИФА проводили в Proficiency Testing (PT), организованном в 2015 г. лабораторией Dutch Animal
1. Титры антител к вирусу ССЯ-76 в сыворотках крови от СПФ-цыплят 3-х недельного возраста 1. EDS-76 virus antibody titers in sera from 3-weeks-old SPF-chicks
Реакция Положительные/ исследованные Среднее значение титра антител ± стандартная ошибка средней Минимум-максимум
ИФА 0/40 62±28 1...190
РТГА (log2) 0/40 0,63±0,08 0,5...1,0
2. Результаты исследования сывороток крови в ССЯ-76-ИФА
при тестировании проб в одной и нескольких постановках
реакции 2. Results of sera testing in EDS-76 ELISA in one or several runs
of the assay
Уровень антител к вирусу ССЯ-76 в сыворотке крови n=12 (1 планшет) n=6x4 (4 планшета)
Средняя ОП в разведении 1:400 Средний КВ Средняя ОП в разведении 1:400 Средний КВ
Низкий 0,287 3,54 0,292 6,26
Средний 0,501 4,01 0,514 6,59
Высокий 0,847 5,87 0,865 7,71
Оценка эффективности метода ИФА для выявления антител к вирусу ССЯ-76
3. Исследование сывороток крови кур на наличие антител к вирусу ССЯ-76
3. Testing chicken sera to detect EDS-76 virus antibodies
№ Титр антител в ИФА Титр антител в РТГА, log2
образца 1-я 2-я 1-я 2-я
повторность повторность повторность повторность
№1 1640(пол) 1343(пол) 5 (пол) 5 (пол)
№2 32(отр) 4(отр) 0,5 (отр) 0,5 (отр)
№3 1163(пол) 1130(пол) 5(пол) 5 (пол)
№4 4984 (пол) 5327(пол) 6 (пол) 6(пол)
№5 1728(пол) 2017(пол) 5 (пол) 5 (пол)
№6 1615(пол) 1886 (пол) 5 (пол) 5 (пол)
№7 0 (отр) 0(отр) 0,5 (отр) 0,5 (отр)
№8 798 (см) 1032 (см) 4 (пол) 5 (пол)
Примечание. №1 — сыворотка крови от 70-недельных СПФ-несушек, вакцинированных препаратом Gallimune ND+IB+EDS+ART, отобранная через 28 суток после вакцинации;
№2 — сыворотка крови от 12-недельных СПФ-бройлеров, инфицированных аденовирусом, отобранная через 21 сутки после заражения;
№3 — сыворотка крови от 66-недельных СПФ-несушек, вакцинированных препаратом Nobilis RT-IBmulti+ND+EDS, отобранная через 6 недель после вакцинации; №4 — сыворотка крови от 30-недельных коммерческих несушек; №5 — сыворотка крови от 45-недельных СПФ-несушек, вакцинированных препаратом РоЫуас I-EDS, отобранная через 33 суток после вакцинации;
№6 — сыворотка крови от 66-недельных СПФ-несушек, вакцинированных препаратом Nobilis RT-IBmulti+ND+EDS, отобранная через 6 недель после вакцинации; №7 — сыворотка крови от СПФ-несушек 7-недельного возраста; №8 — сыворотка крови от 14-недельных СПФ-несушек, вакцинированных препаратом Nobilis RT+IBM+ND+EDS, отобранная через 16 недель после вакцинации. Образцы сывороток №1, 3, 5, 6 и 8 предварительно (до сушки) были разведены в сыворотке крови СПФ-кур 1:10...1:50.
4. Результаты исследования сывороток крови кур в ИФА и РТГА 4. Results of testing chicken blood samples by ELISA and HI
ИФА РТГА
Положительные Отрицательные Итого
Положительные 309 1 310
Отрицательные 2 88 90
Итого 311 89 400
Health Service, Deventer (R&D GD), Нидерланды. В EDS-76 antibody Ring Trial принимали участие 35 лабораторий из 18 стран. Для исследования была представлена панель сывороток крови кур, содержащая 8 лиофилизированных образцов. Результаты тестирования сывороток крови в ИФА и РТГА представлены в таблице 3.
Результаты исследования образцов крови в ИФА в целом совпадали с данными «золотого стандарта», то есть РТГА, за исключением пробы №8, которая была положительной в РТГА и показала сомнительный результат в ИФА. Статус проб в РТГА совпадал с данными, представленными другими 21 лабораториями-участниками PT.
Определение относительной чувствительности и специфичности ССЯ-76- ИФА (в сравнении с РТГА). Для
сравнения результатов ИФА с базовым тестом РТГА было исследовано 400 сывороток крови, поступивших из нескольких птицехозяйств РФ, применяющих вакцинацию против ССЯ-76. Результаты параллельного исследования сывороток на наличие антител к вирусу ССЯ-76 представлены в таблице 4. Относительная чувствительность и специфичность ССЯ-76-ИФА относительно РТГА составила 99,36 и 98,88 %, соответственно. Точность выявления антител к вирусу ССЯ-76 в ИФА относительно РТГА составила 99,25 %.
Применение ССЯ-76-ИФА. Иммунизацию против ССЯ-76 с использованием инактивированных вакцинных препаратов проводят обычно в возрасте 90.. .120 суток. Для контроля поствакцинального иммунитета пробы отбирают через различные сроки после вакцинации (начиная с 21.28-х суток, в зависимости от рекомендаций производителя). На рисунке 2 представлены дан-
ные, полученные при исследовании в ССЯ-76-ИФА 50 проб сыворотки крови, доставленных из одной из птицефабрик РФ, применяющих вакцинацию против ССЯ-76. До вакцинации антител к вирусу ССЯ-76 не выявлено, пик выработки специфических антител определили через 2 месяца после применения вакцины.
Поскольку заболевание ССЯ-76 проявляется у взрослой птицы в период начала яйцекладки, сыворотки крови исследуют с диагностическими целями на наличие антител к вирусу ССЯ-76 в возрастной группе от 100 суток и выше. При необходимости исследуют пробы от птицы меньшего возраста с целью контроля материнского иммунитета или обнаружения скрытой (персис-тирующей) инфекции. На рисунке 3 представлены результаты скринингового исследования, проведенного на птицефабрике яичного направления. Было исследовано по 10 проб от каждой возрастной группы (всего 90 проб). В группе 12-суточных цыплят антитела к вирусу ССЯ-76 были выявлены только у одного цыпленка. У птиц 40- и 85-суточного возраста специфические антитела не выявили. У птиц старшего возраста, привитых инактивированной вакциной против ССЯ-76, наблюдали нарастание среднего титра антител с 120-х до 267-е сутки и снижение в возрасте 307 суток.
При скрининговых исследованиях на птицефабрике яичного направления, которая не применяет вакцинацию против ССЯ-76 (рис. 4), из 60 проб в двух сыворотках крови от кур 167- и 180-суточного возраста были выявлены антитела к вирусу ССЯ-76. При обнаружении положительных проб от невакцинирован-ного поголовья птиц необходимы повторные исследования на птицефабрике с интервалом не менее 2 недель с целью исключения инфицирования стада вирусом ССЯ-76.
Таким образом, использование ССЯ-76-ИФА обеспечивает надежный контроль иммуногенной эффективности вакцинных препаратов против ССЯ-76 и позволяет проводить широкомасштабный серологический мониторинг распространения ССЯ-76 в популяциях сельскохозяйственных птиц.
Выводы
В результате проведенной оценки метод ССЯ-76-ИФА показал высокую специфичность и чувствительность (99,36 и 98,88 %, соответственно относительно РТГА), воспроизводимость (коэффициент вариации не выше 8 % между разными сериями анализа) и правильность. Согласованность результатов ИФА с РТГА (точность выявления антител 99,25 %) позволяет использовать его как эффективный инструмент для проведения диагностических исследований, оценки иммунного статуса птицы и контроля поствакцинального иммунитета.
Библиография
1. Борисов, В.В. Инактивированная вакцина против синдрома снижения яйценоскости-76 / В. В. Борисов, Д. А. Лозовой, О. А. Борисова [и др.] // Аграрная Россия. — 2001. — №3. — С. 52-55.
2. ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009 «Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий».
3. Biswas, P. Serosurvey of five viruses in chickens on smallholdings In Bangladesh / Biswas P., Barua H., Uddin G. [et all.] //Preventive veterinary medicine. — 2009. — Vol. 88. — P. 67-71.
4. Darbyshire, J. Studies on EDS-76 virus infection in laying chickens /J. Darbyshire, R. Peters //Avian Pathology. — 1980. — Vol. 9 (3). — P. 277-290.
5. Ezeibe, M. Seroprevalence of egg drop syndrome-76 virus as cause of poor egg productivity of poultry in Nsukka, South East Nigeria / M. Ezeibe, O. Okoroafor, J. Eze, I. Eze // Trop Anim Health Prod. — 2008. — Vol. 40 (2). — P. 137-140.
6. Hafez, H.M. Avian adenoviruses infections with special attention to inclusion body hepatitis/hydroperi-cardlum syndrome and egg drop syndrome / H.M. Hafez //Pakistan Veterinary Journal. — 2011. — Vol. 31 (2) — P. 85-92.
7. Mohapatra, N. Egg drop syndrome-76 (EDS-76) in Japanese quails (Coturnix coturnix japonica): an experimental study revealing pathology, effect on egg production/quality and immune responses / N. Mohapatra, J. Kataria, S. Chakraborty, K. Dhama // Pak. J. Biol. Sci. — 2014. — Vol. 17 (6). — P. 821-828.
8. Rabenau, H. Verification and validation of diagnostic laboratory tests in clinical virology / H. Kessler, M. Kortenbusch [et all.] // Journal of clinical virology. — 2007. — Vol. 40. — P. 93-98.
9. Van Eck, J. Serological examination and egg production of progeny of fowl experimentally infected with egg drop syndrome 1976 virus // Vet Q. — 1982. — Vol. 4 (3). — P. 117-123.
References
1. Borisov V.V., Losovoy D.A., Borlsova O.A. [et all.], Agrarian Russia, 2001, No. 3, pp. 52-55.
2. ISO/IEC 17025. General requirements for the competence of testing and calibration laboratories.
3. Biswas, P., Barua H., Uddin G. [et all.] Serosurvey of five viruses in chickens on smallholdings In Bangladesh //Preventive veterinary medicine, 2009, Vol. 88, pp. 67-71.
4. Darbyshire J., Peters R. Studies on EDS-76 virus infection in laying chickens Avian Pathology, 1980, Vol. 9 (3), pp. 277-290.
5. Ezeibe, M., Okoroafor O., Eze J., Eze I. Seroprevalence of egg drop syndrome-76 virus as cause of poor egg productivity of poultry in Nsukka, South East Nigeria //Trop Anim Health Prod, 2008, Vol. 40 (2), pp. 137-140.
6. Hafez, H.M. Avian adenoviruses infections with special attention to inclusion body hepatitis/hydroperi-cardium syndrome and egg drop syndrome //Pakistan Veterinary Journal, 2011, Vol. 31 (2), pp. 85-92.
7. Mohapatra N., Kataria J., Chakraborty S., Dhama K. Egg drop syndrome-76 (EDS-76) in Japanese quails (Coturnix coturnix japonica): an experimental study revealing pathology, effect on egg production/quality and immune responses // Pak. J. Biol. Sci., 2014, Vol. 17 (6), pp. 821-828.
8. Rabenau, H., Kessler H., Kortenbusch M. [et all.] Verification and validation of diagnostic laboratory tests in clinical virology //Journal of clinical virology, 2007, Vol. 40, pp. 93-98.
9. Van Eck, J. Serological examination and egg production of progeny of fowl experimentally infected with egg drop syndrome 1976 virus // Vet Q, 1982, Vol. 4 (3), pp. 117-123.
ABSTRACT
M.A. Volkova, Ir.A. Chvala, N.S. Mudrak
Federal Centre for Animal Health (ARRIAH) (600901, Vladimir, microdistrict. Yurievets).
Evaluation of Efficiency of ELISA for Detection of Antibodies to EDS-76 Virus. Egg drop syndrome-76 (EDS-76) is an infectious disease in layer hens caused by Duck adenovirus A. EDS-76 is manifested in soft-shelled or shell-less eggs and depigmentation and by a quick drop in egg production. The indirect ELISA and HI are used to detect and quantify antibodies to EDS-76 virus in chicken sera.
The goal of this study. Definition of the main validation parameters ELISA method for detection of antibodies to EDS-76 virus according ISO 17025 and estimation of efficiency of using this method in the laboratory. Materials and Methods. The humoral immune responses were determined by means of ELISA and hemagglutination inhibition test (FGBI «ARRIAH»).
Results. Specificity and sensitivity of this method compared to HI is 99,36 and 98,88% accordingly. During estimation of reproducibility of the method the coefficient of variation between different lots of the analysis did not exceed 8%. The accuracy of the detection of antibodies in the ELISA in comparison with HI was 99.25%.
Conclusion. High repeatability and reproducibility, as well as great compliance of ELISA with HI, allow using EDS -76-ELISA for serological assays with a goal of laboratory diagnosis of EDS -76, evaluation of immune status of birds and control of postvaccinal immunity.
Keywords: egg drop syndrome-76, enzyme-linked immunosorbent assay, hemagglutination inhibition, validation.
Неблагополучие по болезням птицы в 2015 г.
Сокращения: ИББ — инфекционная бурсальная болезнь, БМ — болезнь Марека, БН — болезнь Ньюкасла
