CC BY
238
Данная научная работа проведена при финансовой поддержке ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» и Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках Государственного контракта № 14.518.11.7035.
ЛИТЕРАТУРА (пп. 1, 2, 6, 11,12 см.
references)
3. Сергеев Ал.А., Булычев Л.Е., Пьянков О.В., Сергеев Ар.А., Бод-нев С.А., Кабанов А.С. и др. Чувствительность различных видов животных к вирусу оспы обезьян. Проблемы особо опасных инфекций. 2012; 1 (111): 88-92.
4. Кабанов А.С., Сергеев Ал.А., Шишкина Л.Н., Булычев Л.Е., Скарнович М.О., Сергеев Ар.А. и др. Сравнительное изучение противовирусной активности химических соединений в отношении ортопоксвирусов в экспериментах in vivo. Вопросы вирусологии. 2013; 4: 39-43.
5. Сергеев Ал.А., Кабанов А.С., Булычев Л.Е., Пьянков О.В., Сергеев Ар.А., Таранов О.С. и др. Использование мышей в качестве модельного животного для оценки эффективности лечебно-профилактического действия разрабатываемых препаратов против оспы обезьян. Проблемы особо опасных инфекций. 2013; 2: 60-5.
7. Руководство по содержанию и использованию лабораторных животных: Пер. с англ. Вашингтон: National Akademy Press; 1996.
8. Закс Л. Статистическое оценивание. М.: Статистика; 1976.
9. Струков А.И. Инфекционные болезни. Available at: http:// vmede.org/sait/?page=28&id=Anatomija_patologicheskaja_ strukov_2010&menu=Anatomija_patologicheskaja_strukov_2010. (Дата обращения 16.12.2013).
10. Бороноев С.А. Клиническая оториноларингология. Учебно-методическое пособие. Улан-Удэ: Издательство Бурятского госуниверситета; 2008.
REFERENCES
1. Hutson C.L., Carroll D.S., Self J., Weiss S., Hughes C.M., Braden Z. et al. Dosage comparison of Congo Basin and West African strains of monkeypox virus using a prairie dog animal model of systemic orthopoxvirus disease. Virology. 2010; 402 (1): 72-82.
2. Zaucha G., Jahrling P., Geisbert T., Swearengen J., Hensley L. The pathology of experimental aerosolized monkeypox virus infection in
cynomolgus monkeys (macaca fascicularis). Lab. Invest. 2001; 81: 1581-600.
3. Sergeev Al.A., Bulychev L.E., Piankov O.V., Sergeev Ar.A., Bod-nev SA., Kabanov A.S. et al. Sensitivity of different animal types to monkeypox virus. Problemy osobo opasnykh infektsiy. 2012; 1 (111): 88-92. (in Russian)
4. Kabanov A.S., Sergeev Al.A., Shishkina L.N., Bulychev L.E., Skar-novich M.O., Sergeev Ar.A. et al. Comparative studying antiviral activity of chemical compounds concerning of orthopoxviruses in vivo experiments. Voprosy virusologii. 2013; 4: 39-43. (in Russian).
5. Sergeev Al.A., Kabanov A.S., Bulychev L.E., Piankov O.V., Sergeev Ar.A., Taranov O.S. et al. Exploitation of mouse model for assessment of therapeutic and prophylactic efficacy of drugs against monkeypox. Problemy osobo opasnykh infektsiy. 2013; 2: 60-5. (in Russian)
6. Leparc-Goffart I., Poirier B., Garin D., Tissier M.H., Fuchs F., Crance J.M. Standartization of a neutralizing anti-vaccinia antibodies titration method: an essential step for titration of vaccinia immunoglobulins and smallpox vaccines evaluation. J. Clin. Virol. 2005; 32 (1): 47-52.
7. The Guide to the Care and Use of Laboratory Animals. [Rukovodstvo po soderzhaniyu i ispol'zovaniyu laboratornykh zhivotnykh]: Transl. from Engl. Vashington: National Academy Press; 1996. (in Russian)
8. Zaks L. Statistical Estimation [Statisticheskoe otsenivanie]. Moscow: Statistika; 1976. (in Russian)
9. Strukov A.I. Infectious diseases. Avaiable at: http://vmede. org/sait/?page = 28&id=Anatomija_patologicheskaja_ strukov_2010&menu=Anatomija_patologicheskaja_strukov_2010. ( Access 16 December 2013) (in Russian)
10. Boronoev S.A. Clinical Otolaryngology. Teaching Aid. [Kliniches-kaya otorinolaringologiya. Uchebno-metodicheskoe posobie]. Ulan-Ude: Izdatel'stvo Buryatskogo gosuniversiteta; 2008. (in Russian)
11. Americo J.L., Moss B., Earl P.L. Identification of wild-derived Inbred mouse strains highly susceptible to monkeypox virus Infection for use as small animal models. J. Virol. 2010; 84 (16): 8172-80.
12. Hutson C.L., Olson V.A., Carroll D.S., Abel J.A., Hughes C.M., Braden Z.H. et al. A prairie dog animal model of systemic orthopox-virus disease using West African and Congo Basin strains of mon-keypox virus. J. Gen. Virol. 2009; 90 (Pt. 2): 323-33.
Поступила 27.03.14
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015 УДк 578.831.1/.578.832].083.3
Виткова О.Н.1, Капустина О.В.2, Лобова Т.П.1, Михайлова В.В.1, Сафонов Г.А.5, Власова Н.Н.3, Белоусова Р.В.4
Сравнительное изучение чувствительности и специфичности иммуноферментного анализа с хемилюминесцентной и колориметрической детекцией для выявления антигенов и антител к вирусам гриппа птиц и болезни Ньюкасла
1ФГБУ «Центральная научно-методическая ветеринарная лаборатория» Россельхознадзора, 111622, г. Москва; 2ГНУ «Всероссийский НИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии» Российской академии сельскохозяйственных наук, 601120, г. Покров; 3ФГБУ «Федеральный
центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ») Россельхознадзора, 600901, г. Владимир; 4ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологи» Министерства сельского хозяйства Российской Федерации, 109472, г. Москва;
'Российская академия наук, 117334, г. Москва
В статье представлены результаты исследований по разработке твердофазного иммуноферментного анализа (ТФ ИФА) с иммунохемилюминесцентной (ИХА) и колориметрической детекцией для выявления специфических вирусных антигенов и антител при диагностике гриппа птиц и болезни Ньюкасла. Показана высокая специфичность и чувствительность ИХА, которая в 10-50 раз превышает таковую ИФА с колориметрическим методом детекции. высокая результативность наряду с автоматизацией процесса лабораторного исследования (использование планшетного люминометра) позволяют рекомендовать ИХА для включения в число методов для первичного скрининга указанных инфекций.
К л ю ч е в ы е с л о в а: иммуноферментный анализ; хемилюминесцентная детекция; иммунохемилюминесцентный анализ; твердофазный иммуноферментный анализ; грипп птиц; болезнь Ньюкасла; перокси-даза хрена; люминометрический метод; люминол.
Для цитирования: Вопросы вирусологии. 2015; 60 (6): 41-45.
Для корреспонденции: Виткова Ольга Николаевна, канд. вет. наук, зам. директора по диагностической работе; e-mail: olgavitkova@mail.ru
Vitkova O.N.1, Kapustina O.V.2, Lobova T.P.1, Mikhailova V.V.1, Safonov G.A.5, Vlasova N.N.3, Belousova R.V.4
Comparative research into sensitivity and specificity of immune-enzyme analysis with chemiluminescence and colorimetric detection for detecting antigens and antibodies to avian influenza viruses and newcastle disease
1Central Scientific-Methodological Veterinary Laboratory, Federal Service for Veterinary and Phytosanitary Surveillance, 111662, Moscow, Russia; 2 All-Russia Scientific-Research Institute of Veterinary Virology and Microbiology, Russian Academy of Agricultural Sciences, 601120, Pokrov, Russia; 3Federal Center for Animal Health Protection, Federal Service for Veterinary and Phytosanitary Surveillance, 600901, Vladimir, Russia; 4Moscow State Academy of Veterinary Medicine and Biotechnology, Ministry of Agriculture of the Russian Federation, 109472, Moscow, Russia; 5Russian
Academy of Sciences, 117334, Moscow, Russia
The goal of this work was to demonstrate the results of the development of the enzyme-linked immunosorbent tests with chemiluminescence detection and colorimetric detection of specific viral antigens and antibodies for identifying the avian influenza and the Newcastle disease viruses: high sensitivity and specificity of the immuno-chemiluminescence assay, which are 10-50 times higher than those of the ELiSA colorimetric method. The high effectiveness of the results and the automation of the process of laboratory testing (using a luminometer) allow these methods to be recommended for including in primary screening tests for these infectious diseases.
Key words: enzyme immunoassay; chemiluminescence detection; immuno-chemiluminescence analysis; enzyme-linked immunosorbent assay; avian influenza; Newcastle disease; horseradish peroxidase; luminometric method; luminol.
Received 24.03.14
For correspondence: Ol'ga Vitkova , Candidate of veterinary Sciences; e-mail:olgavitkova@mail.ru
Citation: Voprosy virusologii. 2015; 60(6): 41-45. (In Russ.)
Введение
Грипп птиц (ГП) и болезнь Ньюкасла (БН) являются значимыми высококонтагиозными инфекционными болезнями птиц, которые остаются актуальной проблемой птицеводства [1—4]. В последние годы ГП типа А регистрировали в различных странах мира. В 2013 г., по данным МЭБ, вспышки ГП отмечались в 13 странах - наибольшее количество в Китае, Камбодже, Австралии, Мексике, Непале, Италии, в 2014 г. в 11 странах - наибольшее в Китае, Вьетнаме, Корее. В 2013-2014 гг. часто выявляли подтипы вируса, имеющие антигенные формулы Н5Ш, Н5Ш, Н5Ш, Н5Ш, Н7№, Н7Ю, Н7Ш, Н7Ш [5-7].
Эпизоотологический и серологический мониторинг -важное звено в контроле распространения инфекционных болезней [8, 9]. В лаборатории Российской Федерации для диагностики ГП и БН поступают тысячи проб патологического материала и сывороток крови от птиц различных видов. Так, в 2013 г. в целях выявления вируса БН и специфических антител к нему исследовано 3635 проб патма-териала и более 52 тыс. проб сыворотки крови. Для диагностики ГП исследовано 107 457 проб патологических и биологических материалов и более 570 тыс. проб сыворотки. В ветеринарных лабораториях России для диагностики данных инфекций используют классические методы - вирусологический и реакцию торможения гемагглютинации (РТГА), а также современные методы иммуноферментного анализа (ИФА) и полимеразную цепную реакцию.
Современные тенденции разработки новых и совершенствования существующих методов и диагностических тест-систем направлены на повышение чувствительности и специфичности при выявлении вирусных антигенов и соответствующих специфических антител. Перспективными представляются исследования по повышению чувствительности ИФА при использовании флюоресцентных и хемилюминесцентных субстратов. Одним из современных методов лабораторной диагностики иммунологического профиля является иммунохе-милюминесцентный анализ (ИХА) [9, 10].
Принцип метода заключается во взаимодействии лю-минола и перекиси водорода в присутствии пероксидазы хрена, конъюгированной с вторичными антителами, что приводит к образованию окисленного люминола, который обладает люминесцентным свечением. Интенсивность хемилюминесценции пропорциональна количеству исследуемого белка (антигена, антител) в пробе. Исполь-
зование люминометрического метода исследований в ветеринарии находится только на начальном этапе.
В задачи исследований входили разработка ИФА с хе-милюминесцентной детекцией; сравнительное изучение чувствительности и специфичности ИХА и ИФА с колориметрической детекцией при выявлении специфических антигенов и антител для диагностики ГП и БН.
Материалы и методы
Для исследования использовали компоненты, входящие в набор препаратов на основе моноклональных антител (МКА) для дифференциальной диагностики ГП и БН твердофазным иммуноферментным методом серии № 2 от 2012 г. производства ГНУ ВНИИВиМ; компоненты, входящие в набор для выявления антител к вирусу ГП с помощью ТФ ИФА серии № 3 от 2013 г. производства НПП «Авивак»; антигены вирусов ГП и БН; пероксидазные конъюгаты соответствующих МКА; нативные антигены в виде инактивированной 0,1% тео-тропином экстраэмбриональной жидкости эмбрионов кур (ЭЭЖ ЭК), инфицированных вирусами ГП (антиген 1) штамм АЛет^оиШ АИлса/61/ Н5Ю; ГП штамм А/цыпленок/Росток/34/Н7Ш (антиген 2); вирусом БН штамм велогенный Томилинский-53 (антиген 3); ленто-генный штамм Ла-Сота (антиген 4); 20% суспензию внутренних органов птиц, экспериментально зараженных вирусом БН штамм Томилинский-53, осветленную низкоскоростным центрифугированием (антиген 5); смесь антигенов ГП и БН (антиген 6); рекомбинантный нукле-опротеин ^ек КР) вируса гриппа типа А, полученный в прокариотической системе экспрессии, и концентрированный культуральный антиген вируса инфекционной бурсальной болезни (ИББ) штамм 'МШейеМ 2512. Используемые специфические антигены имели активность в твердофазном ИФА (ТФ ИФА) не ниже 1:1024.
Для отработки оптимальных параметров анализа в качестве модельной тест-системы выбран двойной антительный сэндвич-вариант ТФ ИФА (ДАС ТФ ИФА) на основе неконкурирующих между собой МКА к ну-клеопротеинам вирусов ГП и БН, иммобилизованных на поверхности полистиролового планшета, и антитела, меченные ферментом, - пероксидазой хрена. Эта система является одной из наиболее распространенных для анализа поливалентных антигенов.
В качестве окислителя использовали перекись водорода, а активность пероксидазы оценивали по интенсивности
Таблица 1
Выявление специфических антигенов вирусов ГП и НБ в ДАС ТИФА с хемилюминесцентной детекцией
Исследуемая проба
Рабочая доза конъюгата МКА*
RLU-1000 в разведении 1 10 RLU-1000
ГП БН ГП БН
Антиген БН лиофилизированный** 551±0,10 70484±0,15 86±0,09 6982±0,20
Антиген ГП лиофилизированный** 1187±0,12 5883±0,10 66078±0,10 761±0,17
Антиген 1 ГП H5N3 ЭЭЖ ЭК (нативный) 2966±0,01 3294±0,07 415±0,14 396±0,21
Антиген 2 ГП H7N1 ЭЭЖ ЭК (нативный) 3251±0,15 2587±0,10 385±0,12 417±0,15
Антиген 3 НБ ЭЭЖ ЭК (нативный) 345±0,20 40605±0,12 78±0,30 3187±0,10
Антиген 4 БН + ГП ЭЭЖ ЭК (нативный) 626±0,14 43139±0,20 198±0,07 5197±0,30
Антиген 5 БН - суспензия внутренних органов (нативный) 814±0,08 15679±0,15 81±0,15 2654±0,07
Контроль конъюгата 522±0,05 5588±0,10 95±0,09 816±0,04
П р и м е ч а н и е. * - использована рабочая доза конъюгата МКА к нуклеопротеину вирусов ГП и БН, отработанная для колориметрического ТФ ИФА; ** - компоненты из набора препаратов на основе МКА для дифференциальной диагностики ГП и БН; в таблице приведены средние данные по трем повторам (и = 3).
образующейся хемилюминесценции. Учет реакции проводили с помощью детектора - низкошумового фотоумножителя (многоканальный планшетный люминометр LB 960 Centro XS3, "Berthold Technologies") и выражали в светое-диницах RLU. Учет реакции при колориметрическом методе детекции осуществляли с помощью Multiskan MCC 340 ("Labsystems", Финляндия) при X = 405 нм. Реакцию считали положительной и специфичной, если показания оптической плотности (ОП) в лунках с испытуемыми сыворотками (антигеном) превышали показания ОП в лунках с нормальной сывороткой (антигеном) в 2,1 раза и более.
Для постановки ИХА и ТФ ИФА использовали соответственно непрозрачные белые и прозрачные полистироловые 96-луночные планшеты для ИФА (Unifilter и Nunc immunoplate).
Дозу сенсибилизации планшет соответствующими МКА или специфическими антигенами, рабочую дозу специфического или антивидового конъюгатов определяли методом перекрестного (шахматного) титрования.
Для выявления специфических антител использовали гипериммуные сыворотки крови кур (SS) против ГП, БН и ИББ, а также пробы сыворотки крови от домашней птицы Можайского района Московской области, привитой инактивированной вакциной (Покровский завод биопрепаратов) против ГП подтипа Н5 (S H5), и пробы сыворотки крови птиц, присланные из различных регионов Российской Федерации для мониторинговых исследований в ФГБУ ЦНМВЛ (SS); сыворотку специфическую (SS) свиней к H5N1; сыворотку специфическую (SS) свиней к вирусу классической чумы свиней (КЧС).
Относительное содержание специфических антител в сыворотках крови животных выражали в международных ИФА-единицах EU и определяли по формуле:
EU = КХОП пробы-^ОП К")/(ХОП стандарт-^ОП К")]-100,
где ХОП — сумма значений ОП при определенной длине волны в зависимости от субстрата; ОП К- - ОП отрицательного контроля; стандарт - эталонная специфическая положительная сыворотка.
EU = [(XRLU пробы-XRLU K")/(2RLU стандарт-XRLU К")]-100,
где XRLU — сумма значений световых единиц; RLU К- RLU отрицательного контроля; стандарт - эталонная специфическая положительная сыворотка.
Результаты и обсуждение
Изучена возможность применения в аналитической практике катионной пероксидазы хрена в ИФА с хеми-люминесцентной детекцией.
Результаты исследований по выявлению специфических
антигенов вирусов ГП и БН в ДАС ТФ ИФА представлены в табл. 1. Они свидетельствуют о том, что ИХА является специфическим чувствительным методом для выявления антигенных детерминант вирусов. Расчет соотношения значений сигнал/фон показал, что при использовании конъюгата в рабочей дозе для ДАС ТФ ИФА с колориметрической детекцией оно составило для вируса гриппа от 2,1 до 5,4. При разведении рабочей дозы конъюгата МКА в 10 раз происходит снижение фоновой реакции и повышение специфического взаимодействия антиген/антитело. Соотношение сигнал/фон увеличилось на порядок и составило 4,4-6,9 и 3,2-8,5 для вируса ГП и БН соответственно.
Для сравнительного изучения чувствительности методов нами была использована ЭЭЖ ЭК, инфицированных вирусом БН штамм Томилинский-53 и вирусом ГП подтипа Н5 (АЛет^оиШ Айса/61/ Н5Ю) с исходным титром инфекционной активности 8,5 ^ ЭЛД50/см3. В табл. 2 показаны результаты выявления антигенов нуклеопро-теина вирусов методом ДАС ТФ ИФА при колориметрическом и хемилюминесцентном методах детекции.
Полученные данные указывают на то, что ИФА с хеми-люминесцентной детекцией позволяет выявлять специфический антиген как вируса ГП, так и вируса БН в разведении пробы до 10-7, что на порядок выше, чем при колориметрическом методе детекции, т. е. методом ИХА можно выявлять инфицированный материал с титром инфекционной активности 1-1,5 ^ ЭЛД50/см3 и выше.
Сравнительное изучение чувствительности и специфичности непрямого ТФ ИФА с колориметрической детекцией и ИХА для выявления специфических антител
В опыте по отработке оптимальных параметров по-
Таблица 2
Сравнительная чувствительность ДАС ТФ ИФА при различных методах детекции
Разведение ТФ ИФА ОП405, колориме- ИХА, RLU-1000
пробы трическии метод детекции
ГП БН ГП БН
10-2 0,554±0,02 0,678±0,07 797±0,01 16640±0,04
10-3 0,421±0,05 0,541±0,04 574±0,02 15760±0,07
10-4 0,401±0,01 0,403±0,02 538±0,05 14439±0,03
10-5 0,321±0,06 0,379±0,01 439±0,06 13398±0,04
10-6 0,327±0,04 0,307±0,04 351±0,1 12685±0,01
10-7 0,203±0,02 0,167±0,03 332±0,05 7326±0,04
10-8 0,158±0,04 0,150±0,05 101±0,2 5589±0,02
Контроль 0,146±0,03 0,152±0,05 95±0,09 3236±0,04
конъюгата
Таблица 3
Чувствительность и специфичность непрямого ТФ ИФА и ИХА при колориметрическом и хемилюминесцентном методах детекции для выявления антител к вирусу ГП и БН в сыворотках крови птиц
Сыворотка Метод детекции: ОП и Относительное со-
хемилюминесцентного держание антител,
свечения Sag/Nag ИФА-единицы EU
ТФ ИФА ИХА ТФ ИФА ИХА
ОП405 RLU-1000
Нормальная сыво- 0,152 6,0 0 0
ротка Ж
SS стандарт к ГП "Авивак" 0,691/0,18** 44,7/13,4 100 100
Сыворотка к ИББ 0,208 10,3 0 0
Сыворотка к ГП 0,49/0,2 42,1/9,8 69 65
Сыворотка штаммм Ла-Сота БН 0,6*/0,13 69,7*/11 90 91
Контроль конъюга- 0,16 9,5 0 0
та анти-IgG кур
П р и м е ч а н и е. * - реакция с антигеном вируса БН; р < 0,05; ** - в числителе ОП со специфическим антигеном, в знаменателе - с нормальным антигеном; Sag - специфический антиген; Nag - отрицательный антиген.
становки непрямого ТФ ИФА с колориметрической детекцией и ИХА для выявления специфических антител использовали гипериммунные сыворотки крови кур против ГП, БН, ИББ; компоненты коммерческого набора для выявления специфических антител к вирусу гриппа в сыворотке крови птиц НПП «Авивак». Сыворотки ис-
следовали в одном разведении 1:800, т. е. в 4 раза превышающем разведение отрицательной контрольной сыворотки (1:150-1:200), имеющей ОП405, равную фоновому уровню антивидового пероксидазного конъюгата (анти-
ДО кур).
Результаты сравнительного изучения чувствительности и специфичности непрямого ТФ ИФА и ИХА представлены в табл. 3. Они свидетельствуют о том, что используемые методы выявления антител чувствительны и специфичны. Результаты расчета относительного содержания в сыворотках крови антител в Еи ИФА практически совпадают.
В дальнейшем нами проведено сравнительное изучение чувствительности и специфичности различных форматов ИФА, разработанных для выявления специфических антител. С использованием методов ТФ ИФА (непрямой и конкурентный) были исследованы 334 пробы сывороток крови от домашней птицы, привитой против ГП подтипа Н5, и пробы сывороток крови от диких птиц, присланные для мониторинговых исследований в ФГБУ ЦНМВЛ. Для контроля специфичности антигена, адсорбированного на полистироле, использовали конъюгаты МКА 5С10 к нуклеопротеину вируса ГП и 3G4 к вирусу БН. На каждом планшете ставили контроль заведомо положительной и отрицательной сыворотки в 4 повторах, исследуемых сывороток в 2 повторах. Результаты представлены в табл. 4.
Результаты ИХА совпадали с результатами ТФ ИФА с колориметрической детекцией и РТГА. Исследования показали, что по чувствительности и специфичности раз-
Таблица 4
Чувствительность и специфичность различных методов выявления антител к вирусу ГП и БН в сыворотках крови животных
Сыворотка и МКА Значения ОП в РТГА, ГАЕ/см3 Относительное содержание АТ в ТФ ИФА/ ИХА, EU
непрямом ТФ ИФА конкурентном ТФ ИФА
антиген
ЭЭЖ ЭК (грипп A) Rek NP (грипп А)
нИХА, RLU-1000 нТФ ИФА, 0П405 нТФ ИФА, 0П405 (из набора "Авивак") нТФ ИФА, 0П405 ТФ ИФА, 0П405
SS к ГП, стандарт" 54,7 0,736 0,691 1,200 0,04 512 100
Конъюгат МКА 5С10## - 0,700 0,600 0,600 0,070 - -
Конъюгат анти-IgG кур # 9,5 0,160 0,100 0,100 - - -
SS ГП (гипериммунная) 49,1 0,642 0,490 1,500 0,070 512 84/87
Алтайский край** - пробы от дикой птицы (мониторинг UG типа А подтипа Н5)
S 1.28 44,6 0,684 0,514 0,934 0,080 2048 73/81
S 1.16 44,4 0,583 0,475 0,980 0,050 1024 73/73
S 1.19 42,3 0,452 0,382 0,600 0,100 512 68/51
Можайский район Московской области** - пробы от вакцинированной птицы против ГП типа А подтипа Н5Ш
S Н5-1 29,9 0,200 0,173 0,100 0,510 0 45/10
S Н5-30 26,8 0,138 0,182 0,300 0,570 0 37/10
S Н5-9 27,8 0,140 0,163 0,180 0,550 0 35/10
S Н5-8 28,8 0,162 0,13 0,190 0,512 0 37/20
S Н5-2.3 46,8 0,979 0,935 1,600 0,040 2048 82/95
S Н5-с. Бородино 69,7 0,712 0,597 1,800 0,040 1024-2048 120/94
S Н5-с. Иващино 55,8 0,674 0,583 1,300 0,060 1024-2048 100/88
S Н5-Троицк 48,3 0,592 0,504 1,000 0,070 512-1024 85/74
S Н5-с. Голеново 46,2 0,624 0,603 1,200 0,050 512-1024 81/80
Конъюгат МКА 3G4*, ## - 0,639 0,150 0,050 - - -
SS БН* (гипериммунная) 69,7 0,600 0,130 0,140 0,620 1024 -
SS свиней к Н5Ш*** 57,3 0,594 н/и 1,400 0,060 1024 100/80
SS ИББ 10,5 0,140 0,208 0,120 0,500 0 0
SS свиней к вирусу КЧС*** 25,2 0,230 0,09 0,130 0,583 0 30/10
П р и м е ч а н и е. * - в реакциях использовали антиген вируса БН; ** - показаны результаты исследования объединенных проб отрицательных сывороток и положительных в РТГА, имеющих титр в пределах 512-2048; *** - для выявления комплекса антиген - антитело использовали конъюгат протеина G; # - компоненты набора для выявления специфических антител к вирусу гриппа в сыворотке крови птиц НПП «Авивак»; ## - компоненты набора препаратов на основе МКА для дифференциальной диагностики ГП и БН методом ТИФА.
работанные методы ИФА не уступают коммерческому набору для выявления специфических антител к вирусу гриппа в сыворотке крови птиц НПП «Авивак». Применение рекомбинантного белка нуклеопротеина гриппа А в качестве специфического антигена в непрямом ТФ ИФА ведет к снижению фонового уровня, увеличению в 1,5-2 раза чувствительности и специфичности метода. Соотношение сигнал/фон выше в случае использования рекомбинантного белка нуклеопротеина гриппа А даже для самых низких значений ОП405: «Авивак» - 2,4-8,4; непрямой ТИФА - 2,1-6,9; непрямой ТИФА на основе рекомбинантного белка - 3,3-17.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что определение пероксидазной метки с помощью усиленной хемилюминесценции отличается высокой чувствительностью, специфичностью и может быть положено в основу разработки удобных и быстрых методов ИФА.
ИХА может быть рекомендован для диагностики инфекционных болезней как высокочувствительный и специфичный метод. Его явное преимущество заключается в простоте использования, полной автоматизации, использовании высококачественных стандартизованных реагентов. Этот метод отличается высокой чувствительностью (белки определяются в пикограммовых количествах), низким уровнем фоновой реакции с неспецифическим антигеном при детектируемом уровне реакции со специфическим антигеном, экономичностью: требуется минимальное количество МКА.
ЛИТЕРАТУРА (пп. 3-8, 10 см. REFERENCES)
1. Львов Д.К. Новые и возвращающиеся инфекции - дремлющий вулкан. Проблемы особо опасных инфекций. 2008; 2 (96): 5-8.
2. Силко Н.Ю., Глущенко Ю.Г., Шестопалова Л.В., Юрченко К.С. Биологические свойства велегенных штаммов вируса болезни
Ньюкасла, изолированных от птиц на Северном Кавказе. Вопросы вирусологии. 2013; 58 (1): 45-8.
9. Владимиров Ю.А. Активированная хемилюминисценция и биолю-минисценция как инструмент в медико-биологических исследованиях. Соросовский образовательный журнал. 2001; 7 (1): 16-23.
REFERENCES
1. L'vov D.K. New and emerging infections - a dormant volcano. Problemy osobo opasnykh infektsiy. 2008; 2 (96): 5-8. (in Russian)
2. Silko N.Yu., Glushchenko Yu.G., Shestopalova L.V., Yurchenko K.S. Biological properties velegenny strains of Newcastle disease virus isolated from birds in the Northern Caucasus. Voprosy virusologii. 2013; 58 (1): 45-8. (in Russian)
3. Umali D.V., Ito H., Suzuki T., Shirota K., Katoh H., Ito T. Molecular epidemiology of Newcastle disease virus isolates from vaccinated commercial poultry farms in non-epidemic areas of Japan. Virol. J. 2013, 10:330.
4. Aldous E.W., Mynn J.K., Banks J., Alexander D.J. A molecular epi-demiological study of avian paramyxovirus type 1 (Newcastle disease virus) isolates by phylogenetic analysis of a partial nucleotide sequence of the fusion protein gene. Avian Pathol. 2003; 32 (3): 239-56.
5. Fiore A.E., Shay D.K., Broder K., Iskander J.K., Uyeki T.M., Mootrey G. et al. Prevention and control of influenza: Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP), 2008. MMWR Recomm. Rep. 2008; 57 (RR-7): 1-60.
6. Naffakh N., Tomoiu A., Rameix-Welti M.A., van der Werf S. Host restriction of avian influenza viruses at the level of the ribonucleo-proteins. Annu. Rev. Microbiol. 2008; 62: 403-24.
7. Peiris J.S., Tu W.W., Yen H.L. A novel H1N1 virus causes the first pandemic of the 21st century. Eur. J. Immunol. 2009; 39: 2946-54.
8. O.I.E. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 6th ed. Paris; 2008.
9. VladimirovYu.A.ActivatedChemiluminescence andbioluminescence as a tool in biomedical research. Sorosovskiy obrazovatel'nyy zhurnal. 2001; 7 (1): 16-23. (in Russian)
10. Barnard G.J.R., Kim J.B., Williams J.L. Alternative Immunoassays. New York; 1985: 123-52.
Поступила 24.03.14
В ПОМОЩЬ ВИРУСОЛОГУ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015 УДК 617.7-002-022:578.825.11]-078
Слепова О.С.1, Светлова Е.В.1, КовалеваЛ.А.1, МакаровП.В.1, Кугушева А.Э.1, Денисова Е.В.1, Вахова Е.С.1, Захарова Г.Ю.1, Кондратьева Ю.А.1, Андрюшин А.Е.1, Демкин В.В.2
Исследования вируса герпеса человека 6-го типа и других герпес-вирусов, вызывающих заболевания глаз, методом полимеразной цепной реакции
'ФГБУ «МНИИ ГБ им. Гельмгольца» Минздрава России, 105062, г. Москва; 2Институт молекулярной генетики РАН, 123182, г. Москва
С целью изучения роли вируса герпеса человека 6-го типа (ВГЧ-6) в развитии заболеваний глаз проведено ПЦР-исследование крови (152), биоптатов роговицы (61) и внутриглазных жидкостей (11) на ВГЧ-6 и другие вирусы группы герпеса: вирус простого герпеса 1-го и 2-го типа, цитомегаловирус, вирус Эпштейна-Барр. Установлено, что ДНК ВГЧ-6 наряду с другими представителями семейства Herpesviridae может выявляться как в крови, так и непосредственно в тканях и жидкостях глаза у пациентов с различными клиническими формами офтальмопатологии (всего обследовано 174 человека). Полученные данные позволяют считать ВГЧ-6 одной из возможных причин офтальмогерпеса и делают поиск ДНК этого вируса неотъемлемым этапом на пути постановки этиологического диагноза офтальмологическим больным.
К л ю ч е в ы е с л о в а: вирус герпеса человека 6-го типа; заболевания глаз; роговица; кровь; полимеразная цепная реакция.
Для цитирования: Вопросы вирусологии. 2015; 60 (4): 45-48.
Для корреспонденции: Слепова Ольга Семеновна, д-р биол. наук, проф., рук. лаб. иммунологии и вирусологии; e-mail: slepowaolga@ yandex.ru
