Разработка и валидация методики определения флавоноидов в соцветиях лабазника вязолистного методом жидкостной хроматографии Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Д.В. Моисеев

РАЗРАБОТКА И ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЛАВОНОИДОВ В СОЦВЕТИЯХ ЛАБАЗНИКА ВЯЗОЛИСТНОГО МЕТОДОМ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Витебский государственный медицинский университет

Представлена простая и экспрессная методика идентификации и количественного определения флавоноидов в соцветиях лабазника вязолистного (FШpen-dula ulmaria L.) методом жидкостной хроматографии. Для экстракции используется 40% этанол. Определение флавоноидов проводится на обращено-фазовой колонке (Zorbax SB ^18 250x4,6мм, 5 мкм) в изократическомрежиме элюирования ПФ (0,01 M KH2PO4 pH=3,0 и ацетонитрил в соотношении 80:20 по объему), температура колонки 30°С.

Ключевые слова: лабазник вязолистный, FШpendula ulmaria L., ВЭЖХ, флаво-ноиды, спиреозид, кверцетин.

ВВЕДЕНИЕ

Одной из старейших традиций в медицине является использование лекарственных средств растительного происхождения. В течение тысячелетий сотни растений успешно применяются для лечения и профилактики заболеваний человека. С каждым годом в аптеках расширяется ассортимент лекарственных средств на основе растительного сырья. В последние годы значительно возрос интерес к лабазнику вязолистному (Filipendula ulmaria L. (лат.); Meadow sweet (англ.)) как источнику биологически активных веществ. В Российской Федерации трава лабазника вязолистного выпускается в качестве биологически активной добавки к пище. В Республике Беларусь фармакопейным видом сырья являются трава (стандартизируется по содержанию эфирных масел) и цветки (стандартизируются по сумме флавонои-дов) лабазника вязолистного [1].

На животных установлено антиокси-дантное [2, 3], кардиопротекторное [4], спазмолитическое [5] и ноотропное [3, 6, 7] действие лабазника. Химический состав лабазника вязолистного включает разнообразные группы веществ: фенольные кислоты, флавоноиды, салицилаты, эфирные масла, танины [2, 4-10]. Значительная часть фармакологических эффектов обусловлена высоким содержанием в лабазнике флавоноидных соединений, в частности гликозидами кверцетина и кемп-ферола. В траве и цветках лабазника обнаружены следующие флавоноиды: кверцетин, рутин, гиперозид, кверцетин-3-О-

арабинозид, изокверцитрин, кверцетин-4'-О-глюкозид, кверцетин-3-О-глюкуронид, кемпферол-4'-О-глюкозид [3, 7, 10], а также кверцетин-3'-О-глюкозид [5]. Некоторые авторы [2] утверждают об отсутствии в метанольном экстракте из надземной части лабазника вязолистного кверцети-на, рутина и присутствии мирицетина. Так что вопрос о качественном флавоноидном составе лабазника вязолистного является дискуссионным.

В процессе стандартизации цветков лабазника вязолистного (спектроскопические методы) [1,6] никак не учитывается количественное соотношение компонентов, а проводится только количественное определение суммы флавоноидов в пересчете на спиреозид (кверцетин-4'-О-глюкозид).

МА ТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследования выполняли на жидкостном хроматографе фирмы Agilent HP 1100, в комплекте с системой подачи и дегазации на четыре растворителя G1311A, диодно-матричным детектором G1315B, термостатом колонок G1316A, устройством для автоматического ввода образцов (автосэмплер) G1313A. Сбор данных, обработку хроматограмм и спектров поглощения проводили с помощью программы Agilent ChemStation for LC 3D. При выборе систем растворителей учитывали, что время проведения одного анализа растительного объекта не должно превышать одного часа и режим элюирования должен быть изо-кратическим (т.е. состав подвижной фазы

не должен изменяться в течение анализа). В предыдущей работе были оптимизированы условия хроматографического определения соединений флавоноидной природы [11]. Для разделения предложено использовать хроматографическую колонку Zorbax SB С-18 (размер частиц 5 мкм, длина 250 мм, диаметр 4,6 мм, производитель Agilent Technologies). Система растворителей: 0,01 М раствор дигидрофосфата калия (х.ч.), доведенный до значения рН=3,0 концентрированной ортофосфорной кислотой (х.ч.) и ацетонитрил (for liquid chromatography, «Merck») (исследовали разные объемные соотношения, оптимальное соотношение 80:20 по объему), температура колонки 30°С. Длина волны детекции соответствовала максимумам пиков, выбиралась после записи спектров поглощения при длинах волн 190-400 нм.

При проведении эксперимента использовали стандартные образцы спиреозида (кверцетин-4’-0-глюкозида, CAS [20229-5б-5], secondary HPLC (SH)=95,6%) и квер-цетина (CAS [117-39-5], SH=99,0%).

Для экстракции суммы фенольных соединений использовались водно-спиртовые смеси (в различных соотношениях), изучали влияние таких параметров, как продолжительность экстракции, соотношение сырья и экстрагента, а также температуры проведения экстракции. Коли-

чественное содержание суммы флавонои-дов (%) определяли как сумму площадей пиков флавоноидов на хроматограммах в пересчете на спиреозид.

РЕЗУЛЬ ТА ТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

На первом этапе исследований проводили идентификацию флавоноидов в цветках лабазника вязолистного, заготовленного в Республике Беларусь (окрестности г. Витебска). Идентификацию проводили по временам удерживания и сравнению спектров поглощения в ультрафиолетовой области веществ из соцветий лабазника со стандартными образцами, а также сопоставляли с литературными данными [11,12]. Удалось идентифицировать четыре флавоноида (рисунок 1). Максимумы поглощения для пиков веществ (тах±1 нм): изокверцитрин (204, 256, 354); гипе-розид (206, 256, 353); спиреозид (2О2, 253, 366); неидентифицированные флавоноиды

- 2 (202, 263, 347); 5 (196, 266, 362).

На втором этапе исследований подбирали оптимальные условия экстракции для количественного определения флавонои-дов в растительном сырье.

При выборе концентрации спирта для проведения экстракции проводили серию опытов с водно-спиртовыми смесями с шагом 10%. Государственная фармакопея

1 - изокверцитрин; 3 - гиперозид; 4 - спиреозид; 6 - кверцетин;

2 и 5 - неидентифицированные флавоноиды Рисунок 1- Хроматограмма водно-спиртового экстракта лабазника при длине волны

поглощения 370 нм

Республики Беларусь рекомендует проводить экстракцию флавоноидов 96% этиловым спиртом в течение 5 часов на кипящей водяной бане при соотношении сырье-экстрагент 1 : 50. В других литературных источниках в качестве экстрагента используется 70% этанол [3,6] или 60% метанол [10]. Выполненные исследования позволили установить, что оптимальная концентрация спирта находится в пределах 40-60%. Как видно из рисунка 2, при использовании 96% спирта по фармакопейной методике удается извлечь около 70% флавоноидов по сравнению с оптимальными концентрациями спирта. В дальнейшем все определения проводили с использованием 40% этанола.

В таблице 1 представлено изменение качественного соотношения флавоноидов

в экстрактах с различным содержанием этилового спирта.

При исследовании соотношения сырья и экстрагента (1 г сырья к 10 мл, 1 : 25, 1 : 50 и 1 : 100) оказалось, что наибольшая экстракция достигается при соотношении сырья и экстрагента 1 : 50 (100%), в остальных случаях экстракция составляла около 95%, 96% и 85% для соотношений 1 : 10, 1 : 25 и 1 : 100, соответственно.

Следующим шагом при разработке методики был выбор температурного режима экстракции. При температурах 20°С, 40°С, 60°С и 80°С происходит линейное увеличение количества экстрагируемых флавоноидов от 90 до 95%; максимальная экстракция наблюдалась при использовании кипящей водяной бани.

Влияние продолжительности экстрак-

Рисунок 2 - Зависимость полноты экстракции флавоноидов из соцветий лабазника

от концентрации этанола

Таблица 1 - Изменение качественного флавоноидного состава экстрактов при использовании водно-спиртовых смесей различных концентраций (п=3, Р=0,95)

Концентрация спирта Сумма флавоноидов в сырье, % Качественный состав флавоноидов в % от общего содержания

Изоквер- цитрин 2 гиперозид спиреозид 5 кверцетин

0% 10,5 10,6 1,49 2,25 63,8 8,27 13,6

10% 13,0 10,3 1,37 1,84 61,6 8,13 16,8

40% 18,6 7,05 1,32 1,66 68,2 8,33 13,5

70% 16,3 8,16 1,42 1,22 72,4 8,68 8,11

96% 13,2 7,36 1,24 0,71 73,6 8,10 9,01

ции из растительного сырья оценивали при температуре 90±10°С.

Как видно из таблицы 2, оптимальное время экстракции составляет 2 часа. Стоит отметить, что при использовании последовательной двукратной экстракции (по 1 часу) не происходило увеличение количественного содержания флавоноидов в объединенном экстракте по сравнению с однократной экстракцией. Кроме этого, при продолжительной экстракции (более

3 часов) в экстракте увеличивалось содержание кверцетина, что, возможно, связано с гидролизом его гликозидных производных.

Согласно Г осударственной фармакопее Республики Беларусь определение флавоноидов в соцветиях лабазника проводится спектрофотометрически по их

стандартные образцы спиреозида и квер-цетина.

Специфичность подтверждалась совпадением времен удерживания пиков спиреозида и кверцетина на хроматограммах раствора стандартного образца спиреозида и кверцетина и испытуемых образцов ЛРС и отсутствием пиков на хроматограмме используемого растворителя (40% этанол). Для оценки специфичности использовали такой параметр, как спектральная чистота пиков спиреозида и кверцетина в растительном сырье (более 99,9%), а также селективность (а>1,1) и коэффициент разрешения пиков спиреози-да ^>2,1), кверцетина ^>2,4) и других пиков на хроматограмме. Эффективность разделения по пику спиреозида составляла более 10 тысяч теоретических тарелок, для кверцетина - более 12 тысяч теоретических тарелок, коэффициенты асимметрии около 0,75 и 0,82, соответственно.

Линейность методики определяли пу-

сумме в пересчете на спиреозид после реакции с алюминия хлоридом. При этом стандартный образец не используется, а при расчетах используется поправочный коэффициент. По нашему мнению, при использовании метода жидкостной хроматографии для количественного определения флавоноидов можно использовать в качестве стандартных образцов как спи-реозид, так и более дешевый и доступный кверцетин, при этом проводить пересчет суммы флавоноидов на доминирующий в растительном сырье спиреозид. В случае использования кверцетина в качестве стандарта следует вводить коэффициент пересчета на спиреозид. Валидацию методики хроматографического определения проводили в соответствии с рекомендациями [1,13]. При валидации использовали

тем пятикратного построения градуировочного графика в диапазоне концентраций растворов спиреозида и кверцетина 10-2500 мкг/мл и 5,6-0500 мкг/мл, соответственно (рисунок 3).

Воспроизводимость (сходимость результатов анализа) проверяли путем многократного повторения методики определения на одном сырье (п=7, Р=0,95). Содержание суммы флавоноидов в пересчете на спиреозид составило 18,6±0,8%, в пересчете на кверцетин - 12,3±0,8.

Робастность проверяли путем изменения температуры колонки (30±5°С), значения рН буферного раствора (3,0±0,5). Значения суммы площадей пиков флаво-ноидов статистически различались незначительно (100±0,5% отн.).

Правильность методики проверяли методом стандартных добавок. Данные приведены в таблице 3.

Стабильность растворов спиреозида и кверцетина (РСО) проверяли при хране-

Таблица 2 - Изменение качественного состава флавоноидов при разной продолжительности экстракции

Продол- жительность экстракции, ч Сумма флавоноидов в сырье, % Качественный состав флавоноидов в % от общего содержания

изокверцитрин 2 гиперозид спиреозид 5 кверцетин

0,25 18,0 7,31 1,15 0,59 75,1 9,39 6,44

0,5 17,6 8,41 1,16 0,87 73,6 8,99 6,95

1 17,1 8,46 1,20 1,08 73,7 9,09 6,48

2 18,6 7,92 1,34 1,41 72,9 8,62 7,77

3 17,8 8,16 1,32 1,43 72,4 8,58 8,08

6 17,3 9,31 1,50 1,54 71,1 8,40 8,13

Рисунок 3 - Г радуировочный график зависимости аналитического сигнала (площадь

пика) от количества введенного вещества

Таблица 3 - Правильность методики определения (п=3, Р=0,95)

Содержание флавоноидов в экстракте растительного сырья (мкг/мл) Добавлено спиреозида (мкг/мл) Обнаружено суммы флавоноидов (мкг/мл) Обнаружено, % Воспроизводимость (RSD, %)

спиреозид 1270 500 1730 97,8 2,1

1270 1250 2490 98,9 1,3

1270 1875 3170 100,9 1,6

кверцетин 308,0 200 510 100,4 0,7

308,0 300 604 99,4 1,1

308,0 400 720 101,7 2,4

нии в течение 24 часов при температуре 20±5°С. Статистически значимых различий зафиксировано не было.

Стабильность полученных экстрактов оценивали при хранении в течение трех суток при комнатной температуре с периодическим переконтролем. Пробы оказались стабильны - уменьшение содержания индивидуальных веществ составило не более 15% для изокверцитрина и второго вещества, что можно объяснить их частичным гидролизом по гликозидной связи; для остальных не превышало 3%, суммарное содержание уменьшилось на 1,4%.

Таким образом, после проведения ва-лидационных процедур мы предлагаем методику:

В круглодонную колбу со шлифом помещают 0,5000 г измельченного (180 мкм) растительного сырья (точная навеска), прибавляют 25,0 мл 40% этанола, взвешивают на весах с точностью до 0,01 г и нагревают на кипящей водяной бане с обратным холодильником. Нагревание продолжают в течение 2 часов, периодически перемешивая, затем охлаждают и взвешивают на весах. При необходимости доводят по массе 40% этанолом и перемешивают. Содержимое фильтруют через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм и 10 мкл инжектируют в хроматограф.

Приготовление раствора рабочего стандартного образца (РСО). Навеску

0,0250 г спиреозида помещают в мерную

колбу объемом 25,0 мл и растворяют в 40% этаноле, доводят до метки 40% этанолом. Содержимое фильтруют через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм и 10 мкл инжектируют в хроматограф. Приготовленный раствор РСО годен в течение 24 часов.

Расчет количественного содержания суммы флавоноидов (%) проводят в пересчете на спиреозид как средний результат пяти измерений по формуле 1:

х = ^ х 82 х 10000 S2 х 81 х (100 - Ж)

где S1 - сумма площадей шести

пиков флавоноидов на хроматограмме испытуемого образца;

S2 - площадь пика спиреозида на хро-

ВЫВОДЫ

Разработана простая и экспрессная, по сравнению с Г осударственной фармакопеей Республики Беларусь, методика идентификации и количественного определения флавоноидов в соцветиях лабазника вязолистного. Общее время пробоподго-товки занимает не более двух часов (по Государственной фармакопее Республики Беларусь пять часов), при этом обеспечивается более полное извлечение действующих веществ из растительного сырья (примерно в 1,3-1,5 раза). Методика может использоваться для стандартизации соцветий лабазника вязолистного.

SUMMARY

D V. Moiseev DEVELOPMENT AND VALIDATION THE METHOD OF QUANTIFICATION

матограмме РСО;

g1 - навеска сырья, г;

g2 - масса спиреозида в растворе РСО, г;

^ - влажность сырья, %.

Также в качестве РСО можно использовать кверцетин. Раствор РСО кверцети-на готовится аналогично раствору РСО спиреозида, при расчетах используется поправочный коэффициент пересчета кверцетина на спиреозид, установленный экспериментально, и равный 1,51.

Апробация методики. Методика апробирована на пяти различных сериях соцветий лабазника. В качестве метода сравнения использовался фармакопейный метод анализа (спектрофотометрия). Результаты приведены в таблице 4.

OF FLAVONOIDS IN MEADOW SWEET FLOWERS BY LIQUID CHROMATOGRAPHY Simpleandfastprocedure for identification and assay of flavonoids in Meadow sweet flowers (Filipendula ulmaria L.) by HPLC is described. For the determination a 40% alcohol and RP column (Zorbax SB C-18 250^4,6 mm, 5 mcm); a mobile phase 0,01М potassium dihydrophosphate (рН=3,0) and acetonitrile in the ratio 80:20 (v/v) (isocratic elution); column temperature 30°С are used.

Keywords: Meadow sweet, Filipendula ulmaria L., HPLC, flavonoids, spiraeoside, quercetin.

ЛИТЕРАТУРА

1. Государственная фармакопея Республики Беларусь. Т.2. Контроль качества вспомогательных веществ и лекарственного растительного сырья / Центр экспертиз и

Таблица 4 - Результаты количественного определения флавоноидов в соцветиях

лабазника (n=3, P=0,95)

Производитель Содержание ( шавоноидов, %

Фармакопейный метод ЖХ (в пересчете на спиреозид)

Соцветия лабазника, заготовлены в Витебской области, Республика Беларусь, июль 2009 года 13,2±0,7 18,6±0,8

Соцветия лабазника, заготовлены в Витебской области, Республика Беларусь, июль 2010 года 10,3±0,5 14,5±0,6

Соцветия лабазника, заготовлены в Витебской области, Республика Беларусь, июль 2011 года 12,3±0,4 17,3±0,6

Соцветия лабазника, заготовлены в Минской области, Республика Беларусь, июль 2011 года 13,1±0,5 18,3±0,4

Соцветия лабазника, заготовлены в Псковской области, Российская Федерация, июль 2011 года 8,7±0,8 12,2±0,7

испытания в здравоохранений // Под общ. ред. А.А. Шерякова - Молодечно: «Победа». - 2008. - 472 с.

2. Natural antioxidant constituents from selected aromatic plants and their antimicrobial activity against selected pathogenic microorganisms / С. Proestos [et al.] // Food Technol. Biotechnol. - 2008. - 46(2). - P. 151-156.

3. Химический состав и биологическая активность фракции экстракта лабазника вя-золистного / И.В. Шилова [и др.] // Хим.-фарм. ж. - 2009. - Т.43, №4. - С. 7-11.

4. Исследование влияния дигидрокверце-тина и настоя цветков лабазника шестилепестного на функциональное состояние миокарда у крыс в условиях моделирования эмоционально-иммобилизационно-го процесса / Ю.А. Сухомлинов [и др.] // Вестник ВГУ. Серия: Химия. Биология. Фармация. - 2005. - №2. - C. 209-213.

5. Химический состав и первичная оценка фармакологических свойств препаратов из цветков Filipendula ulmaria (L.) maxim. / О.Д. Барнаулов [и др.] // Раст. ресурсы. -1977. - Т.13, №4. - С. 661-668.

6. Авдеева, Е.Ю. Исследование лабазника вязолистного как источника эффективного ноотропного средства: автореф. дис. ... канд. фармац. наук: 15.00.02 / Е.Ю. Авдеева; Перм. гос. фарм. акад. - Пермь. - 2008.

- 28 с.

7. Фенольные соединения Filipendulae ulmariae / Е.А. Краснов [и др.] // Химия прир. соед. - 2006. - №2. - С. 122-124.

8. Сайфуллина, Н.А. Состав эфирных масел из цветков Filipendula ulmaria (L.) maxim., F. denudata (Presl) Fritisch и F. stepposa Juz. / Н.А. Сайфуллина, И.С. Кожина // Растительные ресурсы. - 1975. - №

11. - С. 542-544.

9. Геніг, Г.Я. Фітохімічне дослідження гадючника в’язолистого і шестипелюсткового флори Львівської області / Г.Я. Геніг, ЛЯ. Ладна // Фармацевт. ж. - 1980. - №1.

- С. 50-52.

10. Pemp, E. Fast quantification of flavonoids in Filipendulae ulmariae flos by HPLC/ESIMS using a non porous stationary phase / E. Pemp, G. Reznicek, L. Krenn // Ж. анал. хим. - 2007. - Т.62, №7. - С. 745-749.

11. Моисеев, Д.В. Идентификация флаво-ноидов в растениях методом ВЭЖХ / Д.В. Моисеев, В.Л. Шелюто, Г.Н. Бузук // Хим.-фарм. ж. - 2011. -Т.45, №1. - С. 35-38.

12. Flavonoid content in fresh, home-processed, and light-exposed onions and dehydrated commercial onion products / Seung Un Lee [et all.] // J. Agric. Food Chem.

- 2008. - Vol. 56. - P. 8541-8548.

13. Эпштейн, H.A. Oценка пригодности (валидации) ВЭЖХ методик в фармацевтическом анализе (обзор) / H.A. Эпштейн // Хим.-фарм. ж. - 2004. - Т. 38, № 4. - С. 40-56.

Адрес для корреспонденции:

210023, Республика Беларусь, г. Витебск, пр. Фрунзе, 27,

Витебский государственный медицинский университет, кафедра стандартизации лекарственных средств с курсом ФПК и ПК, тел. раб. : 8 (0212) 37-00-06, моб. +375297102438.

Моисеев Д.В.

Поступила 01.11.2011 г.