CC BY
123
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ И ФАРМАКОГНОЗИЯ
УДК 615.015.32
РАЗРАБОТКА И ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИК КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММЫ ФЛАВОНОИДОВ В СБОРАХ № 1 и № 2 ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ОТМОРОЖЕНИЙ
АД. ШАЦКИХ1 ТЛ. КИСЕЛЕВА2
1} ГНУ Всероссийский научноисследовательский институт лекарственных и ароматических растений, г. Москва
ч НИЦ НО «Профессиональная ассоциация натуро терапевтов», г. Москва
e-mail: [email protected]
В статье представлены результаты разработки спектрофотометрической методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин в Сборах №1 и №2, используемых для профилактики и лечения отморожений. Проведена валидация методик по критериям: линейность, повторяемость, внугрилабораторная воспроизводимость и правильность. По результатам анализа серийных образцов предложены нормы содержания суммы флавоноидов в препаратах: в Сборе № 1 - не менее 2,596, в Сборе № 2 - не менее 2,296.
Ключевые слова: сборы, отморожения, количественное определение, флавоноиды, валидация методик.
В последние годы прослеживается четкая тенденция к увеличению числа пострадавших от холодовой травмы в регионах с умеренным климатом [9, 19]. Несмотря на то, что сегодня патогенез отморожений во многом изучен, клиническая ситуация, связанная с оказанием эффективной помощи пострадавшим, еще далека от совершенства [20].
Основой терапии отморожений в ранние сроки после травмы является введение антиспастических, сосудорасширяющих, антикоагулянтных и других препаратов синтетического происхождения, обладающих выраженными побочными видами действия, в том числе гормональных. Нами разработаны рецептуры двух растительных препаратов - (Сборов № 1 и № 2) для профилактики и лечения отморожений. Доклинические исследования [1-3] подтвердили наличие у них выраженного фригопротекторного эффекта. Составы сборов защищены патентами [17,18].
Важнейшим этапом создания новых препаратов, в том числе растительных, является разработка методов их стандартизации. В качестве одного из критериев оценки качества сборов нами предложено количественное содержание суммы флавоноидов, которые присутствуют во всех ингредиентах сборов, имеют широкий спектр фармакологической активности и во многом обусловливают суммарный терапевтический эффект сборов.
Целью настоящей работы являлась разработка и валидация методик количественного определения суммы флавоноидов в Сборах № 1 и № 2, рекомендуемых для профилактики и лечения отморожений.
В основу разработанных методик положен спектрофотометрический метод после реакции комплексообразования суммы флавоноидов со спиртовым раствором А1С13 [4, ю-12, 15]. В результате образования комплекса наблюдается батохромный сдвиг
ціщ
длинноволновой полосы поглощения флавоноидов до 390-410 нм [4, и, 15]. Эта область достаточно удалена от спектров поглощения других фенольных соединений, содержащихся в исходном сырье (фенолкарбоновые кислоты, дубильные вещества и др.), что практически исключает их влияние на результаты количественного определения флавоноидов [4, и].
Для подбора оптимальных условий извлечения суммы флавоноидов использовали по одному экспериментальному образцу каждого сбора (табл. 1-3: среднее из 5 определений, масса каждой навески 2,5 г, кипящая водяная баня с обратным холодильником).
Таким образом, оптимальными условиями выделения суммы флавоноидов из сборов № 1 и № 2 являются: измельченность сборов 1 и 3 мм соответственно; экстрагент - 40% спирт; соотношение сырья и экстрагента 1:20; двукратная экстракция (по 30 мин.) на кипящей водяной бане с обратным холодильником.
Затем были отработаны условия проведения фотометрической реакции ком-плексообразования суммы флавоноидов водно-спиртовых извлечений из сборов со спиртовым раствором А1С13: область максимального поглощения света комплексом, концентрация и количество спиртового раствора А1С13, необходимые для полного связывания суммы флавоноидов в комплексное соединение, зависимость светопоглоще-ния фотометрируемых соединений от времени [5].
Таблица 1
Влияние концентрации спирта на выход суммы флавоноидов из сборов (измельченность — 3 мм, продолжительность экстракции — 1 час)
Таблица 3
Влияние измельченности сборов на выход суммы флавоноидов при двукратной экстракции
Конц. спирта, 96 Выход суммы флавоноидов из сбора, 96 на абс. сухое сырье
Сбор №1 Сбор №2
40 1,70 2,26
50 1,06 2,07
70 1,34 1,92
Условия экстрагирования Выход суммы флавоноидов из сбора, 96, в пересчете на абс. сухое сырье
Конц. спирта, 96 Измельченность, мм
Сбор №1 Сбор №2
40 1 3,05 2,27
3 1,8о 2,66
5 1,73 1,96
Таблица 2
Влияние продолжительности однократной экстракции и кратности экстрагирования на выход суммы флавоноидов из сборов
Условия экстрагирования Выход суммы флавоноидов из сбора, в 96 на абс. сухое сырье
Кратность экстракции Время экстракции, мин Кол-во 4096 спирта, мл
Сбор № 1 Сбор №2
1-кратная 60 50,0 1,70 2,26
1-кратная 120 50,0 1,72 2.41
2-кратная 30 25,0
30 25,0 1,8о 2,66
Оптическую плотность предложено регистрировать при длине волны 410 нм, а расчет процентного содержания суммы флавоноидов в сборах проводить в пересчете на СО рутина, поскольку области максимального светопоглощения комплекса суммы флавоноидов извлечений из сборов и комплекса СО рутина со спиртовым раствором А1С13 совпадают (рис. 1).
Ьс *ГУ *
Б
0,20
350,00 370,00 390,00 410,00 430,00 450,00 470,00 490,00
^ ^
/
/
/ N
/ \
/
/ / N
А.
----Ряд1
Ряд2
Рис. 1. УФ-спектр продуктов реакции комплексообразования раствора СО рутина (ряд 1) и суммы флавоноидов водно-спиртового извлечения из сбора № 1 (ряд 2) с 3% спиртовым раствором А1С1з
На основании полученных данных для проведения фотометрической реакции в дальнейшем использовали з% спиртовой раствор А1С13
Как видно из данных табл. 5, при использовании 2 мл з% спиртового раствора А1С13 наблюдается наибольшее увеличение значений суммы флавоноидов в обоих сборах.
Для изучения зависимости светопоглощения от времени фотометрической реакции комплексообразования регистрировали оптическую плотность растворов через каждые 5 мин. Установлено, что в течение 30-35 мин. идет процесс образования комплексов, при этом оптическая плотность растет. При дальнейшем наблюдении какого-либо значительного роста оптической плотности не происходит, что соответствует на графиках почти горизонтальным участкам. Поэтому регистрацию оптической плотности предложено осуществлять через 40 мин. после добавления реактива.
Таблица 4 Влияние концентрации спиртового раствора А1С13 на полноту протекания реакции комплексообразования с суммой флавоноидов сборов (средние из 5 определений)
Таблица 5
Влияние количества 3% раствора А1С13 на полноту протекания реакции комплексообразования с суммой флавоноидов сборов
Концентрация раствора АЮ13, % Сумма флавоноидов в сборах, % в пересчете на абс. сухое сырье
Сбор № 1 Сбор № 2
1 2,57 2,08
2 2,58 2Д7
3 3,05 2,66
Кол-во;]% раствора А1С13, мл Сумма флавоноидов в сборах, в % на абс. сухое сырье
Сбор №1 Сбор №2
1 3,04 2,60
2 3,20 2,66
3 ЗД9 2,55
4 ЗД9 2,51
Методика количественного определения содержания суммы флавоноидов в сборах. Около 2,5 г (точная навеска) Сбора № 1 или Сбора № 2, измельченного до размера частиц 1 или 3 мм, соответственно, помещают в коническую колбу со шлифом вместимостью 200 мл, прибавляют мерной пипеткой 25 мл 40% спирта, присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 минут. Горячее извлечение перемешивают и фильтруют через фильтр «Красная лента», избегая попадания сырья на фильтр, в мерную колбу, вместимостью 50 мл. Экстракцию повторяют в тех же условиях. Горячее извлечение перемешивают и филь-
труют в ту же мерную колбу через тот же фильтр. Затем доводят объем раствора в мерной колбе до метки 40% спиртом, перемешивают (раствор А).
В мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 1 мл раствора А, прибавляют
2 мл 3 % спиртового раствора А1С13, доводят объем колбы 95% спиртом до метки, перемешивают и фильтруют через фильтр «Красная лента». В качестве раствора сравнения используют смесь 1 мл раствора А, помещенного в мерную колбу вместимостью 25 мл, 2-3 капель кислоты уксусной разведенной и доведенной 95% спиртом до метки. Оптическую плотность полученных растворов измеряют через 40 минут на спектрофотометре в кювете с толщиной слоя ю мм в области максимума при длине волны 410 нм. Параллельно, в указанных выше условиях, измеряют оптическую плотность 0,05% раствора СО рутина, приготовленного аналогично испытуемому раствору.
Содержание суммы флавоноидов (X), в процентах в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье, рассчитывают по формуле:
= Рхт0 х 1x50x25x100 у ^>
£>0 х 100 х 25 х »? х 1 х (100 - IV) где В - оптическая плотность испытуемого раствора; В 0 - оптическая плотность раствора СО рутина; т - масса навески сбора, г; т 0 - масса навески СО рутина, г; IV -потеря в массе при высушивании сбора, %.
Валидацию методик проводили по следующим критериям: линейность, повторяемость, внутрилабораторная воспроизводимость и правильность [6-8,13,14,16].
Определение линейности проводили на 5 уровнях концентраций рутина — 30%, 50%, 100%, 150%, 200%, от нормируемого значения. Значение оптической плотности (А) рассчитывалось как среднее из трех измерений.
Таблица 6
Результаты проверки линейности методик
№ измерения Содержание, % от нормируемого значения (около) Концентрация стандартного вещества (рутина), мкг/мл Аналитический отклик (оптическая плотность)
Сбор №1
1 30 3,6 0,1б1
2 50 6 0,243
3 100 12 0,577
4 150 18 0,763
5 200 24 0,993
Сбор №2
1 30 3,6 ОД57
2 50 6 0,233
3 100 12 0,545
4 150 18 0,759
5 200 24 0,982
Критерием приемлемости линейности являлся коэффициент корреляции, и если его величина близка единице, то совокупность данных можно описать прямой линией. Величина коэффициента корреляции должна быть не менее 0,995.
Коэффициент корреляции составил 0,9951 (для Сбора № 1) и 0,9973 (для Сбора № 2) (табл. 6, рис. 2, з).
Повторяемость методик определяли на одном образце каждого сбора в 6 повторностях в течение короткого промежутка времени с использованием одних и тех же реактивов и оборудования. Критерий приемлемости выражался величиной относительного стандартного отклонения, которое не должно превышать ю%. Он составил
1,28% (для Сбора № 1) и 1,42% (для Сбора № 2) (табл. 7), что свидетельствует о прецизионности методик в условиях повторяемости.
График зависимости оптической плотности от концентрации рутина
Концентрация рутина, мкг.'мл
Рис. 2. График зависимости оптической плотности спиртовых извлечений Сбора № 1 от концентрации рутина
График зависимости оптической плотности от концентрации рутина
Концентрация рутина, мкг'мл
Рис. 3. График зависимости оптической плотности спиртовых извлечений Сбора № 2 от концентрации рутина
2.0
1.5
0.5
00
100
400 500
УУа>е1епд1И (пт)
600
2.0
1.5
0.5
400 500
<пт>
600
Рис. 4. Спектры спиртовых извлечений из Сбора № 1
1 - спектр спиртового извлечения из Сбора № 1,
2 - спектр спиртового извлечения из Сбора № 1 с добавлением 2% спиртового раствора А1С13,
3 - спектр комплексов рутина А1С13 в спиртовых извлечениях Сбора № 1, 4 - спектр спиртового раствора СО рутина, 5 - спектр спиртового раствора СО рутина с добавлением А1С13. По оси абсцисс - длина волны, нм; по оси ординат -
оптическая плотность, ед.
Рис. 5. Спектры спиртовых извлечений из Сбора № 2
1 - спектр спиртового извлечения из Сбора № 2,
2 - спектр спиртового извлечения из Сбора № 2 с добавлением 2% спиртового раствора А1С13,
3 - спектр комплексов рутина с А1С13 в спиртовых извлечениях Сбора № 1, 4 - спектр спиртового раствора СО рутина, 5 - спектр спиртового раствора СО рутина с добавлением А1С13. По оси абсцисс - длина волны, нм; по оси ординат -
оптическая плотность, ед.
Определение внутрилабораторной воспроизводимости методик проводили два инженера-химика на з образцах в трех повторностях (табл. 8). Критерий приемлемости выражался величиной относительного стандартного отклонения, которое не должно было превышать 15%. Он составил 3,88% (для Сбора № 1) и 2,57% (для Сбора № 2), что указывает на прецизионности методик в условиях воспроизводимости.
Правильность методик устанавливали путем измерения количественного содержания суммы флавоноидов в пересчете на рутин в растворах, полученных путем добавления необходимого количества стандарта к исследуемому раствору для концентраций 125%, 151%, 177%; 202% (для Сбора № 1) и 125%, 147%, 175%> 200% (для Сбора № 2) (четыре уровня). Критерием приемлемости являлся средний % восстановления при использовании растворов концентраций 125%, 151%, 177%, 202% (для Сбора № 1) и 125 %, 147 %, 175 %, 200 % (для Сбора № 2), скорректированный на 100%, и его средняя величина должна находиться в пределах 100+5 %• Показано, что % восстановления находился для Сбора № 1 в пределах от 99,40% до 103,64%, и его средняя величина составила - 101,07%, а для Сбора № 2 в пределах от 97,52% до 102,37%, и его средняя величина составила - 100,31% (табл. 9).
Таблица 7
Результаты проверки повторяемости методик
Повторность Содержание суммы флаво-ноидов в пересчете на рутин, % Повторность Содержание суммы флаво-ноидов в пересчете на рутин, %
Сбор №1 Сбор №2
1 2,88 1 2,39
2 2,96 2 2,35
3 2,99 3 2,36
4 2,95 4 2,3
5 2,96 5 2,31
6 2,97 6 2,35
Среднее значение 2,95 2,34
Относительное стандартное отклонение (КЭБ), % 1,28 1,42
Результаты проверки воспроизводимости методик
Таблица 8
Повгорносп) Анадишк Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин, %
Образец 1 Образец 2 Образец 3
Сбор №1
1 1 2,88 3,оо 2,81
2 1 2,96 3,05 2,99
3 1 2,99 3,01 2,71
4 2 2,95 2,94 2,96
5 2 2,96 2,91 2,95
6 2 2,97 2,99 2,97
Среднее значение 2,95 2,98 2,90
Относительное стандартное отклонение (К81)), % 1,28 1,69 3,88
Сбор №2
1 1 2,39 2,29 2,33
2 1 2,35 2,40 2,39
3 1 2,36 2,33 2,36
4 2 2,30 2,51 2,39
5 2 2,31 2,6 2,45
6 2 2,35 2,34 2,50
Среднее значение 2,34 2,41 2,40
Относительное стандартное отклонение (К81)), 96 1,42 4,97 2,57
На основании полученных результатов данные методики можно считать прошедшими валидацию.
Таблица д
Результаты проверки правильности методик
№№ п/п Найдено, мг Добавлено СО рутина, мг Ожидаемое значение, мг Полученное значение, мг Выход 96
Сбор №1
1 1,4600 0,3750 1,8350 1,8240 99,40
2 1,4600 0,3750 1,8350 1,8655 101,66
3 1,4600 0,3750 1,8350 1,8761 102,24
4 1,4600 0,7500 2,2100 2,2330 101,04
5 1,4600 0,7500 2,2100 2,2345 101,11
6 1,4600 0,7500 2,2100 2,2905 103,64
7 1,4600 1,1250 2,5850 2,6050 100,77
8 1,4600 1,1250 2,5850 2,6045 100,75
9 1,4600 1,1250 2,5850 2,5990 100,54
10 1,4600 1,5000 2,9бОО 2,9650 100,17
її 1,4600 1,5000 2,9бОО 2,9780 100,61
12 1,4600 1,5000 2,9бОО 2,9855 100,86
Среднее значение выхода, 96:101,07
Сбор №2
1 1,1760 0,2940 1,4700 1,4582 99,20
2 1,1760 0,2940 1,4700 1,4790 100,61
3 1,1760 0,2940 1,4700 1,4864 101,12
4 1,1760 0,5880 1,7640 1,7755 100,65
5 1,1760 0,5880 1,7640 1,7562 99,56
6 1,1760 0,5880 1,7640 1,7588 99,71
7 1,1760 0,8820 2,0580 2,0933 101,72
8 1,1760 0,8820 2,0580 2,0433 99,29
9 1,1760 0,8820 2,0580 2,0656 100,37
10 1,1760 1,1760 2,3520 2,3898 101,61
її 1,1760 1,1760 2,3520 2,4078 102,37
12 1,1760 1,1760 2,3520 2,2936 97,52
Среднее значение выхода, 96:100,31
Анализ опытно-производственных серий сборов показал, что содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин колеблется для Сбора №1 от 2,82% до 3>21%, что позволяет предложить норму содержания БАВ не менее 2,5%, а для Сбора № 2 от 2,47% ДО 2,66%, что позволяет предложить норму содержания флавоноидов не менее 2,2% (табл. ю).
Таблица ю
Результаты определения содержания суммы флавоноидов в пересчете на рутин в сборах № 1 и № 2
Опытнопроизводственные серии сборов Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин, 96 Опытнопроизводственные серии сборов Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин, 96
Сбор № 1 Сбор № 2
0108 2,82 0108 2,53
0208 2,95 0208 2,58
0308 2,94 0308 2,47
0408 2,92 0408 2,62
0508 3,21 0508 2,66
0608 2,99 0608 2,59
Выводы:
1. Разработаны методики количественного спектрофотометрического определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин в Сборах №і и №2.
2. Установлены параметры правильности, повторяемости, внутрилаборатор-ной воспроизводимости и линейности разработанных методик. Предложены нормы содержания суммы флавоноидов в Сборе №і - не менее 2,5% и Сборе №2 - не менее 2,2%.
Литература
1. Алиева, А.А. Сравнительное изучение влияния дексаметазона и фитосборов на гематологические показатели крови крыс при острой Холодовой травме / АЛ. Алиева, М.Ю. Назаренко, Т.Л. Киселева, Н.А. Назаренко // I Российский фитотерапевтический съезд : сб. науч. трудов, г. Москва, 14-16 марта 2008 г. - М.: ФНКЭЦ ТМДЛ Росздрава, 2008. - С. 164-169.
2. Алиева, А.А. Сравнительное изучение влияния дексаметазона и лекарственного сбора на уровень мочевины крови крыс при Холодовой травме / А.А. Алиева, Н.А. Назаренко, ТЛ. Киселева, М.Ю. Назаренко // Экология человека. - 2007. - № 5. - С. 43-46.
3. Алиева, А.А. Изучение влияния фитосборов на рост клеточной культуры почек мыши / АЛ. Алиева, В.П. Пащенко, ТЛ. Киселева, НА. Назаренко // I Российский фитотерапевтический съезд : сб. науч. трудов, г. Москва, 14-16 марта 2008 г. - М. : ФНКЭЦ ТМДЛ Росздрава, 2008.- С. 162-164.
4. Беликов, В.В. Количественное определение основных действующих веществ у видов Hypericum L. / В.В. Беликов, Т.В. Точкова, Л.В. Шатунова, Н.Т. Колесник, И.И. Баяндина // Растительные ресурсы. - 1990. - Т. 26, вып. 4. - С. 571-578.
5. Булатов, М.И. Практическое руководство по фотоколориметрическим и спектрофотометрическим методам анализа / М.И. Булатов, И.П. Калинкин.- 2-е изд., перераб. и доп. -Л.: Химия, Ленингр. отд., 1968. - 384 с.
6. ГОСТ Р ИСО 5725-1-02 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Ч. 1. Основные положения и определения».
7. ГОСТ Р ИСО 5725-3-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Ч. 3. Промежуточные показатели прецизионности стандартного метода измерений». - М.: Госстандарт, 28 с.
8. Евдокимова, О.В. Разработка и валидация методики количественного определения суммы флавоноидов в траве пастушьей сумки / О.В. Евдокимова // Традиционная медицина. -2011. - № 1 (24). - С. 50-53-
д. Гостищев, В.К. Инфекции в хирургии. Рук-во для врачей / В.К. Гостищев. - М. : ГЭОТАР-Медиа, 2007. - 768с.
ю. Государственная фармакопея СССР: Вып. 2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье / М3 СССР. - ll-е изд., доп. - М.: Медицина, 1989. - 400 с.
11. Куркин, В.А. Определение флавоноидов в траве чистотела большого / В.А. Куркин, Е.С. Артамонова // Фармация. - 2007. - № 5. - С. 10-12.
12. Куркин, В.А.Вопросы стандартизации сырья и препаратов зверобоя / В.А. Куркин, О.Е. Правдивцева, Л.Н. Зимина // Фармация. - 2007. - № 4. - С. 12-14.
13. Основные принципы проведения валидации на фармацевтическом производстве // под ред. проф. В.В. Береговых. - М.: Русский врач, 2005. - С. 73-97.
14. ОФС 42-0113-09 Валидация аналитических методик.
15. Попов, Д.М. Контроль качества сырья и препаратов пустырника спектрофотометрическим методом / Д.М. Попов, Е.В. Пащинская, Л.И. Коваленко // Фармация. - 1992. - № 4. - С. 27-31.
16. Руководство по валидации методик анализа лекарственных средств / сост.: ВЛ. Ба-гирова, А.И. Гризодуб, Т.Х. Чибиляев и др.; под ред. Н.В. Юргеля и др. - М., 2007. - 48 с..
17. Средство из растительного сырья для профилактики и лечения отморожений / Н.А. Назаренко, ТЛ. Киселева, А.А. Алиева, М.Ю. Назаренко (РФ).- А. с. 2326684; заявл. 26.10.06.; опубл. 20.06.08.
18. Сбор лекарственных растений «Фитоморозко», обладающий фригопротекторным действием / Н.А. Назаренко, ТЛ. Киселева, А.А. Алиева, М.Ю. Назаренко, А.А. Карпеев (РФ).-А. с. 2336896; заявл. 30.11.06.; опубл. 27.10.08.
19. Day, M.W. Frostbite / M.W. Day // Nursing. - 2008. - Jan. - Vol. 38 (1). - P. 72.
20. Keskin, M. Frostbite injuri due to improper usage of an ice pack / M. Keskin, Z. Tosun, A. Duymaz et al. // Ann Plast Surg. - 2005. - Oct. -№ 55 (4). - P. 437-438.
DEVELOPMENT AND VALIDATION OF METHODS FOR QUANTITATIVE DETERMINATION OF THE SUM OF FLAVONOIDS IN HERDAL DRUG PREPARATIONS №1 AND №2 FOR THE PREVENTION AND TREATMENT OF FROSTDITE
AJI.SHATSKIKH1 The article presents the results of a quantitative spectrophoto-
T L KISELEVA2 metric method development for quantitative determination of the
" " flavonoid amount in terms of routine in the Herbal Drug Preparations
№l and №2, used for the prevention and treatment of frostbite. Held 11 GNU VILAR Rosselhosacademici, validation of techniques criteria: linearity, repeatability, intra-
Moscoiv laboratory reproducibility and accuracy. According to the results of
the analysis of serial samples standards for levels of flavonoids in s)SRC of NO «Professional Association preparations were proposed - №l- not less than 2,5, №2 - not less ofNaturotherapists», Moscow than 2,296.
e-mail: [email protected]
Key words: Herbal Drug Preparations, frostbite, quantification, flavonoids, validation of methods
