CC BY
0
© Коллектив авторов, 2024
Фадеева М.С., Созонова Т.А., Богданова Д.В., Алексенко М.Ю., Кулаковская Е.А., Ведмедская В.А., Лодоева О.Б., Родина Ю.А., Щербина А.Ю., Першин Д.Е.
Разработка и валидация метода оценки фосфорилирования белка STAT1 в качестве инструмента диагностики пациентов с дефектами соответствующего гена
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр детской гематологии, онкологии и иммунологии имени Дмитрия Рогачева» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 117997, г. Москва, Российская Федерация
Резюме
Введение. Активирующие аутосомно-доминантные мутации в гене STAT1 - STAT1-GOF (gain-of-function) лежат в основе комбинированного иммунодефицита, основными проявлениями которого являются хронический кожно-слизистый кандидоз и аутоиммунные расстройства. В основе патогенеза данного заболевания лежит усиление функции белка STAT1, связанное с гиперфосфорилированием и задержкой дефосфорилирования. Результатом данного патологического процесса является критичное снижение уровня ТЫ7-лимфоцитов вследствие нарушения цитокиновой регуляции их созревания. Кроме того, в гене STAT1 описаны аутосомно-доминантные и аутосомно-рецессивные варианты, приводящие к потере функции этого белка (loss-of-function, LOF). Высокопроизводительное секвенирование облегчает поиск новых вариантов гена, однако их биологическая значимость не всегда очевидна и требует подтверждения иммунологическими исследованиями.
Цель настоящей работы - разработка и валидация экспресс-метода оценки фосфорилирования белка STAT1.
Материал и методы. В исследование были включены 17 пациентов с подтвержденными патогенными вариантами в гене STAT1 (STAT1-GOF n = 16 и STAT1-LOF n = 1), 7 пациентов с вариантами неясного клинического значения в гене STAT1, а также когорта здоровых индивидуумов (n = 50). После выделения мононуклеарной фракции из периферической крови проводили стимуляцию клеток с последующей оценкой фосфорили-рования белка STAT1 методом проточной цитометрии.
Результаты. В результате сравнения когорты пациентов с патогенными вариантами STAT1-GOF с когортой здоровых индивидуумов были получены референсные значения фосфорилирования белка STAT1, относительно которых была выполнена оценка функции белка в когорте пациентов с вариантами неясного клинического значения.
Заключение. Методика показала высокую чувствительность и специфичность как в отношении STAT1 -GOF-дефектов, так и в случаях редких LOF-вариантов.
Ключевые слова: STAT1; GOF; LOF; врожденный дефект иммунитета (ВДИ); проточная цитометрия; кандидоз; Th17- лимфоциты
Статья получена 20.03.2024. Принята в печать 29.05.2024.
Для цитирования: Фадеева М.С., Созонова Т. А., Богданова Д.В., Алексенко М.Ю., Кулаковская Е.А., Ведмедская В.А., Лодоева О.Б., Родина Ю.А., Щербина А.Ю., Першин Д.Е. Разработка и валидация метода оценки фосфорилирования белка STAT1 в качестве инструмента диагностики пациентов с дефектами соответствующего гена. Иммунология. 2024; 45 (3): 329-342. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2024-45-3-329-342
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Вклад авторов. Все авторы внесли равный вклад в написание статьи.
Для корреспонденции
Фадеева Мария Сергеевна -врач КЛД лаборатории трансплантационной иммунологии и иммунотерапии гемобластозов ФГБУ «НМИЦ ДГОИ им. Д. Рогачева» Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: mfadeeva@icloud.com https://orcid.org/0000-0002-6553-2505
330
Методы
Fadeeva M.S., Sozonova T.A., Bogdanova D.V., Alexenko M.Yu., Kulakovskaya E.A., Vedmedskaya V.A., Lodoeva O.B., Rodina Yu.A., Shcherbina A. Yu., Pershin D.E.
Development and validation of a method for assessing STAT1 protein phosphorylation as a diagnostic tool for patients with defects in the conforming gene
Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology, Ministry of Health of the Russian Federation, 117997, Moscow, Russian Federation
Abstract
Introduction. Autosomal dominant STAT1-GOF (gain-of-function) pathogenic variants lead to combined immunodeficiency with CMC and autoimmune disorders. Heterozygous STAT1 -GOF-mutation caused an enhanced activation with delayed STAT1 dephosphorylation. STAT1 depending cytokines affect negative regulation of gene transcription in naïve T cells, resulting in maturation of CD4+ lymphocytes into Th1 phenotype rather than Th17 phenotype. Besides that there are autosomal-dominant and autosomal-recessive variants which lead to loss of a STAT1 protein function (loss-of-function, LOF). Next-generation sequencing (NGS) has facilitated detection of novel variants. However, the biological relevance of novel mutations is often not clear and must be confirmed by immunological analysis.
The aim of this study was to develop and validate a method for assessing STAT1 protein phosphorylation.
Material and methods. The study included 17 patients with STAT1 pathogenic variants (ST4T1-GOF n =16 and ST4T1-LOF n =1), 7 patients with the variants of uncertain significance in the gene STAT1 and a cohort of healthy donors (n = 50). After the mononuclear fraction isolation, the cells were stimulated and STAT1 phosphorylation was evaluated by flow cytometry.
Results. We obtained reference values by comparing a cohort of STAT1 -GOF patients with a healthy donors. The references were used to assess the variants of uncertain significance in the gene STAT1.
Conclusion. The method turned out to be sensitive and specific for detecting STAT1 -GOF and STAT1 -LOF genetic variants.
Keywords: STAT1; GOF; LOF; Inborn Errors of Immunity (IEI); flow cytometry; candidiasis; Th17-lymphocytes
Received 20.03.2024. Accepted 29.05.2024.
For citation: Fadeeva M.S., Sozonova T.A., Bogdanova D.V., Alexenko M.Yu., Kulakovskaya E.A., Vedmedskaya V. A., Lodoeva O.B., Rodina Yu.A., Shcherbina A.Yu., Pershin D.E. Development and validation of a method for assessing STAT1 protein phosphorylation as a diagnostic tool for patients with defects in the conforming gene. Immunologiya. 2024; 45 (3): 329-42. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2024-45-3-329-342 (in Russian)
Funding. The study had no sponsor support.
Conflict of interests. Authors declare no conflict of interests.
For correspondence
Mariia S. Fadeeva -Clinical Laboratory Diagnostics Physician of the Hematopoietic Stem Cell Transplantation and Immunotherapy Laboratory, D. Rogachev NRC PHOI of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: mfadeeva@icloud.com https://orcid.org/0000-0002-6553-2505
Authors' contribution. Authors contributed equally to the writing of the article.
Введение
В последние годы увеличилось количество вновь открытых врожденных дефектов иммунитета (ВДИ), для многих из них единственной излечивающей опцией является трансплантация гемопоэтических стволовых клеток [1, 2]. Появилось много публикаций, рассматривающих генетический дефект с точки зрения функции белка, в этой связи принято выделять два принципиально разных типа мутаций: gain-of-function (GOF), усиливающую функцию белка, и loss-of-function (LOF), приводящую к полной или частичной потере функции [3-7].
В 2011 г. группы авторов показали, что в основе ВДИ с хроническим кандидозом лежат активирующие ауто-сомно-доминантные (АД) мутации в гене БТЛТ1 [3, 8]. Данные мутации приводили к усилению функции белка 8ТАТ1 в результате задержки дефосфорилирования и гиперактивацией сигнальной системы 1ак-8ТАТ [9] (рис. 1).
Активирующие дефекты в гене БТЛТ1, будучи причиной нарушения баланса 8ТАТ-опосредованного сиг-налинга, вызывают дисрегуляцию иммунной системы, что приводит к развитию иммунодефицита с широким спектром клинических проявлений [10]. Согласно
исследованию J. Toubiana и соавт. [11], у пациентов со STAT1-GOF помимо кандидоза, который присутствовал у 98 % пациентов, наблюдались также бактериальные инфекции - 74 %, вирусные инфекции - 38 %, аутоиммунные проявления - 37 % (тиреоидит, поражение кожи, аутоиммунный гепатит, аутоиммунная цитопения, диабет 1-го типа), аневризмы - 6 %, опухоли - 6 %, проявления атопии (астма, экзема) зафиксированы в 20 % случаев. Однако ведущим симптомом является хронический, устойчивый к терапии, регулярно рецидивирующий кандидоз, который проявляется регулярно повторяющимся неинвазивным поражением кожи, ногтевых пластин и слизистых оболочек [10-13]. Гиперфункция белка STAT1 приводит к снижению уровня ТЫ7-лим-фоцитов, которые играют ведущую роль в обеспечении противогрибковой защиты кожи и слизистых оболочек [14-16]. Широкое применение молекулярно-генети-ческих методов в клинической практике показало, что мутация STAT1-GOF является причиной примерно половины случаев хронического кандидоза [11].
Особенностью вариантов в гене STAT1 является разнообразие клинических проявлений в зависимости от типа мутации. Помимо дефекта STAT1-GOF, описаны еще три варианта клинического проявления мутаций в данном гене, приводящие к полной, либо частичной потере функции белка, т. е. относящиеся к LOF-мутациям: полная недостаточность STAT1, наследуемая по аутосомно-рецессивному типу, а также частичная недостаточность STAT1, наследуемая как аутосомно-рецессивно, так и аутосомно-доминантно [7].
Пациенты с вариантами STAT1 -LOF имеют целый ряд жизнеугрожающих инфекционных проявлений. Наиболее частым из них является предрасположенность к развитию типичных и атипичных микобактериальных инфекций. Число описанных на сегодня вариантов STAT1 -LOF невелико. В отличие от них, активирующие мутации более распространены: в настоящее время выявлено более 150 вариантов в гене STAT1, подавляющее большинство которых относится к GOF-типу [3, 7].
Вклад в патогенез заболевания вновь выявленных вариантов последовательности гена STAT1 не всегда очевиден. В таких случаях дефект является вариантом неопределенной клинической значимости (VUS -a variant of uncertain significance). Определить истинно патогенный вариант помогают методы функциональной оценки, в проведении которых используют спектр различных подходов. Одним из наиболее доступных и относительно простых методов является оценка фос-форилированной формы STAT1 с помощью проточной цитометрии [9, 13, 17]. Немаловажным преимуществом этого метода является скорость его проведения, позволяющая в предельно короткие сроки обнаружить нарушенную функцию белка STAT1 и скоординировать дальнейший поиск молекулярно-генетического дефекта.
В данной статье описана разработка метода оценки фосфорилирования белка STAT1 с помощью проточной цитометрии, который можно использовать в качестве экспресс-диагностики функциональной активности белка.
Рис. 1. Путь активации белка STAT1
На рисунке изображен ИФН-у-зависимый путь активации белка STAT1: после получения активационного сигнала происходит ауто- и трансфосфорилирование янус-киназ - Janus Aktivating Kinases (JAK1/JAK2) (1), в результате чего аминокислота тирозин (Y701) C-концевого домена TAD подвергается фосфорилированию и белок STAT1 формирует гомодимер GAF (IFN Gamma Activating Factor) (2), который проникает в ядро клетки и связывается со специфическим сайтом связывания (IFN Gamma Activated Site - GAS) (3), что вызывает экспрессию интерферон-зависимых генов (4) - на схеме отмечено синей стрелкой [2, 5, 31, 32]; затем белок подвергается дефосфорилированию и его мономеры экспортируются обратно в цитоплазму клетки (5).
Материал и методы
Участники исследования и его дизайн. На предварительном этапе участниками исследования или их законными представителями были подписаны формы информированного согласия. Исследование проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» (WMA Declaration of Helsinki -Ethical Principles for Medical Research Involving Human Subjects, 2013) и было одобрено этическим комитетом НМИЦ «ДГОИ им. Д. Рогачева» Минздрава России.
Рис. 2. Дизайн исследования
На схеме представлены вошедшие в исследование образцы крови: на первом этапе была проведена оценка фосфорилиро-вания в группе сравнения, на следующем этапе были проанализированы образцы крови пациентов с патогенным вариантом в гене STAT1 и сформированы референсные значения, затем метод был применен для анализа фосфорилирования в группе пациентов с вариантом неясного клинического значения.
В исследование вошли образцы периферической крови от условно здоровых индивидуумов (группа сравнения, п = 50)), использованные с целью формирования надлежащих референсных интервалов уровней фосфо-рилирования (рис. 2).
В исследование были включены 17 образцов крови пациентов с ранее описанными патогенными вари-
антами в гене STAT1 - 16 STAT1-GOF (P1-P16) и один STAT1 -LOF (P17), наблюдавшихся в НМИЦ «ДГОИ им. Д. Рогачева» Минздрава России с сентября 2021 по февраль 2023 г. (табл. 1, см. рис. 2). Из них 15 пациентов были в возрасте до 18 лет (М - 10, 1; 17), трое - старше 18 лет.
После формирования референсных интервалов была проведена оценка фосфорилирования STAT1 в образцах пациентов (n = 7), у которых были выявлены генетические варианты в гене STAT1 неопределенной клинической значимости (P18-P24) (табл. 2, см. рис. 2).
Оценка кинетики фосфорилирования белка STAT1. Образцы венозной крови здоровых индивидуумов и пациентов были забраны в пробирки с антикоагулянтом литий-гепарин, после подписания участниками исследования или их законными представителями информированного согласия. Образцы были проанализированы в течение 24 ч после венепункции. На начальном этапе пробоподготовки производилось выделение фракции мононуклеарных клеток периферической крови методом центрифугирования в градиенте плотности (Lymphocyte Separation Media, Capricorn Scientific, Германия). Для индукции фосфорилирования выделенная фракция подвергалась инкубации с раствором ИФН-у в конечной концентрации 1 нг/мл, после чего производилась фиксация и пермеабилизация растворами Cell Signaling Buffer Set A kit (Miltenyi Biotec, Германия) и окраска моноклональными антителами CD45 PerCP (Clone 2D1, Becton Dickinson, США), CD14
Таблица 1. Патогенные варианты в гене STAT1
Пациент Возраст, годы на момент исследования Генетический вариант в гене STAT1 Экзон Домен белка Тип варианта Индекс фософорили-рования белка STAT1 Качественная оценка
15 мин 60 мин 120 мин
P1 8 c.69T>G p.Asp23Glu 3 N-концевой GOF 176 155 86 Повышено
P2A 17 c.499C>G, p.Gln176Glu 7 Суперспираль GOF 161 204 99 Повышено
P3A 44 c.499C>G, p.Gln176Glu 7 Суперспираль GOF 271 228 155 Повышено
P4 3 c.629G>A, p.Arg210Lys 8 Суперспираль GOF 135 223 175 Повышено
P5B 10 c.800C>T, p.Ala267Val 10 Суперспираль GOF 203 257 122 Повышено
P6B 48 c.800C>T, p.Ala267Val 10 Суперспираль GOF 319 262 180 Повышено
P7 10 c.820C>T, p.Arg274Trp 10 Суперспираль GOF 160 166 99 Повышен
P8C 1 c.862A>C, p.Thr288Pro 10 Суперспираль GOF 209 174 96 Повышено
P9C 23 c.862A>C, p.Thr288Pro 10 Суперспираль GOF 200 150 108 Повышено
P10 3 c.863C>T, p.Thr288Ile 10 Суперспираль GOF 251 389 167 Повышено
P11 8 c.863C>T, p.Thr288Ile 10 Суперспираль GOF 198 232 127 Повышено
P12 13 c.878C>T, p.Pro293Leu 10 Суперспираль GOF 219 229 156 Повышено
P13 5 c.1154C>T p.Thr385Met 14 ДНК-связывающий GOF 213 350 232 Повышено
P14 11 c.1189A>G, p.Asn397Asp 14 ДНК-связывающий GOF 219 209 134 Повышено
P15 9 c.1154C>T, p.Thr385Met 14 ДНК-связывающий GOF 302 267 185 Повышено
P16 15 c.1154C>T; p.Thr385Met 14 ДНК-связывающий GOF 36 86 76 Норма
P17 1 c.541+1G>A 7* Суперспираль LOF 0,2 0,2 0,2 Отсутствует
Примечание. Характеристиики пациентов, вошедших в исследование, с указанием возраста, генетического варианта и его локализации в гене STAT1; A, B, C - обозначение родства пациентов (мать и ребенок); отмечены также мутации GOF (Gain-of-Function - активирующая мутация) и LOF (Loss-of-Function - вариант, приводящий к потере функции белка). Фосфорилирование белка STAT1 - индекс фосфорилирования (разность MFI стимулированного и нестимулированного образца, разделенная на 100) после стимуляции 15, 60 и 120 мин: норма (относительно группы сравнения), повышение, отсутствие.
Таблица 2. Варианты неопределенной клинической значимости в гене БТЛТ1
Пациент Возраст, годы на момент исследования Генетический вариант в гене STAT1 Экзон Домен белка Тип варианта Индекс фософорили-рования белка STAT1 Качественная оценка
15 мин 60 мин 120 мин
Р18 17 c.199C>A p.Gln67Lys 4 N-концевой VUS 88 186 127 Повышено
Р19 17 c.508T>G, p.Tyr170Asp 7 Суперспираль VUS 171 378 285 Повышено
Р20 17 c.508T>C, p.Tyr170His 7 Суперспираль VUS 215 210 120 Повышено
Р21 12 c.860A>C p.Tyr287Ser 10 Суперспираль VUS 402 441 318 Повышено
Р22 2 c.603G>A p.Lys201= 8 Суперспираль VUS 0,2 0,2 0,2 Отсутствует
Р23 7 с.1069 A>G p.Asn357Asp 14 ДНК-связывающий VUS 71 117 83 Норма
Р24 12 c.1722T>A, p.Asn574Lys 20 Линкер VUS 264 203 139 Повышено
Примечание. Характеристики пациентов, вошедших в исследование с указанием возраста, генетического варианта и его локализации в гене STAT1 - VUS (a variant of uncertain significance - вариантом неопределенной клинической значимости). Фосфорили-рование белка STAT1 - индекс фосфорилирования (разность MFI стимулированного и нестимулированного образца, разделенная на 100) после стимуляции 15, 60 и 120 мин: норма (относительно группы сравнения), повышение, отсутствие.
BV450 (Clone МфР9, Becton Dickinson, США), STAT1 (pY701) Alexa Fluor 647 (Clone 4a, Becton Dickinson, США).
Изначально нами была произведена характеристика динамики фосфорилирования STAT1 в контрольных образцах во временных точках 0, 5, 15, 20, 60, 120 мин активации. Для дальнейшей оценки фосфорилирования и дефосфорилирования нами были выбраны три временных точки: 15, 60 и 120 мин от начала активации, как оптимальные для оценки кинетики (рис. 3).
Анализ образцов проводился на проточном цито-метре CytoFLEX (Beckman Coulter, США). При анализе данных использовалось программное обеспечение CytExpert (Beckman Coulter, США), согласно стратегии гейтирования, указанной на рис. 4.
Исследование фосфорилирования белка STAT1 было произведено в CD14+-клетках. Оценка производилась на основании полученных значений интенсивности флуоресценции (MFI) по каналу, соответствующему флуоресценции анти-STAT1-антитела. Из полученных значений формировался индекс фос-форилирования для каждой временной точки согласно следующей формуле:
Index pSTAT = -
MFI R
образца после инкубации с ИФНу
MFI
нестимулированного образца
100
Индекс оценивался относительно разработанных референсных интервалов в группе сравнения. Превышение этих значений расценивалось как усиление фос-форилирования.
Молекулярно-генетический анализ. Молеку-лярно-генетическое исследование проводили методом высокопроизводительного секвенирования (NGS) на платформе NextSeq (Illumina, США) с использованием кастомной таргетной панели «Иммунологическая», включающей 514 генов, ассоциированных с различными иммунодефицитами (см. Приложение).
Подготовку ДНК-библиотек осуществляли методом селективного гибридизационного обогащения с применением кастомной панели зондов производства Roche (Швейцария), согласно протоколу производителя. Секвенирование проводили на платформе NextSeq (Illumina, США) методом парно-концевого чтения (126^2). Обработку данных секвенирования проводили с использованием собственного автоматизированного алгоритма, включающего выравнивание прочтений на референсную последовательность генома человека (hg38). Для оценки популяционных частот найденных генетических вариантов использовали базу gnomAD [18]. Для оценки патогенности миссенс-вариантов применяли компьютерные программы-предсказатели CADD (Combined Annotation-Dependent Depletion) (США) [19], PolyPhen (Polymorphism Phenotyping) (США) [20], SIFT (Sorting Intolerant From Tolerant) (США) [21] и PROVEAN [22] (США). Оценку потенциального влияния вариантов на сплайсинг прово-
15 000-,
10 000 -
5000-
Без 5
стимуляции
15 20 Мин
60
120
Рис. 3. Выбор оптимальных точек
На рисунке представлена кинетика фосфорилирования белка STAT1 с указанием флуоресценции MFI (mean fluorescence intensity): от нестимулированного образца (без стимуляции) до точки 120 мин. Стрелками отмечены точки, выбранные для исследования.
0
334
Методы
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 STATl
д 4
А NON ^STIM / \ MFI 1383
15' /Л MFI 10220
60' MFI 8897
120' Л MFI 6172
1111 11 I 1111 1111 II I I I I I I I I 11 I I I I I I 111
III II III 11 IT
STAT1
STATl Alexa Fluor 647
Рис. 4. Анализ фосфорилирования белка STAT1 На рисунке изображена стратегия гейтирования при анализе фосфорилирования белка STAT1: 1 — на основании параметров прямого (Forward .scatter — FSC) и бокового (Side Scatter — SSC) светорассеяния выделяется регион мононуклеаров — MNC; 2 — среди всех мононуклеаров выделяется регион моноцитов — MON на основании положительной экспрессии маркеров CD45 и CD14; 3 — в регионе MON производится определение MFI (mean fluorescence intensity) по каналу детекции STAT1; 4 — для определения динамики фосфорилирования и последующего дефосфорилирования производится сравнительный анализ интенсивности флуоресценции между образцами, стимулированными в течение разных временных интервалов (15, 60 и 120 мин) с нестимулированным образцом.
3
дили с использованием программы SpliceAI (Illumina, США) [23]. Клиническую значимость выявленных генетических вариантов определяли на основании рекомендаций American College of Medical Genetics and Genomics [24] и российского руководства по интерпретации данных NGS [25]. Верификацию найденных вариантов и анализ сегрегации в семье проводили с помощью секвенирования по Сенгеру с использованием набора реагентов BigDye Terminator v3.1 и капиллярного секвенатора Genetic Analyzer 3500XL (Applied Biosystems, США).
Статистическая обработка данных. В исследовании при описании групп был рассчитан перцен-тильный коридор 3-97 и определены медианные значения с разбросом для временных интервалов 15, 60 и 120 мин. Выполнено сравнение данных по фос-форилированию в когорте здоровых индивидуумов с когортой пациентов с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Далее был произведен ROC-анализ для определения оптимального порогового значения Index pSTATl соответствующего максимальной чувствительности и специфичности. Обработка данных проводилась при помощи ПО PRISM 10 (GraphPad Software, США).
Результаты
Исследования фосфорилирования белка STAT1 у здоровых индивидуумов
Для формирования представления о долженствующем паттерне кинетики фосфорилирования было
решено оценивать Index pSTATl после инкубации с ИФН-у в трех временных точках (15, 60 и 120 мин). Данный подход позволяет проследить не только точку максимального фосфорилирования, но и динамику дефосфорилирования.
Рассчитан референсный интервал Index pSTATl в группе сравнения, который составил: для 15 мин 85 (33-163); для 60 мин 71 (31-124); для 120 мин 51 (2479) (рис. 5).
Пик фосфорилирования белка STAT1 (максимально высокие значения Index pSTAT1) в группе сравнения в 78 % образцов наблюдался на 15-й минуте стимуляции, в 22 % пик приходился на 60-ю минуту, далее следовало проградиентное снижение индекса с минимальным его значением на 120-й минуте.
Исследование фосфорилирования белка STAT1 у пациентов, имеющих активирующую мутацию в гене STAT1 (GOF)
Была произведена оценка индекса фосфорилирования у 16 пациентов с активирующей мутацией (GOF), у 15 из 16 обследованных пациентов выявлено усиленное фосфорилирование белка STAT1 с задержкой дефосфорилирования во всех точках в сравнении с когортой здоровых индивидуумов (p < 0,001). Данные Index pSTAT1 в группе пациентов: для 15 мин медиана 206 (36-402); для 60 мин медиана 226 (86-441); для 120 мин медиана 131 (76-318) (см. рис. 5). У 9 из 16 пациентов с патогенными мутациями максимально высокий индекс фосфорилиро-вания наблюдался на 60-й минуте.
400 -,
300
и ? 200
100
Группа сравнения
STAT1-GOF
STAT1-VUS
15
60 Мин
120
Время, мин 15 60 120
Группа сравнения 85 71 51
STAT1-GOF 206 226 131
STAT1-VUS 193 206 133
Рис. 5. Динамика фосфорилирования белка БТАЛ в трех когортах
На графике и в таблице представлены медианы фосфорилирования белка БТЛТ1 с указанием интерквартильного размаха в трех когортах: пациенты с мутацией БТЛТ1-ООЕ (отмечены оранжевым цветом), пациенты с мутацией БТЛТ1-¥иБ (отмечены розовым цветом) и группа сравнения (отмечена голубым цветом).
0
В образце от пациента P16 с генетическим вариантом с.1154 C>T индексы фосфорилирования находились в пределах референсных значений: 36, 86 и 76 соответственно, однако пик фосфорилирования приходился на 60-ю минуту.
Получение оптимизированного порогового диагностического значения Index pSTAT1
По результатам ROC анализа группы сравнения (n = 50) и пациентов с патогенной мутацией в гене STAT1 (n = 16) были установлены оптимизированные пороговые значения Index pSTAT1 для каждой временной точки с максимальными показателями чувствительности и специфичности, которые составили 135 для 15 мин (94%/92%), 125 для 60 мин (94%/98%) и 80 для 120 мин (96%/98%).
Исследование фосфорилирования белка STAT1 у пациента, имеющего LOF вариант в гене STAT1
У пациента с характерной для LOF-вариантов клинической картиной и описанным ранее патогенным вариантом ST4T1-LOF обнаружено отсутствие фосфорилирования белка STAT1, индекс составил 0,2 (рис. 6).
Исследование фосфорилирования белка STAT1 у пациентов, имеющих вариант неясного клинического значения в гене STAT1
Метод был применен для оценки индекса фосфорилирования в группе пациентов, имеющих проявления, характерные для ВДИ со STAT1-GOF (n = 6) и ВДИ со STAT1 -LOF (n = 1), и генетические варианты неясного
клинического значения. У 5 пациентов (83 %) обнаружены отклонения индекса в виде превышения полученных в результате ROC-анализа значений во всех временных точках (p < 0,001) (см. рис. 5).
В образце крови пациента P17 с вариантом с.1069 A>G и соответствующей клинической картиной были выявлены нормальные значения индекса - 71, 117 и 70, в кинетике фосфорилирования максимум наблюдался на 60-й минуте.
В образце крови пациента с подозрением на STAT1-LOF (P22) получены крайне низкие значения Index pSTAT1 во всех точках. Критично низкое значение индекса позволяет сделать косвенный вывод об отсутствии нормально функционирующего белка STAT1 в образце крови данного пациента и подтверждает LOF-статус данного варианта.
Обсуждение
Комбинированный ВДИ со STATl-GOF-дефектом -это нередко встречающееся в клинической практике иммунолога заболевание. Согласно литературным данным, > 50 % случаев тяжелого хронически рецидивирующего грибкового поражения кожи и слизистых приходится на врожденный дефект гена STAT1, приводящий к усилению функции белка STAT1 [11]. Гиперфосфорилирование и чрезмерная патологическая активация сигнальной системы Jak-STAT вызывает нарушение иммунного ответа, которое проявляется чрезвычайно вариабельной клинической картиной [6,
STAT1
P15 STAT1 c1154C>T
P22 STAT1 c603G>A P17 STAT1 c541G>A
STAT1 Alexa fluor 647
Рис. 6. Характер фосфорилирования белка STAT1 при различных дефектах
На рисунке показано отсутствие фосфорилирования у двух пациентов с мутациями в гене STAT1 LOF (P17) и STAT1 VUS (P22), приводящими к потере функции белка (гистограммы красного цвета), по отношению к контрольному образцу из группы сравнения (гистограмма серого цвета) и образцом от пациента с активирующей мутацией (P15, гистограмма синего цвета).
10-13]. Возможно как тяжелое течение, требующее ранней госпитализации в специализированные стационары, так и более легкие варианты клинических проявлений, которые оставляют данных пациентов вне поля зрения специалистов иммунологического профиля.
В связи с этим существует определенный риск гипо-диагностики пациентов с легким течением заболевания, так как в большинстве случаев генетическое обследование им не проводится. В описанной выше когорте пациентов с обнаруженными патогенными генетическими вариантами присутствуют трое взрослых пациентов с клиническими проявлениями STAT1-GOF-дефекта, однако диагностировать соответствующий ВДИ удалось лишь при обследовании их детей.
Таким образом, вариабельность тяжести клинической картины и отсутствие настороженности в отношении ВДИ у смежных специалистов делают экспресс-диагностику особенно актуальной. Нами была поставлена цель: разработать и валидировать лабораторный метод, позволяющий быстро и эффективно выявлять пациентов с патологическими мутациями в гене STAT1 на основании определения нарушенной функции белка STAT1 (усиление/потеря функции), что в совокупности с методами молекулярно-генетического анализа существенно расширяет диагностические возможности.
ROC-анализ между когортами пациентов с установленными патогенными мутациями и условно здоровых
индивидуумов продемонстрировал удовлетворительные значения чувствительности/специфичности во всех временных точках, однако, помимо индекса фосфорилирования, для достоверной диагностики имеет смысл также оценивать характер кинетики данного процесса, поскольку обращает на себя внимание различие в кинетике фосфорилирования в когортах пациентов и условно здоровых индивидуумов.
У пациента P16 с ранее описанной патогенной мутацией c.1154C>T и тяжелой клинической картиной рецидивирующего кандидоза индекс фосфорилиро-вания оказался в пределах нормальных значений (Index pSTAT = 86 (60' < 125). Интересно, что у пациента P15 с аналогичным генетическим дефектом продемонстрировано усиление фосфорилирования, не вызывающее сомнений (Index pSTAT = 267 (60' < 125). Вариант c.1154C>T неоднократно упоминается в литературе и ведет к гиперфункции белка, проявляя усиленное фосфорилирование после стимуляции ИФН-а и ИФН-у [13, 26, 27]. Таким образом, STAT1-GOF - это сложное с диагностической точки зрения заболевание, при котором выявить гиперфункцию белка STAT1 не всегда возможно. По всей видимости, существуют дополнительные факторы (медикаментозная терапия, эпигенетические факторы и др.), влияние которых предстоит установить, расширяя спектр диагностических методов.
Необходимо отметить, что предложенная методика может быть применима не только для диагностики STATl-GOF-дефектов, но и в качестве дополнительного метода оценки патогенности новых генетических вариантов.
На данный момент описано более 150 дефектов в гене STAT1 [3, 7], однако продолжают выявляться ранее не описанные варианты, для уточнения биологической роли которых необходимо провести сложные, зачастую персонализированные, функциональные тесты. Примером качественной оценки влияния генетического варианта на функцию белка является работа Y. Yamazaki и соавт. [28], в которой выполнена разносторонняя оценка EBV-бласттрансформированных лимфоцитов (EBV - вирус Эпштейна-Барр) самих пациентов, а также исследование клеточной линии HeLa, STAT1-нокаутированной и трансфецированной плазмидой, содержащей генетические варианты пациентов.
Аналогичный подход использовали в работе E.P. Sam-paio и соавт. [26] с последующей оценкой фосфорилиро-вания белка с помощью вестерн-блота. Помимо вышеупомянутых методов, комплексный подход к подтверждению патогенности генетического варианта должен включать исследование количества ТЫ7-лимфоцитов, поскольку патогенная мутация GOF-типа приводит к критичному снижению их уровня [16, 29]. Предварительный анализ данных стимулированной экспрессии ИЛ-17 в когорте пациентов, включенных в это исследование, также подтверждает эту связь (данные готовятся к публикации).
c.508T>G, p.Tyr170Asp
c.508T>C, p.Tyr170His
c.499C>G, p.Gln176Glu
г c.629G>A, p.Arg210Lys
c.800C>T, p.Ala267Val
c.820C>T, p.Arg274Trp
r c.860А>C p.Tyr287Ser
c.862A>C, p.Thr288Pro
c.863C>T, p.Thr288Ile
c.878C>T, p.Pro293Leu
r c.1722T>A, p.Asn574Lys
N-terminal Coiled-coil DNA-binding Linker SH2 TAD
135
L c.199C>A p.Gln67Lys
c.69T>G p.Asp23Glu
L c.541+1G>A
317
488
576
683
L c.1189A>G, p.Asn397Asp
750
L c.1154C>T p.Thr385Met
L c.1069A>G p.Asn385Asp
1
L c.603G>A p.(Lys201=)
Рис. 7. Структура белка STAT1 с указанием замен аминокислот
На рисунке схематично изображена структура белка STAT1. Цифры в нижней части рисунка обозначают, в пределах каких аминокислот расположены домены. N-концевой домен (N-terminal) участвует в межбелковых взаимодействиях, необходимых для стабилизации связывания с ДНК и устойчивой транскрипционной активности. Суперспиральный домен ^oiled-coil) также задействован в процессе транскрипции, как и ДНК-связывающий домен (DNA-binding). Linker-домен участвует в формировании транскрипционного комплекса, при его повреждении активация генов невозможна. Домен SH2 (src homology 2) участвует в ре-ципрокном взаимодействии мономеров белка в процессе их димеризации. С-концевой домен TAD (transcriptional activation domain) непосредственно вовлечен во взаимодействие с другими транскрипционными факторами и коактиваторами; фосфорилирова-ние аминокислот тирозина 701 (Y701) и серина 727 (S727) данного домена критически важно для связывания мономеров белка и формирования активирующего комплекса, который проникает в ядро клетки и запускает транскрипцию. На схеме также отображены активирующие мутации включенных в данное исследование пациентов с указанием замены аминокислот. Желтым цветом выделены мутации неясного клинического значения (VUS), пунктиром отмечены мутации, приводящие к потере функции белка (LOF), серым цветом показана патогенная интронная мутация, приводящая к нарушению сплайсинга.
Согласно данным литературы, большинство активирующих мутаций в гене STAT1 расположены в суперспиральном (Coiled-coil) и ДНК-связывающем (DNA-binding) доменах [3, 10, 13, 30]. В нашем исследовании среди когорты пациентов с активирующими вариантами 94 % мутаций также были расположены в этих доменах (рис. 7). У 6 пациентов с клинической картиной, характерной для STAT1-GOF, были выявлены ранее не описанные генетические варианты: c.199C>A, c.508T>G, c.508T>C, c.860A>C, c.1069 A>G, c.1722T>A - у 4 из них (67 %) мутации также располагались в суперспиральном и ДНК-связывающем доменах (см. рис. 7).
После исследования у 5 пациентов из когорты неописанных вариантов в гене STAT1 были получены индексы фосфорилирования, превышающие рефе-ренсные значения, что указывает на вероятную пато-генность данных дефектов (см. табл. 2). У пациента P23 с вариантом c.1069 A>G и клинической картиной, типичной для GOF-мутаций, обнаружены нормальные значения индекса во всех временных точках с максимальным уровнем фосфорилирования в точке 60 мин.
Замена аминокислоты у данного пациента располагалась в области ДНК-связывающего домена, что характерно для активирующих мутаций. Поскольку индекс фосфорилирования во всех точках оказался в пределах референсных значений, несмотря на клиническую картину, локализацию дефекта и особенность кинетики фосфорилирования с максимальным значением на 60-й минуте, для подтверждения патогенности данного генетического варианта требуется проведение дополнительных тестов, в том числе исследование стимулированной продукции ИЛ-17.
Разработанная нами методика оценки фосфорилирования белка STAT1 с помощью проточной цитометрии показала высокую чувствительность и эффективность, позволив установить гиперфункцию белка у подавляющего большинства пациентов с патогенным вариантом в гене STAT1. Однако у пациента P16 с патогенной мутацией (c.1154C>T) и у пациента P23 с неописанным генетическим вариантом и характерной клинической картиной (с.1069 A>G) индексы фосфорилирования оказались в пределах нормы, что указывает на необ-
ходимость проведения дополнительных взаимодополняющих функциональных тестов. На вероятную патогенность данных вариантов указывает характер кинетики с максимумом фосфорилирования на 60-й минуте. Однако величина индекса фосфорилирования в пределах референсных значений у двух пациентов с клинической картиной, типичной для STAT1 GOF-дефектов, не позволяет считать метод эталонным для принятия окончательного решения о природе вновь выявленного генетического дефекта. Тем не менее это дополнительная информация, которая в совокупности с характерной клинической картиной позволяет существенно улучшить диагностику большинства пациентов с хроническим кандидозом.
Методика оказалась информативной также для диагностики редких дефектов, связанных с потерей функции белка (ST4T1-LOF). У двух пациентов (P17 и P22), включенных в исследование, наблюдалось отсутствие фосфорилирования белка STAT1. Однако для применения разработанной методики в целях выявления пациентов с LOF-мутациями требуется формирование большей выборки пациентов и проведение дополнительных исследований.
Заключение
Методы оценки фосфорилирования и динамики дефосфорилирования белка STAT1 в диагностике STAT1 -GOF-дефектов достаточно часто упоминаются в зарубежной литературе [8, 12, 16, 31]. Однако среди российских публикаций нет работ, описывающих методики функциональной оценки белка STAT1. Нами был разработан и предложен метод эффективной и быстрой оценки функции этого белка, усиленное фосфорилиро-вание которого лежит в основе патогенеза распространенного ВДИ.
Чрезвычайно вариабельная клиническая картина, наблюдаемая в случаях патогенных вариантов в гене STAT1, может оказаться причиной гиподиагностики данной патологии. Метод, основанный на проточной цитометрии, выполняется в короткие сроки, а также обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Оценка фосфорилирования белка STAT1 является эффективным инструментом как для первичной диагностики, так и для оценки патогенности вновь выявленных генетических вариантов, может быть широко использована в лабораторной практике как дополнительный инструмент для уточнения характера патологического процесса.
Приложение
Панель «Иммунологическая»: перечень генов, ассоциированных с различными врожденными дефектами иммунитета
A2ML1, ABCD4, ACD, ACP5, ACTB, ADA, ADA2, ADAM17, ADAMTS3, ADAR, ADGRE2, AGA, AICDA, AIRE, AK2, ALG12, ALPI, ANGPT1, AP1S3, AP3B1, AP3D1, ARHGEF1, ARPC1B, ATM, ATP6AP1, ATR, AURKB, B2M, BACH2, BCL10, BCL11B, BLM, BLNK,
BLOC1S3, BLOC1S6, BTK, C1QA, C1QB, C1QC, C1R, CIS, C2, C3, C3AR1, C5, C6, C7, C8A, C8B, C8G, C9, CA2, CARD11, CARD14, CARD9, CARMIL2, CASP10, CASP8, CBL, CBS, CCBE1, CD19, CD247, CD27, CD28, CD3D, CD3E, CD3G, CD40, CD40LG, CD48, CD55, CD59, CD70, CD79A, CD79B, CD80, CD81, CD8A, CDC42, CDCA7, CEBPE, CFB, CFD, CFH, CFI, CFP, CFTR, CHD7, CIB1, CIITA, CLCN7, CLPB, COG6, COL2A1, COL7A1, COPA, COPG1, COPZ1, CORO1A, CR2, CSF2RA, CSF2RB, CSF3R, CTC1, CTLA4, CTPS1, CTSC, CXCR4, CYBA, CYBB, CYBC1, DBF4, DBR1, DCLRE1C, DDX58, DEF6, DIAPH1, DKC1, DNASE1, DNASE1L3, DNASE2, DNMT3B, DOCK11, DOCK2, DOCK8, DPAGT1, DSG1, DTNBP1, EDA, EDAR, EDARADD, EFL1, EGFR, EIF6, ELANE, ELP1, EP300, EPCAM, EPG5, ERBIN, EXTL3, F12, FADD, FAM111B, FAS, FASLG, FAT4, FBN1, FCGR3A, FCGR3B, FCHO1, FECH, FERMT1, FERMT3, FNIP1, FOXN1, FOXP3, G6PC3, GATA1, GATA2, GBA, GFI1, GIMAP6, GINS1, GJC2, GLA, GUCY2C, HAVCR2, HAX1, HELLS, HFE, HMOX1, HPS1, HPS3, HPS4, HPS5, HPS6, HRAS, HSPA1L, HYOU1, ICOS, ICOSLG, IFIH1, IFNAR1, IFNAR2, IFNG, IFNGR1, IFNGR2, IGHM, IGKC, IGLL1, IKBKB, IKBKG, IKZF1, IL10, IL10RA, IL10RB, IL11RA, IL12B, IL12RB1, IL12RB2, IL17F, IL17RA, IL17RC, IL18BP, IL1RN, IL21, IL21R, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL36RN, IL6R, IL6ST, IL7R, IRAK4, IRF2BP2, IRF3, IRF4, IRF7, IRF8, IRF9, ISG15, ITCH, ITGA3, ITGB2, ITGB4, ITK, ITPKB, ITPR3, IVD, IVNS1ABP, JAGN1, JAK1, JAK3, KDM1A, KDM6A, KMT2A, KMT2D, KNG1, KRAS, LACC1, LAMA3, LAMB3, LAMC2, LAMTOR2, LAT, LCK, LCP2, LIG1, LIG4, LMBRD1, LPIN2, LRBA, LRP5, LRRC8A, LYN, LYST, LZTR1, MAGT1, MALT1, MAN2B1, MAP2K1, MAP2K2, MAP3K14, MCM4, MEFV, MMAA, MMAB, MMACHC, MMADHC, MMUT, MOGS, MPO, MRE11, MRTFA, MS4A1, MSN, MTHFD1, MTRR, MVK, MYD88, MYO5A, MYO5B, MYOF, MYSM1, NBAS, NBN, NCF1, NCF2, NCF4, NCKAP1L, NCSTN, NF1, NF2, NFE2L2, NFIL3, NFKB1, NFKB2, NFKBIA, NHEJ1, NHP2, NLRC4, NLRP1, NLRP12, NLRP3, NLRP6, NOD2, NOP10, NOS2, NRAS, NSMCE3, NUP214, OAS1, ORAI1, OSTM1, OTULIN, PARN, PCCA, PCCB, PEPD, PGM3, PIK3CD, PIK3CG, PIK3R1, PLCG2, PLEKHM1, PLG, PLVAP, PMM2, PNP, POGLUT1, POLA1, POLD1, POLD2, POLD3, POLE, POLE2, POLR3A, POLR3C, POLR3F, POMP, POU2AF1, PRDX1, PRF1, PRKCD, PRKDC, PSEN1, PSENEN, PSMA3, PSMA5, PSMB10, PSMB4, PSMB8, PSMB9, PSMC5, PSMG2, PSTPIP1, PTCRA, PTEN, PTPN11, PTPN2, PTPRC, RAB27A, RAC2, RAG1, RAG2, RANBP2, RASA2, RASGRP1, RBCK1, RC3H1, REL, RELA, RELB, RFX5, RFXANK, RFXAP, RHOG, RHOH, RIPK1, RMRP, RNASEH2A, RNASEH2B, RNASEH2C, RNF168, RNF31, RNU4ATAC, RORC, RPSA, RRAS, RRAS2, RTEL1, SAMD9L, SAMHD1, SASH3, SBDS, SC5D, SEC61A1, SEMA3E, SERPINB1, SERPING1, SH2D1A, SH3BP2, SH3KBP1, SHARPIN, SKIV2L, SLC29A3, SLC35A1, SLC35C1, SLC37A4, SLC39A4, SLC39A7, SLC39A8, SLC46A1, SLC7A7, SLCO2A1, SMARCAL1, SMARCD2, SMC1A, SMC3, SMPD1, SNORA31, SNX10,
SOCSl, SP1, SP 110, SPI1, SPINK5, SPPL2A, SRP54, STAT1, STAT2, STAT3, STAT5B, STIM1, STING1, STK4, STN1, STX11, STXBP2, STXBP3, TAP1, TAP2, TAPBP, TAZ, TBK1, TBX1, TBX21, TCF3, TCIRG1, TCN2, TERC, TERT, TFR2, TFRC, TGFBR1, TGFBR2, THBD, TICAM1, TIMM50, TINF2, TLR3, TLR7, TLRS, TMC6, TMCS, TNFAIP3, TNFRSF11A, TNFRSF13B, TNFRSF13C, TNFRSF1A, TNFRSF4, TNFRSF9, TNFSF11, TNFSF12,
TNFSF13, TOM1, TOP2B, TPP1, TPP2, TRAC, TRAF3, TRAF3IP2, TREX1, TRIM22, TRNT1, TSPEAR, TTC37, TTC7A, TYK2, UBA1(ex2-3), UNC13D, UNC93B1, UNG, USB1, USP18, USP43, VAV1, VPS13B, VPS45, WAS, WDR1, WDR44, WIPF1, WNT2B, WNT6, WRAP53, XIAP, XRCC4, ZAP70, ZBTB24, ZNF341 (названия генов даны по HUGO Gene Nomenclature Committee).
■ Литература
1. Bousfiha A., Moundir A., Tangye S.G., Picard C., Jeddane L., Al-Herz W., Rundles C.C., Franco J.L., Holland S.M., Klein C., Morio T., Oksenhendler E., Puel A., Puck J., Seppänen M.R.J., Somech R., Su H.C., Sullivan K.E., Torgerson T.R., Meyts I. The 2022 Update of IUIS Phenoty-pical Classification for Human Inborn Errors of Immunity. J. Clin. Immunol. 2022; 42 (7): 1508-20. DOI: http://doi.org/10.1007/s10875-022-01352-z
2. Лаберко А.Л., Старичкова Ю.В., Хисматуллина Р.Д., Персиан-цева М.И., Масчан М.А., Балашов Д.Н., Румянцев А.Г. Оптимизация планирования трансплантаций гемопоэтических стволовых клеток с использованием информационной системы у детей с первичными иммунодефицитами. Иммунология. 2021; 42 (1): 49-59. DOI: http:// doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-1-49-59
3. Okada S., Asano T., Moriya K., Boisson-Dupuis S., Kobayashi M., Casanova J.L., Puel A. Human STAT1 Gain-of-Function Heterozygous Mutations: Chronic Mucocutaneous Candidiasis and Type I Interferono-pathy. J. Clin. Immunol. 2020; 40 (8): 1065-81. DOI: http://doi. org/10.1007/s10875-020-00847-x
4. Boehmer D.F.R., Koehler L.M., Magg T., Metzger P., Rohlfs M., Ahlfeld J., Rack-Hoch A., Reiter K., Albert M.H., Endres S., Rothen-fusser S., Klein C., Koenig L.M., Hauck F. A. Novel Complete Autosomal-Recessive STAT1 LOF Variant Causes Immunodeficiency with Hemo-phagocytic Lymphohistiocytosis-Like Hyperinflammation. J. Allergy Clin. Immunol. Pract. 2020; 8 (9): 3102-11. DOI: http://doi.org/10.1016/j. jaip.2020.06.034
5. Lorenzini T., Dotta L., Giacomelli M., Vairo D., Badolato R. STAT mutations as program switchers: turning primary immunodeficiencies into autoimmune diseases. J. Leukoc. Biol. 2017; 101 (1): 29-38. DOI: http:// doi.org/10.1189/jlb.5RI0516-237RR
6. Boisson-Dupuis S., Kong X.F., Okada S., Cypowyj S., Puel A., Abel L., Casanova J.L. Inborn errors of human STAT1: allelic heterogeneity governs the diversity of immunological and infectious phenotypes. Curr. Opin. Immunol. 2012; 24 (4): 364-78. DOI: http://doi.org/10.1016/ j.coi.2012.04.011
7. Asano T., Utsumi T., Kagawa R., Karakawa S., Okada S. Inborn errors of immunity with loss- and gain-of-function germline mutations in STAT1. Clin. Exp. Immunol. 2023; 212 (2): 96-106. DOI: http://doi. org/10.1093/cei/uxac106
8. Liu L., Okada S., Kong X.F., Kreins A.Y., Cypowyj S., Abhy-ankar A., Toubiana J., Itan Y., Audry M., Nitschke P., Masson C., Toth B., Flatot J., Migaud M, Chrabieh M, Kochetkov T., Bolze A., Borghesi A., Toulon A., Hiller J., Eyerich S., Eyerich K, Gulácsy V., Chernyshova L., Chernyshov V., Bondarenko A., Grimaldo R.M., Blancas-Galicia L., Beas I.M., Roesler J., Magdorf K., Engelhard D., Thumerelle C., Burgel P.R., Hoernes M., Drexel B., Seger R., Kusuma T., Jansson A.F., Sawalle-Belohradsky J., Belohradsky B., Jouanguy E., Bustamante J., Bué M., Karin N., Wildbaum G., Bodemer C., Lortholary O., Fischer A., Blanche S., Al-Muhsen S., Reichenbach J., Kobayashi M., Rosales F.E., Lozano C.T., Kilic S.S., Oleastro M., Etzioni A., Traidl-Hoffmann C., Renner E.D., Abel L., Picard C., Maródi L., Boisson-Dupuis S., Puel A., Casanova J.L. Gain-of-function human STAT1 mutations impair IL-17 immunity and underlie chronic mucocutaneous candidiasis. J. Exp. Med. 2011; 208 (8): 1635-48. DOI: http://doi.org/10.1084/jem.20110958
9. Zimmerman O., Olbrich P., Freeman A.F., Rosen L.B., Uzel G., Zerbe C.S., Rosenzweig S.D., Kuehn H.S., Holmes K.L., Stephany D., Ding L., Sampaio E.P., Hsu A.P., Holland S.M. STAT1 Gain-of-Function Mutations Cause High Total STAT1 Levels With Normal Dephosphory-lation. Front. Immunol. 2019; 10: 1433. DOI: http://doi.org/10.3389/ fimmu.2019.01433
10. Erdös M., Jakobicz E., Soltész B., Tóth B., Bata-Csörgö Z., Maródi L. Recurrent, Severe Aphthous Stomatitis and Mucosal Ulcers as Primary Manifestations of a Novel STAT1 Gain-of-Function Muta-
tion. Front. Immunol. 2020; 11: 967. DOI: http://doi.org/10.3389/ fimmu.2020.00967
11. Toubiana J., Okada S, Hiller J., Oleastro M., Lagos Gomez M., Aldave Becerra J.C., Ouachee-Chardin M., Fouyssac F., Girisha K.M., Etzioni A., Van Montfrans J., Camcioglu Y., Kerns L.A., Belohradsky B., Blanche S., Bousfiha A., Rodriguez-Gallego C., Meyts I., Kisand K., Reichenbach J., Renner E.D., Rosenzweig S., Grimbacher B., van de Veerdonk F.L., Traidl-Hoffmann C., Picard C., Marodi L., Morio T., Kobayashi M., Lilic D., Milner J.D., Holland S., Casanova J.L., Puel A. International STAT1 Gain-of-Function Study Group. Heterozygous STAT1 gain-of-function mutations underlie an unexpectedly broad clinical pheno-type. Blood. 2016; 127 (25): 3154-64. DOI: http://doi.org/10.1182/blood-2015-11-679902
12. Dhalla F., Fox H., Davenport E.E., Sadler R., Anzilotti C., van Schouwenburg P.A., Ferry B., Chapel H., Knight J.C., Patel S.Y. Chronic mucocutaneous candidiasis: characterization of a family with STAT-1 gain-of-function and development of an ex-vivo assay for Th17 deficiency of diagnostic utility. Clin. Exp. Immunol. 2016; 184 (2): 216-27. DOI: http:// doi.org/10.1111/cei.12746
13. Depner M., Fuchs S., Raabe J., Frede N., Glocker C., Doffinger R., Gkrania-Klotsas E., Kumararatne D., Atkinson T.P., Schroeder H.W. Jr., Niehues T., Dückers G., Stray-Pedersen A., Baumann U., Schmidt R., Franco J.L., Orrego J., Ben-Shoshan M., McCusker C., Jacob C.M., Carneiro-Sampaio M., Devlin L.A., Edgar J.D., Henderson P., Russell R.K., Skytte A.B., Seneviratne S.L., Wanders J., Stauss H., Meyts I., Moens L., Jesenak M., Kobbe R., Borte S., Borte M., Wright D.A., Hagin D., Torgerson T.R., Grimbacher B. The Extended Clinical Phenotype of 26 Patients with Chronic Mucocutaneous Candidiasis due to Gain-of-Function Mutations in STAT1. J. Clin. Immunol. 2016; 36 (1): 73-84. DOI: http://doi. org/10.1007/s10875-015-0214-9
14. Maddur M.S., Miossec P., Kaveri S.V., Bayry J. Th17 cells: biology, pathogenesis of autoimmune and inflammatory diseases, and therapeutic strategies. Am. J. Pathol. 2012; 181 (1): 8-18. DOI: http://doi. org/10.1016/j.ajpath.2012.03.044
15. Bystrom J., Clanchy F.I.L., Taher T.E., Al-Bogami M., Ong V.H., Abraham D.J., Williams R.O., Mageed R.A. Functional and phenotypic heterogeneity of Th17 cells in health and disease. Eur. J. Clin. Invest. 2019; 49 (1): e13032. DOI: http://doi.org/10.1111/eci.13032
16. Ng W.F., von Delwig A., Carmichael A.J., Arkwright P.D., Abinun M., Cant A.J., Jolles S., Lilic D. Impaired T(H)17 responses in patients with chronic mucocutaneous candidiasis with and without autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy. J. Allergy Clin. Immunol. 2010; 126 (5): 1006-15. DOI: http://doi.org/10.1016/j. jaci.2010.08.027
17. Bitar M., Boldt A., Binder S., Borte M., Kentouche K., Borte S., Sack U. Flow cytometric measurement of STAT1 and STAT3 phosphorylation in CD4+ and CD8+ T cells-clinical applications in primary immunodeficiency diagnostics. J. Allergy Clin. Immunol. 2017; 140 (5): 1439-41. DOI: http://doi.org/10.1016/jjaci.2017.05.017
18. Karczewski K.J., Francioli L.C., Tiao G., Cummings B.B., Alföldi J., Wang Q., Collins R.L., Laricchia K.M., Ganna A., Birnbaum D.P., Gauthier L.D., Brand H., Solomonson M., Watts N.A., Rhodes D., SingerBerk M., England E.M., Seaby E.G., Kosmicki J.A., Walters R.K., Tashman K., Farjoun Y., Banks E., Poterba T., Wang A., Seed C., Whiffin N., Chong J.X., Samocha K.E., Pierce-Hoffman E., Zappala Z., O'Donnell-LuriaA.H., Minikel E.V., Weisburd B., Lek M., Ware J.S., Vittal C., Armean I.M., Bergelson L., Cibulskis K., Connolly K.M., Covarrubias M., Donnelly S., Ferriera S., Gabriel S., Gentry J., Gupta N., Jeandet T., Kaplan D., Llanwarne C., Munshi R., Novod S., Petrillo N., Roazen D., Ruano-Rubio V., Saltzman A., Schleicher M., Soto J., Tibbetts K., Tolonen C., Wade G., Talkowski M.E.; Genome Aggregation Database Consortium; Neale B.M., Daly M.J., MacArthur D.G. The muta-
tional constraint spectrum quantified from variation in 141,456 humans. Nature. 2020; 581 (7809): 434-43. DOI: http://doi.org/10.1038/s41586-020-2308-7
19 Kircher M., Witten D.M., Jain P., O'Roak B.J., Cooper G.M., Shendure J. A general framework for estimating the relative pathogenicity of human genetic variants. Nat. Genet. 2014; 46 (3): 310-5. DOI: http:// doi.org/10.1038/ng.2892
20 Adzhubei I.A., Schmidt S., Peshkin L., Ramensky V.E., Gera-simova A., Bork P., Kondrashov A.S., Sunyaev S.R. A method and server for predicting damaging missense mutations. Nat. Methods. 2010; 7 (4): 248-9. DOI: http://doi.org/10.1038/nmeth0410-248
21 Ng P.C., Henikoff S. Predicting deleterious amino acid substitutions. Genome Res. 2001; 11 (5): 863-74. DOI: http://doi.org/10.1101/ gr. 176601
22 Choi Y., Sims G.E., Murphy S., Miller J.R., Chan A.P. Predicting the functional effect of amino acid substitutions and indels. PLoS One. 2012; 7 (10): e46688. DOI: http://doi.org/10.1371/journal.pone.0046688
23 Jaganathan K., Kyriazopoulou Panagiotopoulou S., McRae J.F., Darbandi S.F., Knowles D., Li Y.I., Kosmicki J.A., Arbelaez J., Cui W., Schwartz G.B., Chow E.D., Kanterakis E., Gao H., Kia A., Batzoglou S., Sanders S.J., Farh K.K. Predicting Splicing from Primary Sequence with Deep Learning. Cell. 2019; 176 (3): 535-48.e24. DOI: http://doi. org/10.1016/j.cell.2018.12.015
24. Richards S., Aziz N., Bale S., Bick D., Das S., Gastier-Foster J., Grody W.W., Hegde M., Lyon E., Spector E., Voelkerding K., Rehm H.L.; ACMG Laboratory Quality Assurance Committee. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genet. Med. 2015; 17 (5): 405-24. DOI: http://doi.org/10.1038/gim.2015.30
25. Рыжкова О.П., Кардымон О.Л., Прохорчук Е.Б., Коновалов Ф.А., Масленников А.Б., Степанов В.А., Афанасьев А.А., Заклязьминская Е.В., Ребриков Д.В., Савостьянов К.В., Глотов А.С., Костарева А.А., Павлов А.Е., Голубенко М.В., Поляков А.В., Куцев С. И. Руководство по интерпретации данных, полученных методами массового параллельного секвенирования (MPS). Медицинская Генетика. 2017; 16 (7): 4-17. DOI: http://doi.org/10.25557/2073-7998.2019.02.3-23
26. Sampaio E.P., Hsu A.P., Pechacek J., Bax H.I., Dias D.L., Paulson M.L., Chandrasekaran P., Rosen L.B., Carvalho D.S., Ding L., Vinh D.C., Browne S.K., Datta S., Milner J.D., Kuhns D.B., Long Priel D.A., Sadat M.A., Shiloh M., De Marco B., Alvares M., Gillman J.W., Ramarathnam V., de la Morena M., Bezrodnik L., Moreira I., Uzel G., Johnson D, Spalding C., Zerbe C.S., Wiley H., Greenberg D.E., Hoover S.E., Rosenzweig S.D., Galgiani J.N., Holland S.M. Signal transducer and activator of transcription 1 (STAT1) gain-of-function mutations and disseminated coccidioidomycosis and histoplasmosis. J. Allergy Clin. Immunol. 2013; 131 (6): 1624-34. DOI: http://doi.org/10.1016/j. jaci.2013.01.052
27. Takezaki S., Yamada M., Kato M., Park M.J., Maruyama K., Yamazaki Y., Chida N., Ohara O., Kobayashi I., Ariga T. Chronic mucocutaneous candidiasis caused by a gain-of-function mutation in the STAT1 DNA-binding domain. J. Immunol. 2012; 189 (3): 1521-6. DOI: http://doi. org/10.4049/jimmunol.1200926
28. Yamazaki Y., Yamada M., Kawai T., Morio T., Onodera M., Ueki M., Watanabe N., Takada H., Takezaki S., Chida N., Kobayashi I., Ariga T. Two novel gain-of-function mutations of STAT1 responsible for chronic mucocutaneous candidiasis disease: impaired production of IL-17A and IL-22, and the presence of anti-IL-17F autoantibody. J. Immunol. 2014; 193 (10): 4880-7. DOI: http://doi.org/10.4049/jimmunol.1401467
29. Korn T., Bettelli E., Oukka M., Kuchroo V.K. IL-17 and Th17 Cells. Annu. Rev. Immunol. 2009; 27: 485-517. DOI: http://doi. org/10.1146/annurev.immunol.021908.132710
30. Van De Veerdonk F.L., Plantinga T.S., Hoischen A., Smeekens S.P., Joosten L.A., Gilissen C., Arts P., Rosentul D.C., Carmi-chael A.J., Smits-van der Graaf C.A., Kullberg B.J., van der Meer J.W., Lilic D., Veltman J.A., Netea M.G. STAT1 mutations in autosomal dominant chronic mucocutaneous candidiasis. N. Engl. J. Med. 2011; 365 (1): 54-61. DOI: http://doi.org/10.1056/NEJMoa1100102
31. Kim H.S., Lee M.S. STAT1 as a key modulator of cell death. Cellular Signalling. 2007; 19 (3): 454-65. DOI: http://doi.org/10.1016/j. cellsig.2006.09.003
32. Румянцев А.Г., Демина О.М. Молекулярные пути JAK в патогенезе воспаления при акне. Иммунология. 2021; 42 (1): 38-48. DOI: http://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-1-38-48
■ References
1. Bousfiha A., Moundir A., Tangye S.G., Picard C., Jeddane L., Al-Herz W., Rundles C.C., Franco J.L., Holland S.M., Klein C., Morio T., Oksenhendler E., Puel A., Puck J., Seppanen M.R.J., Somech R., Su H.C., Sullivan K.E., Torgerson T.R., Meyts I. The 2022 Update of IUIS Phenotypical Classification for Human Inborn Errors of Immunity. J Clin Immunol. 2022; 42 (7): 1508-20. DOI: http://doi.org/10.1007/s10875-022-01352-z
2. Laberko A.L., Starichkova Yu.V., Khismatullina R.D., Persiantseva M.I., Maschan M.A., Balashov D.N., Rumyantsev A.G. Optimization of hematopoietic stem cell transplantation planning using medical information system in children with primary immunodeficiencies. Immunologiya. 2021; 42 (1): 49-59. DOI: 10.33029/0206-4952-2021-421-49-59 (in Russian)
3. Okada S., Asano T., Moriya K., Boisson-Dupuis S., Kobayashi M., Casanova J.L., Puel A. Human STAT1 Gain-of-Function Heterozygous Mutations: Chronic Mucocutaneous Candidiasis and Type I Interferono-pathy. J Clin Immunol. 2020; 40 (8): 1065-81. DOI: http://doi.org/10.1007/ s10875-020-00847-x
4. Boehmer D.F.R., Koehler L.M., Magg T., Metzger P., Rohlfs M., Ahlfeld J., Rack-Hoch A., Reiter K., Albert M.H., Endres S., Rothenfusser S., Klein C., Koenig L.M., Hauck F. A. Novel Complete Autosomal-Recessive STAT1 LOF Variant Causes Immunodeficiency with Hemophagocytic Lymphohistiocytosis-Like Hyperinflammation. J Allergy Clin Immunol Pract. 2020; 8 (9): 3102-11. DOI: http://doi.org/10.1016/j. jaip.2020.06.034
5. Lorenzini T., Dotta L., Giacomelli M., Vairo D., Badolato R. STAT mutations as program switchers: turning primary immunodeficiencies into autoimmune diseases. J Leukoc Biol. 2017; 101 (1): 29-38. DOI: http:// doi.org/10.1189/jlb.5RI0516-237RR
6. Boisson-Dupuis S., Kong X.F., Okada S., Cypowyj S., Puel A., Abel L., Casanova J.L. Inborn errors of human STAT1: allelic heterogeneity governs the diversity of immunological and infectious phenotypes. Curr Opin Immunol. 2012; 24 (4): 364-78. DOI: http://doi.org/10.1016/j. coi.2012.04.011
7. Asano T., Utsumi T., Kagawa R., Karakawa S., Okada S. Inborn errors of immunity with loss- and gain-of-function germline mutations in STAT1. Clin Exp Immunol. 2023; 212 (2): 96-106. DOI: http://doi. org/10.1093/cei/uxac106
8. Liu L., Okada S., Kong X.F., Kreins A.Y., Cypowyj S., Abhyankar A., Toubiana J., Itan Y., Audry M., Nitschke P., Masson C., Toth B., Flatot J., Migaud M, Chrabieh M, Kochetkov T., Bolze A., Borghesi A., Toulon A., Hiller J., Eyerich S., Eyerich K, Gulácsy V., Chernyshova L., Chernyshov V., Bondarenko A., Grimaldo R.M., Blancas-Galicia L., Beas I.M., Roesler J., Magdorf K., Engelhard D., Thumerelle C., Burgel P.R., Hoernes M., Drexel B., Seger R., Kusuma T., Jansson A.F., Sawalle-Belohradsky J., Belohradsky B., Jouanguy E., Bustamante J., Bué M., Karin N., Wildbaum G., Bodemer C., Lortholary O., Fischer A., Blanche S., Al-Muhsen S., Reichenbach J., Kobayashi M., Rosales F.E., Lozano C.T., Kilic S.S., Oleastro M., Etzioni A., Traidl-Hoffmann C., Renner E.D., Abel L., Picard C., Maródi L., Boisson-Dupuis S., Puel A., Casanova J.L. Gain-of-function human STAT1 mutations impair IL-17 immunity and underlie chronic mucocutaneous candidiasis. J Exp Med. 2011; 208 (8): 1635-48. DOI: http://doi.org/10.1084/jem.20110958
9. Zimmerman O., Olbrich P., Freeman A.F., Rosen L.B., Uzel G., Zerbe C.S., Rosenzweig S.D., Kuehn H.S., Holmes K.L., Stephany D., Ding L., Sampaio E.P., Hsu A.P., Holland S.M. STAT1 Gain-of-Function Mutations Cause High Total STAT1 Levels With Normal Dephosphorylation. Front Immunol. 2019; 10: 1433. DOI: http://doi. org/10.3389/fimmu.2019.01433
10. Erdös M., Jakobicz E., Soltész B., Tóth B., Bata-Csörgö Z., Maródi L. Recurrent, Severe Aphthous Stomatitis and Mucosal Ulcers as Primary Manifestations of a Novel STAT1 Gain-of-Function Mutation. Front Immunol. 2020; 11: 967. DOI: http://doi.org/10.3389/ fimmu.2020.00967
11. Toubiana J., Okada S, Hiller J., Oleastro M., Lagos Gomez M., Aldave Becerra J.C., Ouachée-Chardin M., Fouyssac F., Girisha K.M., Etzioni A., Van Montfrans J., Camcioglu Y., Kerns L.A., Belohradsky B., Blanche S., Bousfiha A., Rodriguez-Gallego C., Meyts I., Kisand K., Reichenbach J., Renner E.D., Rosenzweig S., Grimbacher B., van de
Veerdonk F.L., Traidl-Hoffmann C., Picard C., Marodi L., Morio T., Kobayashi M., Lilic D., Milner J.D., Holland S., Casanova J.L., Puel A. International STAT1 Gain-of-Function Study Group. Heterozygous STAT1 gain-of-function mutations underlie an unexpectedly broad clinical phenotype. Blood. 2016; 127 (25): 3154-64. DOI: http://doi.org/10.1182/ blood-2015-11-679902
12. Dhalla F., Fox H., Davenport E.E., Sadler R., Anzilotti C., van Schouwenburg P.A., Ferry B., Chapel H., Knight J.C., Patel S.Y. Chronic mucocutaneous candidiasis: characterization of a family with STAT-1 gain-of-function and development of an ex-vivo assay for Th17 deficiency of diagnostic utility. Clin Exp Immunol. 2016; 184 (2): 216-27. DOI: http:// doi.org/10.1111/cei.12746
13. Depner M., Fuchs S., Raabe J., Frede N., Glocker C., Doffinger R., Gkrania-Klotsas E., Kumararatne D., Atkinson T.P., Schroeder H.W. Jr., Niehues T., Dückers G., Stray-Pedersen A., Baumann U., Schmidt R., Franco J.L., Orrego J., Ben-Shoshan M., McCusker C., Jacob C.M., Carneiro-Sampaio M., Devlin L.A., Edgar J.D., Henderson P., Russell R.K., Skytte A.B., Seneviratne S.L., Wanders J., Stauss H., Meyts I., Moens L., Jesenak M., Kobbe R., Borte S., Borte M., Wright D.A., Hagin D., Torgerson T.R., Grimbacher B. The Extended Clinical Phenotype of 26 Patients with Chronic Mucocutaneous Candidiasis due to Gain-of-Function Mutations in STAT1. J Clin Immunol. 2016; 36 (1): 73-84. DOI: http://doi. org/10.1007/s10875-015-0214-9
14. Maddur M.S., Miossec P., Kaveri S.V., Bayry J. Th17 cells: biology, pathogenesis of autoimmune and inflammatory diseases, and therapeutic strategies. Am J Pathol. 2012; 181n (1): 8-18. DOI: http://doi. org/10.1016/j.ajpath.2012.03.044
15. Bystrom J., Clanchy F.I.L., Taher T.E., Al-Bogami M., Ong V.H., Abraham D.J., Williams R.O., Mageed R.A. Functional and phenotypic heterogeneity of Th17 cells in health and disease. Eur J Clin Invest. 2019; 49 (1): e13032. DOI: http://doi.org/10.1111/eci.13032
16. Ng W.F., von Delwig A., Carmichael A.J., Arkwright P.D., Abinun M., Cant A.J., Jolles S., Lilic D. Impaired T(H)17 responses in patients with chronic mucocutaneous candidiasis with and without autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy. J Allergy Clin Immunol. 2010; 126 (5): 1006-15. DOI: http://doi. org/10.1016/j.jaci.2010.08.027
17. Bitar M., Boldt A., Binder S., Borte M., Kentouche K., Borte S., Sack U. Flow cytometric measurement of STAT1 and STAT3 phosphorylation in CD4+ and CD8+ T cells-clinical applications in primary immunodeficiency diagnostics. J Allergy Clin Immunol. 2017; 140 (5): 1439-41. DOI: http://doi.org/10.1016/jjaci.2017.05.017
18. Karczewski K.J., Francioli L.C., Tiao G., Cummings B.B., Alföldi J., Wang Q., Collins R.L., Laricchia K.M., GannaA., Birnbaum D.P., Gauthier L.D., Brand H., Solomonson M., Watts N.A., Rhodes D., SingerBerk M., England E.M., Seaby E.G., Kosmicki J.A., Walters R.K., Tashman K., Farjoun Y., Banks E., Poterba T., Wang A., Seed C., Whiffin N., Chong J.X., Samocha K.E., Pierce-Hoffman E., Zappala Z., O'Donnell-Luria A.H., Minikel E.V., Weisburd B., Lek M., Ware J.S., Vittal C., Armean I.M., Bergelson L., Cibulskis K., Connolly K.M., Covarrubias M., Donnelly S., Ferriera S., Gabriel S., Gentry J., Gupta N., Jeandet T., Kaplan D., Llanwarne C., Munshi R., Novod S., Petrillo N., Roazen D., Ruano-Rubio V., Saltzman A., Schleicher M., Soto J., Tibbetts K., Tolonen C., Wade G., Talkowski M.E.; Genome Aggregation Database Consortium; Neale B.M., Daly M.J., MacArthur D.G. The mutational constraint spectrum quantified from variation in 141,456 humans. Nature. 2020; 581 (7809): 434-43. DOI: http://doi.org/10.1038/ s41586-020-2308-7
19 Kircher M., Witten D.M., Jain P., O'Roak B.J., Cooper G.M., Shendure J. A general framework for estimating the relative pathogenicity of human genetic variants. Nat Genet. 2014; 46 (3): 310-5. DOI: http://doi. org/10.1038/ng.2892
20 Adzhubei I.A., Schmidt S., Peshkin L., Ramensky V.E., Gerasimova A., Bork P., Kondrashov A.S., Sunyaev S.R. A method and
Сведения об авторах
Фадеева Мария Сергеевна - врач КЛД лаб. трансплантационной иммунологии и иммунотерапии гемобластозов ФГБУ «НМИЦ ДГОИ им. Д. Рогачева» Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: mfadeeva@icloud.com https://orcid.org/0000-0002-6553-2505
server for predicting damaging missense mutations. Nat Methods. 2010; 7 (4): 248-9. DOI: http://doi.org/10.1038/nmeth0410-248
21 Ng P.C., Henikoff S. Predicting deleterious amino acid substitutions. Genome Res. 2001; 11 (5): 863-74. DOI: http://doi.org/10.1101/gr.176601
22 Choi Y., Sims G.E., Murphy S., Miller J.R., Chan A.P. Predicting the functional effect of amino acid substitutions and indels. PLoS One. 2012; 7 (10): e46688. DOI: http://doi.org/10.1371/journal.pone.0046688
23 Jaganathan K., Kyriazopoulou Panagiotopoulou S., McRae J.F., Darbandi S.F., Knowles D., Li Y.I., Kosmicki J.A., Arbelaez J., Cui W., Schwartz G.B., Chow E.D., Kanterakis E., Gao H., Kia A., Batzoglou S., Sanders S.J., Farh K.K. Predicting Splicing from Primary Sequence with Deep Learning. Cell. 2019; 176 (3): 535-48.e24. DOI: http://doi. org/10.1016/j.cell.2018.12.015
24. Richards S., Aziz N., Bale S., Bick D., Das S., Gastier-Foster J., Grody W.W., Hegde M., Lyon E., Spector E., Voelkerding K., Rehm H.L.; ACMG Laboratory Quality Assurance Committee. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genet Med. 2015; 17 (5): 405-24. DOI: http://doi.org/10.1038/gim.2015.30
25. Ryzhkova O.P., Kardymon O.L. Prohorchuk E.B., Konovalov F.A., Maslennikov A.B., Stepanov V.A., Afanasyev A.A., Zaklyazminskaya E.V., Rebrikov D.V., Savostianov K.V., Glotov A.S., Kostareva A.A., Pavlov A.E., Golubenko M.V., Polyakov A.V., Kutsev S.I. Guidelines for the interpretation of massive parallel sequencing variants (MPS). Medical genetics. 2017; 16 (7): 4-17. DOI: http://doi.org/10.25557/2073-7998.2019.02.3-23 (in Russian)
26. Sampaio E.P., Hsu A.P., Pechacek J., Bax H.I., Dias D.L., Paulson M.L., Chandrasekaran P., Rosen L.B., Carvalho D.S., Ding L., Vinh D.C., Browne S.K., Datta S., Milner J.D., Kuhns D.B., Long Priel D.A., Sadat M.A., Shiloh M., De Marco B., Alvares M., Gillman J.W., Ramarathnam V., de la Morena M., Bezrodnik L., Moreira I., Uzel G., Johnson D, Spalding C., Zerbe C.S., Wiley H., Greenberg D.E., Hoover S.E., Rosenzweig S.D., Galgiani J.N., Holland S.M. Signal transducer and activator of transcription 1 (STAT1) gain-of-function mutations and disseminated coccidioidomycosis and histoplasmosis. J Allergy Clin Immunol. 2013; 131 (6): 1624-34. DOI: http://doi. org/10.1016/j.jaci.2013.01.052
27. Takezaki S., Yamada M., Kato M., Park M.J., Maruyama K., Yamazaki Y., Chida N., Ohara O., Kobayashi I., Ariga T. Chronic muco-cutaneous candidiasis caused by a gain-of-function mutation in the STAT1 DNA-binding domain. J Immunol. 2012; 189 (3): 1521-6. DOI: http://doi. org/10.4049/jimmunol.1200926
28. Yamazaki Y., Yamada M., Kawai T., Morio T., Onodera M., Ueki M., Watanabe N., Takada H., Takezaki S., Chida N., Kobayashi I., Ariga T. Two novel gain-of-function mutations of STAT1 responsible for chronic mucocutaneous candidiasis disease: impaired production of IL-17A and IL-22, and the presence of anti-IL-17F autoantibody. J Immunol. 2014; 193 (10): 4880-7. DOI: http://doi.org/10.4049/jimmunol.1401467
29. Korn T., Bettelli E., Oukka M., Kuchroo V.K. IL-17 and Th17 Cells. Annu Rev Immunol. 2009; 27: 485-517. DOI: http://doi.org/10.1146/ annurev.immunol.021908.132710
30. Van De Veerdonk F.L., Plantinga T.S., Hoischen A., Smeekens S.P., Joosten L.A., Gilissen C., Arts P., Rosentul D.C., Carmi-chael A.J., Smits-van der Graaf C.A., Kullberg B.J., van der Meer J.W., Lilic D., Veltman J.A., Netea M.G. STAT1 mutations in autosomal dominant chronic mucocutaneous candidiasis. N Engl J Med. 2011; 365 (1): 54-61. DOI: http://doi.org/10.1056/NEJMoa1100102
31. Kim H.S., Lee M.S. STAT1 as a key modulator of cell death. Cellular Signalling. 2007; 19 (3): 454-65. DOI: http://doi.org/10.1016/j. cellsig.2006.09.003
32. Rumyantsev A.G., Demina O.M. Molecular pathways of JAK in the pathogenesis of inflammation in acne. Immunologiya. 2021; 42 (1): 38-48. DOI: http://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-1-38-48 (in Russian)
Authors' information
Mariia S. Fadeeva - Clinical Laboratory Diagnostics Physician of the Hematopoietic Stem Cell Transplantation and Immunotherapy Lab., D. Rogachev FRC PHOI of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: mfadeeva@icloud.com https://orcid.org/0000-0002-6553-2505
Созонова Татьяна Алексеевна - врач КЛД лаб. трансплантационной иммунологии и иммунотерапии гемобла-стозов ФГБУ «НМИЦ ДГОИ им. Д. Рогачева» Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: tania_heurly@mail.ru https://orcid.org/0009-0004-0057-2727
Богданова Дарья Валерьевна - врач аллерголог-иммунолог стационара кратковременного лечения ФГБУ «НМИЦ ДГОИ им. Д. Рогачева» Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: miss.daryabogdanova@yandex.ru https://orcid.org/0000-0003-2897-5208
Алексенко Максим Юрьевич - врач КЛД лаб. молекулярной биологии ФГБУ «НМИЦ ДГОИ им. Д. Рогачева» Минздрава России, Москва, Российская Федерация
E-mail: alexmaxq@yandex.ru https://orcid.org/0000-0002-2521-5353
Кулаковская Елена Алексеевна - биолог лаб. трансплантационной иммунологии и иммунотерапии гемобластозов ФГБУ «НМИЦ ДГОИ им. Д. Рогачева» Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: alenakulakovskaya@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-9639-2779
Ведмедская Виктория Андреевна - биолог лаб. трансплантационной иммунологии и иммунотерапии гемобла-стозов ФГБУ «НМИЦ ДГОИ им. Д. Рогачева» Минздрава России, Москва, Российская Федерация
E-mail: viktorivez@ya.ru https://orcid.org/0000-0001-7247-4844
Лодоева Оюна Баясхаловна - врач КЛД лаб. трансплантационной иммунологии и иммунотерапии гемобластозов ФГБУ «НМИЦ ДГОИ им. Д. Рогачева» Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: lodoeva.oyuna@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-2874-0014
Родина Юлия Александровна - канд. мед. наук, зав. отд. иммунологии ФГБУ «НМИЦ ДГОИ им. Д. Рогачева» Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: rodina.julija@rambler.ru http://orcid.org/0000-0001-9857-4456
Щербина Анна Юрьевна - д-р мед. наук, проф., зам. директора Института гематологии, иммунологии и клеточных технологий ФГБУ «НМИЦ ДГОИ им. Д. Рогачева» Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: shcher26@hotmail.com http://orcid.org/0000-0002-3113-4939
Першин Дмитрий Евгеньевич - канд. мед. наук, зав. лаб. трансплантационной иммунологии и иммунотерапии гемобластозов ФГБУ «НМИЦ ДГОИ им. Д. Рогачева» Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: dimprsh@icloud.com http://orcid.org/0000-0002-6148-7209
Tatyana A. Sozonova - Clinical Laboratory Diagnostics Physician of the Hematopoietic Stem Cell Transplantation and Immunotherapy Lab., D. Rogachev FRC PHOI of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: tania_heurly@mail.ru https://orcid.org/0009-0004-0057-2727
Darya V. Bogdanova - Physician allergologist-immunologist of Short-Term Treatment Dept., D. Rogachev FRC PHOI of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: miss.daryabogdanova@yandex.ru https://orcid.org/0000-0003-2897-5208
Maxim Yu. Alexenko - Clinical Laboratory Diagnostics Physician of the Molecular Biology Lab., D. Rogachev FRC PHOI of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: alexmaxq@yandex.ru https://orcid.org/0000-0002-2521-5353
Elena A. Kulakovskaya - Biologist of the Hematopoi-etic Stem Cell Transplantation and Immunotherapy Lab., D. Rogachev FRC PHOI of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: alenakulakovskaya@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-9639-2779
Viktoria A. Vedmedskaya - Biologist of the Hematopoi-etic Stem Cell Transplantation and Immunotherapy Lab., D. Rogachev FRC PHOI of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: viktorivez@ya.ru https://orcid.org/0000-0001-7247-4844
Oyuna B. Lodoeva - Clinical Laboratory Diagnostics Physician of the Hematopoietic Stem Cell Transplantation and Immunotherapy Lab., D. Rogachev FRC PHOI of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: lodoeva.oyuna@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-2874-0014
Julia A. Rodina - PhD, Head of the Immunology Dept., D. Rogachev FRC PHOI of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: rodina.julija@rambler.ru http://orcid.org/0000-0001-9857-4456
Anna Yu. Shcherbina - MD, PhD, Prof., Deputy Director of the Institute of Hematology, Immunology and Cellular Technologies, D. Rogachev FRC PHOI of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: shcher26@hotmail.com http://orcid.org/0000-0002-3113-4939
Dmitry Е. Pershin - PhD, Head of the Hematopoietic Stem Cell Transplantation and Immunotherapy Lab., D. Rogachev FRC PHOI of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: dimprsh@icloud.com http://orcid.org/0000-0002-6148-7209
