CC BY
72
РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ КАМПИЛОБАКТЕРИОЗА, ЛЕПТОСПИРОЗА
И.В ЖАРНИКОВА, И.С ТЮМЕНЦЕВА, Е.В.АЛИЕВА,
А.В.ТАРАН , Е.В.ЖДАНОВА, И.В.ЮРКИНА
Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт, Ставрополь
В настоящее время значительное внимание специалистов привлекает изучение таких инфекций как кампилобактериоз, лептоспироз, что обусловлено их распространением, интенсивной циркуляцией среди людей и животных, значительными показателями заболеваемости и существенным социально-экономическим ущербом от этой инфекции. спорадические случаи кам-билобактериоза, лептоспироза связывают с активацией эпизоотического процесса среди птиц, животных и употреблением населением инфицированных продуктов питания и воды. при эпидемиологическом обследовании традиционные методы индикации (бактериологические) не удовлетворяют требованиям экспрессности, в связи с этим необходимо вести поиск усовершенствования серологических методов диагностики.
Цель данных исследований - разработка и применение высококачественных флуоресцирующих диагностических препаратов для выявления возбудителей кампилобактериоза, лептоспироза.
Для получения полноценных антигенных комплексов лептоспир выбраны штаммы 6 серогрупп (Leptospira Sejroe, Leptospira Pomona, Leptospira Canicola, Leptospira Tarassovi, Leptospira Grippotyphosa, Leptospira Icterohaemorragiae), входящие в типовой диагностический набор штаммов для реакции микроагглютинации и имеющие наибольшее эпидемиологическое и эпизоото-логическое значение [3]. Бакмассы патогенных лептоспир выращивали на среде Ферворта-Вольфа при (28-30)°С в течение 7-10 суток, обеззараживали и использовали в работе [4]. Для получения кампилобактериозных биомасс использовали типичные штаммы кампилобактеров
- С^ерш, С.соК, которые имеют наибольшее значение в этиологии заболевания у людей [1]. Из биомасс извлекали специфичные антигенные комплексы, объединяли, получали полигрупповой водорастворимый антиген, который служил иммуногеном при получении гиперим-мунных сывороток. Иммунизацию проводили по схеме, предложенной Е.Н. Афанасьевым [2]. Активность антигенов, сывороток, иммуноглобулинов определяли методом радиальной иммунодиффузии по О.Оухтерлони. Конъюгацию иммуноглобулинов, фракционированных из сыворотки, проводили с флуоресцеином изотиацио-натом, очистку конъюгата от несвязавшегося красителя осуществляли с использованием сефадекса 0-50 на хроматографической установке.
В задачу настоящего исследования входило сравнительное изучение методов выделения иммуноглобулинов и подбор оптимальных условий конъюгации иммуноглобулинов, выделенных из гипериммунных кроличьих сывороток, с флуоресцеином изотиоцианатом (количество флуорохрома, значения рН и температуры реакционной смеси, времени конъюгации, определение влияния молярных отношений Мф/Мб на серологическую активность конъюгатов), а также изучение физико-химических свойств, чувствительности, активности и специфичности конъюгатов.
Материалы и методика. Для конъюгации с флуоресцеином изотиоцианатом (ФИТЦ) были использованы иммуноглобулины, преципитированные следующими методами: сульфатным, полиэтиленгликоль (ПЭГ-6000), каприловой кислотой.
Для метки ФИТЦ использовали раствор иммуног-
МЕДИЦИНСКИЙ ВЕСТНИК СЕВЕРНОГО КАВКАЗА, № 1 2006
лобулинов с концентрацией белка 10-25 мг/мл. Краситель добавляли медленно к раствору белка при постоянном помешивании. Присоединение ФИТЦ к белку всегда происходит в щелочной среде. По данным литературы, наилучшими условиями являются показатели рН - 8,59,0. Используя 0,1 М фосфатный буферный раствор, мы изучили значения рН 8,5; 9,0; 9,5 и две нагрузки красителя: 20 мг и 25 мг на 1 г белка. Время контакта красителя с белком в наших экспериментах составляло 1; 2; 4; 12 часов. Температурный режим конъюгации: 40С, 200С и 370С. Конъюгацию иммуноглобулинов проводили при постоянном перемешивании на магнитной мешалке. Коньюгаты освобождали от несвязавшегося флюорохрома гель-фильтрацией на колонках с сефадексом О-50 или 0-25 с последующим элюированием конъюгата 0,1 М фосфатным буферным раствором (рН 8,5; 9,0; 9,5 соответственно рН конъюгации). Концентрацию белка определяли спектрофотометрически при длине волн 280 нм (область максимального поглощения для белка) и 495 нм (область максимального поглощения для ФИТЦ). Концентрацию белка и молярное соотношение флуоро-хром/белок рассчитывали по формулам:
(Б^ - 0,37х0495) х 50 Х = 1п , где
Э280 - оптическая плотность раствора при длине волны 280 нм;
Э495 - оптическая плотность раствора при длине волны 495 нм;
0’280 - оптическая плотность 1 % раствора иммуноглобулина (для кроличьего равная 12,0);
50 - разведение препарата.
Молярное соотношение ФИТЦ/белок вычисляли по формуле:
2,86 х 0495 ФИТЦ/белок = 1п, где
0280 - ( 0,37х 0495)
0280 - оптическая плотность раствора при длине волны 280 нм;
0495 - оптическая плотность раствора при длине волны 495 нм;
0,37 и 2,86 - расчетные коэффициенты.
Флуоресцирующие конъюгаты должны обладать высокой специфичностью, т.е. взаимодействовать только с гомологичным антигеном и сообщать яркую флуоресценцию образующемуся комплексу. Для этого немаловажной задачей является качественная очистка флуоресцирующего конъюгата от несвязавшегося красителя. После окончания конъюгирования в реакционной смеси, кроме меченого белка, содержится значительное количество непрореагировавшего флуорохрома, флуоресцирующие примеси. Это низкомолекулярные вещества с молекулярной массой около 300 дальтон. По стандартной методике для их удаления применяется очистка на колонке с сефадексом 0-50. Полноту очистки от несвязавшегося флуорохрома определяли методом восходящей хроматографии на бумаге по стандартной методике. На хроматограмме получали одно яркое флуоресцирующее пятно, что свидетельствовало об отсутствии свободного флуорохрома.
Оценку результатов специфической активности и
специфичности конъюгатов определяли на фиксированных мазках гомологичных и гетерологичных штаммов прямым методом окраски препаратов. Полученные флуоресцирующие иммуноглобулины - кампилобакте-риозные, лептоспирозные разводили 1:2 0,9% раствором хлорида натрия рН 7,2 и титровали в этом же растворе двукратными разведениями до разведения 1:512. На фиксированные мазки наносили разведения иммуноглобулинов и инкубировали 15-20 мин. во влажной камере при температуре (22+4)0С. Затем промывали препараты в 0,9 % растворе хлорида натрия по 10 минут, подсушивали на воздухе. Готовые препараты исследовали, предварительно нанеся на них каплю нефлуоресцирующего масла. Микроскопию препаратов проводили в падающем отраженном свете в люминесцентном микроскопе серии «Люмам», используя соответствующие фильтры согласно инструкции по эксплуатации прибора. За положительный результат принимали яркую (4+, 3+) флуоресценцию периферии микробных клеток. При исследовании полученных флуоресцирующих иммуноглобулинов в реакции иммунофлуоресценции титр составил 1:16-1:128.
результаты. Всего было проанализировано по 5 серий иммуноглобулинов флуоресцирующих с концентрацией белка 0,9 - 1,1 % и молярным отношением Мф/Мб от 3,8 до 11,0. Установлено, что на степень связывания иммуноглобулинов с красителем влияют рН реакционной смеси и концентрация флуорохрома. Было отмечено, что после добавления красителя в первые минуты происходит снижение рН среды на 1,0 +0,2, затем на протяжении 25-30 минут продолжается дальнейшее снижение рН среды на 0,3-0,5. При этом степень конъюгации белка с ФИТЦ уменьшается прямо пропорционально снижению значения рН реакционной смеси, и значительная часть красителя не вступает в реакцию с белком. В связи с этим важен контроль показателей рН и проведение их корректировки в первые минуты после добавления ФИТЦ и через 30 минут после начала метки.
Наилучшие серии конъюгатов были получены в наших экспериментах при значении рН реакционной смеси 9,5, при использовании нагрузки ФИТЦ - 20 мг на 1 г белка, температуре 200С и 4-х часовом контакте белка с красителем. Оптимальной концентрацией белка полученных флуоресцирующих иммуноглобулинов является (10+1) мг/мл, молярное соотношение флуорохром/белок
- 3-5.
Активность вышеперечисленных препаратов испытывалась на нативных свежеприготовленных взвесях культур трёх-пяти гомологичных штаммов каждого вида возбудителя в пяти повторностях в концентрации 5х108 м.к/мл.
Установлено, что специфическая активность препаратов всех приготовленных серий характеризовалась красящим титром, равным разведению 1:32 - 1:128 при исследовании мазков гомологичных возбудителей, рабочее разведение препаратов - 1:16 - 1: 64.
При контроле специфичности установлено отсутствие специфической иммунофлуоресценции у всех гетерологичных микроорганизмов, взятых в опыт и окрашенных рабочим разведением флуоресцирующих им-муногло булинов.
Для определения чувствительности флуоресцирующих иммуноглобулинов использовали гомологичные штаммы в следующих концентрациях: 5х106; 1х106; 5х10 5; 2,5х105; 1х105; 5х104 м.к./мл. Установлено, что разведение испытанных серий препаратов давало воз-
можность обнаруживать микробы в мазках из чистых культур, приготовленных из 2,5х105 и более микробных клеток в 1 мл. С помощью всех серий удалось выявить (не во всех полях зрения) единичные бактерии в мазках, приготовленных из взвесей, содержащих 5х104 м. к./мл.
Оценка физико-химических свойств флуоресцирующих иммуноглобулинов (внешний вид, растворимость, прозрачность, цветность, рН, потеря в массе при высушивании, концентрация белка, количественное соотношение ФИТЦ/белок), активность и чувствительность показала их соответствие основным медико - биологическим требованиям, предъявляемым к подобным препаратам.
Заключение. Таким образом, нами отработаны оптимальные условия получения иммуноглобулинов флуоресцирующих: метод выделения иммуноглобулинов для метки ФИТЦ - осаждение каприловой кислотой, значение рН реакционной смеси 9,5, при использовании нагрузки ФИТЦ 20 мг на 1 г белка, температуре 200С, 4-х часовом контакте белка с красителем. В результате подбора оптимальных методов выделения иммуноглобулинов и условий их конъюгации получены экспериментальнопроизводственные серии иммуно-флуоресцирующих лептоспирозных, кампилобактериозных препаратов, характеризующиеся красящим титром 1:32-1:128 при исследовании мазков гомологичных возбудителей. Все полученные серии диагностикумов отвечали ОМБТ, предъявляемым к флуоресцирующим препаратам.
Данные кампилобактериозные препараты прошли апробацию в лабораторных и полевых условиях (в городах Пятигорске, Железноводске и Ессентуках). Лептоспирозные препараты были апробированы при исследовании материала в Красногвардейском районе Ставропольского края. Обследовались сточные воды и воды открытых водоемов на наличие в них возбудителей. Данные препараты зарекомендовали себя как высокоактивные, специфичные и экспрессные.
Список использованной литературы:
1. Алиева, Е.В. Кампилобактериоз. Лабораторная диагностика (Обзор литературы) / Е.В. Алиева. - Ставрополь, 2004. - 16 с.
- Деп. в ВИНИТИ 15.07.04, №1227- В2004.
2. Афанасьев, Е.Н. Научно-методические аспекты экспресс-диагностики возбудителей особо опасных зоонозных инфекций (чума, бруцеллез, сибирская язва): Автореф. дис. ... / Е.Н. Афанасьев. - Ставрополь, 2000.- 42 с.
3. Бинатова, В.В. Методы люминесцентной диагностики лептоспироза / В.В. Бинатова, И.С. Тюменцева, Е.Н. Афанасьев, В.И. Ефременко, Т.И. Егшатян // Проблемы развития биолог. и химии на Северном Кавказе.Матер.науч. конф.,посвящ. 70 летию биолого-химического факультета. - Ставрополь, 2001. - С.11-12.
4. Жарникова, И.В. Методологические подходы и разработка
биотехнологии иммунобиологических препаратов для диагностики инфекционных, особо опасных заболеваний и детекции их возбудителей: Автореф. дис. . / И.В. Жарникова.
- Ставрополь, 2004.- 39 с.
РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ ИММУНОГЛОБУЛИНОБ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ ДЛЯ ЕЫЯЕЛЕНИЯ 8ОЗБУДИТЕЛЕЙ КАМПИЛОБАКТЕРИОЗА, ЛЕПТОСПИРОЗА
и.В.ЖАРНикоВА, и.С.тюМЕНЦЕВА, Е.В.АлиЕВА,
а.в.таран, е.в.жданова, и.в юркина
В задачу настоящего исследования входило сравнительное изучение методов выделения иммуноглобулинов и подбор оптимальных условий конъюгации иммуноглобулинов, выделенных из гипериммунных кроличьих сывороток, с флуо-ресцеином изотиоцианатом, а также изучение физико-химических свойств, чувствительности, активности и специфичности конъюгатов. В результате подбора оптимальных методов выделения иммуноглобулинов и условий их конъюгации получены экспериментально-производственные серии иммунофлуоресцирующих лептоспирозных, кампилобактериозных препаратов.
ключевые слова: кампилобактериоз, лептоспироз, иммуноглобулины, флуоресцеин изотиационат.
УДК (579.834.115.+ 579.84):612.42.017.1-07
OBTAINING AND USE OF DIAGNOSTIC FLUORESCENT
IMMUNOGLOBULINS FOR CAMPILOBACTERIOSIS AND
LEPTOSPIROSIS PATHOGENIC AGENTS EXPOSURE
ZHARNiKoVA i.V., TuMENTsEVA i.s., ALiYEVA Y.V.,
taran a.v., zhdanova y.v., yurkina i.V.
At present studying of such infections as campilobacteriosis and leptospirosis attract attention of the specialists.
The aim of the study was to obtain and use high-quality fluorescent diagnostic preparations for the exposure of campilobacteriosis and leptospirosis pathogenic organisms. The purpose of our investigation included comparative study of immunoglobulin isolation methods and selection of optimal conditions for conjugation between immunoglobulins from rabbit hyperimmune serum and fluorescein isothiocianat, and also study of physicochemical characteristics, sensibility, activity and specificity of conjugates.
Results. Selection of optimal immunoglobulin isolation methods and conditions for conjugation made it possible to work out experimental industrial series of immunofluorescent leptospirosis and campylobacteriosis preparations.
Key words: campylobacteriosis, leptospirosis, immunoglobulins, fluorescein isothiocianat.
