CC BY
120
_МЕЖДУНАРОДНЫЙ НАУЧНЫЙ ЖУРНАЛ «СИМВОЛ НАУКИ» №2/2016 ISSN 2410-700Х_
УДК 576.61:616-078
Жарникова Ирина Викторовна
д-р. биол. наук, вед.н.с. научно-производственной лаборатории препаратов для диагностики особо опасных и других инфекций ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора, г.
Ставрополь, РФ E-mail: IVJ-biotech@yandex.ru Жарникова Татьяна Владимировна канд.биол. наук, с.н.с. лаборатории подготовки специалистов ФКУЗ Ставропольский противочумный
институт Роспотребнадзора, г. Ставрополь, РФ
Таран Татьяна Викторовна
д-р. мед. наук, зав. лабораторией подготовки специалистов ФКУЗ Ставропольский противочумный
институт Роспотребнадзора, г. Ставрополь, РФ
БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ РАЗРАБОТКИ ВЫСОКОАКТИВНЫХ И СПЕЦИФИЧНЫХ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ ДИАГНОСТИЧЕСКИХПУТЕМ ПРИМЕНЕНИЯ БИФУНКЦИОНАЛЬНОГО АФФИННОГО СОРБЕНТА
Аннотация
Проведена научная разработкабифункционального аффинного сорбента и апробация качественной одномоментной хроматографической очистки иммуноглобулинов флуоресцирующих от несвязавшегося красителя и гетерологичных антител, позволяющая получать высокоактивные, специфичные и стабильные иммунофлуоресцирующие препараты для диагностики возбудителей инфекционных болезней.
Ключевые слова
Хроматографическая очистка, аффинный сорбент, иммуноглобулины флуоресцирующие,
активность, специфичность, диагностика.
Для диагностических целей кроме бактериологических, молекулярно-генетических исследований применяют серологические методы. Среди которых широко используется реакция иммунофлуоресценции (РИФ) с чувствительностью 1х105-1х106 м.к./мл. РИФ проста в постановке, экспрессна и рекомендуется для ускоренного выявления возбудителей инфекций. Для получения высокоактивных, специфичных иммуноглобулинов флуоресцирующих, применяемых в РИФ, необходимо провести качественную очистку препаратов от несвязавшегося красителя - флуоресцеинизотиоцианата (ФИТЦ) и сорбцию гетерологичных антител.
Известны различные методы очистки иммуноглобулинов флуоресцирующих от несвязавшегося флуорохрома (чаще всего используют метод гельфильтрации с сефадексомG-50 [1, с. 24] и от гетерологичных антител (применяют корпускулярные антигены или сорбенты с иммобилизованными водорастворимыми гетерологичными антигенами). Но их применение имеет ряд недостатков. Сефадкс G-50 - дорогостоящий реактив импортного производства. Сорбция корпускулярными антигенами существенно понижает специфические титры антител. Используемые полиакриламидные сорбенты с иммобилизованнымиводорастворимыми антигенами из гетерологичных штаммов включают в своем составе высокотоксичные дорогостоящие импортные реактивы.
Цель работы - совершенствование хроматографической очистки иммуноглобулинов флуоресцирующих от несвязавшегося флуорохрома и гетерологичных антител.
Для конъюгации с ФИТЦ были использованы иммуноглобулины, выделенные каприловой кислотой [2, с. 279] с концентрацией белка 20-25 мг/мл. Конъюгацию иммуноглобулинов с ФИТЦ проводили вщелочной среде (рН 9,5) при перемешивании на магнитной мешалке по H. Storz[3, с.128-148].
Контроль активности и специфичности иммуноглобулинов флуоресцирующих туляремийных оценивали на гомологичных (F. tularensis 144/713; F. tularensis 15 НИИЭГ; F. tularensis Schu;
_МЕЖДУНАРОДНЫЙ НАУЧНЫЙ ЖУРНАЛ «СИМВОЛ НАУКИ» №2/2016 ISSN 2410-700Х_
F. tularensis 83 ery; F. tularensis325/1765) игетерологичных (B. abortus 19 ВА; B. abortus 544; B. melitensis16-M; B. suis1330; Y. enterocolitica 64,178,383; S. typhimurium 9640; E. coli 113-3) штаммах.
Иммуноглобулины флуоресцирующие должны обладать высокой специфичностью, т.е. взаимодействовать только с гомологичным антигеном и сообщать яркую флуоресценцию образующемуся комплексу. Для этого немаловажной задачей является качественная очистка флуоресцирующего конъюгата от несвязавшегося красителя.
Первоначально очистку препарата от несвязавшегося ФИТЦ проводили на колонке с помощью сефадекса G-50.Препараты характеризовались рабочим разведением - 1:32-1:128. При контроле специфичности иммуноглобулинов флуоресцирующих туляремийных установлено, что наблюдались перекрёстные реакции со штаммами B. abortus 544,B. abortus 19 -ВА.
В связи с этим, при получении аффинных сорбентов, в качестве лиганда использовали водорастворимые антигены, полученные из вышеперечисленных штаммов. В качестве сорбентов применяли: модифицированный смектин диоктаэдрический, магнитные органокремнеземные с различным количеством оксида железа; модифицированные алюмосиликатные; хитозановые; полифепановые.
Для оценки эффективности применения разработанных аффинных сорбентов проводили на них очистку иммуноглобулинов флуоресцирующих туляремийных от несвязавшегося ФИТЦ и гетерологичных антител. Наилучшие результаты получены с модифицированнымдиоктаэдрическим смектином и магнитным органокремнеземным сорбентом с минимальным количеством железа. Последний сорбент имел преимущества, так как отпадала необходимость применения центрифугирования, сокращались материальные и трудовые затраты.
Концентрацию белка определяли спектрофотометрически придлиневолн280 нм (спектр максимального поглощения белка)и 495 нм (спектр максимального поглощения ФИТЦ).
Полноту очистки от несвязавшегося флуорохрома проводили методом восходящей хроматографии на бумаге, получая одно яркое флуоресцирующее пятно, что свидетельствовало об отсутствии свободного флуорохрома.
Всего было проанализировано 5 серий иммуноглобулинов флуоресцирующих туляремийных, очищенных с помощью аффинного сорбента с магнитными свойствами, с концентрацией белка 1,1 - 1,2%и молярным отношением Мф/Мб (нагрузка красителя на белок) от 6,0 до 9,0.
Оценку результатов специфическойактивностииспецифичности иммуноглобулинов флуоресцирующих определяли на фиксированных мазках гомологичных и гетерологичных штаммов прямым методом окраски препаратов в люминесцентном микроскопе по A.H. Coons, M.H. Kaplan [4, с. 81].
Установлено, что специфическая активность препаратов, очистку которых проводили с помощью аффинных сорбентов, характеризовалась рабочим разведением 1:32-1:128, чувствительность - 5х105 и более микробных клеток в 1 мл.
В результате изучения специфичности испытываемых серий иммуноглобулинов флуоресцирующих туляремийных констатировано отсутствие специфической иммунофлуоресценции у всех гетерологичных штаммов микроорганизмов, взятых в опыт и окрашенных рабочим разведением препарата.
Оценка физико-химических свойств иммуноглобулинов флуоресцирующих, активности, специфичности и чувствительности показала их соответствие техническим условиям, предъявляемым к данным препаратам.
При сравнительном изучениив РИФ активности испецифичности иммуноглобулинов флуоресцирующих туляремийных, полученных традиционным (с помощью сефадекса G-50) и модифицированным методами, установлена сопоставимость полученныхрезультатов, а с учетом снижения временных, трудовых и материальных затрат - превосходство предложенного нами метода очистки иммуноглобулинов флуоресцирующих от несвязавшегося красителя и гетерологичных антител становится очевидным. Традиционный метод позволял только освободиться от несвязавшегося ФИТЦ, в связи с чем, для получения специфических препаратов необходимо было провести дополнительный этап сорбции гетерологичных антител.
В результате экспериментов были получены высокоактивные, специфичные иммуноглобулины
_МЕЖДУНАРОДНЫЙ НАУЧНЫЙ ЖУРНАЛ «СИМВОЛ НАУКИ» №2/2016 ISSN 2410-700Х_
флуоресцирующие туляремийные. Бифункциональность свойств сорбентов позволяла выполнять две задачи. Первая состояла в освобождении иммуноглобулинов флуоресцирующих от несвязавшегося красителя -ФИТЦ - в результатефизической сорбции последнего на сорбенте. Вторая задача включала очистку иммуноглобулинов флуоресцирующих от гетерологичных антител за счет аффинных взаимодействийпоследних, входящих в состав иммуноглобулинов и соответствующих антигенов, фиксированных на аффинном сорбенте. Отработанная при этом методика может быть использована как основа для получения высокоактивных, специфических иммуноглобулинов флуоресцирующих при выявлении возбудителей различных инфекций.
Таким образом, осуществлена научная разработкаи апробация качественной одномоментной хроматографической очистки иммуноглобулинов флуоресцирующих от несвязавшегося красителя и гетерологичных антител, позволяющая получать стабильные, специфичные и активные препараты с сокращением материальных и трудовых ресурсов. Список использованной литературы:
1. Ибрагимов А.Н., Бикмуллин А.Г., Сатаева Д.А., Лопухов Л.В., Зайнуллин Л.И., Алимова Ф.К. Хроматографические методы очистки белков. Учебно-методическое пособие. Казань: ФГАОУВПОКФУ, 2013. 48 с.
2. Steibuch G., Andran R. The isolation of IgG from imanalionserra with the acid of caprilic // Arch. Of Biochem. Stray and Biophys. 1969. V.139. P. 279-284.
3. Stortz H. (Шторц Х.) Иммунофлуоресценция // Иммунологические методы. М.: Медицина, 1987. С.128-148.
4. Coons A.H., Kaplan M.H. Localisation of antigen in tissue cells // J. Exp. Med. 1950. V.91, N 1. P.81-89.
© Жарникова И.В., Жарникова Т.В., Таран Т.В., 2016
УДК 661.183.1
Кальной Сергей Михайлович
доктор мед. наук, вед. н. с. ФКУЗ СтавПЧИ Роспотребнадзора, г. Ставрополь РФ
E-mail: SMKalnoi@yandex.ru Куникин Станислав Александрович канд. физ.- мат. наук, доцент СКФУ, г. Ставрополь РФ
E-mail: kunikin_s_a@rambler.ru Газиева Алина Юрьевна канд. биол. наук, ст. н. с. ФКУЗ СтавПЧИ Роспотребнадзора, г. Ставрополь РФ
E-mail: gazievy@mail.ru
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ И ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ МАГНОСОРБЕНТОВ ДЛЯ КОНСТРУИРОВАНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ
Аннотация
В работе показана оптимизация воспроизведения физико-химических и иммунобиологических параметров при конструировании диагностических препаратов за счет аттестации удельной намагниченности магносорбентов (МС).
Ключевые слова
Магносорбенты, физико-химические параметры, диагностические препараты Перспективными для конструирования диагностических препаратов являются твердофазные носители
