CC BY
373
Биохимия, биотехнология и диагностика
УДК 619:616.995.122.21:1-07
РАЗРАБОТКА ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ ДОТ-ИФА ПРИ ФАСЦИОЛЕЗЕ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
А.И. КОРОБОВ аспирант И.Г. ГЛАМАЗДИН доктор ветеринарных наук
Московский Государственный университет прикладной биотехнологии, 109316, Москва, ул. Талалихина, д. 33, e-mail: korobovartem@mail. ru
Разработана диагностическая тест-система на основе дот-ИФА при фасциолезе крупного рогатого скота для проведения исследований в полевых условиях. Отработана методика получения соматического антигена из полного водно-солевого экстракта фасциол с последующим истощением против антигенов личинок Cysticercus teanuicollis. Проведен сравнительный анализ диагностической эффективности ИФА и дот-ИФА при фасциолезе крупного рогатого скота. Установлена сопоставимость результатов по чувствительности и специфичности сравниваемых тестов. Специфичность ИФА и дот-ИФА составила 90 и 92 %, а чувствительность - 89 и 87 % соответственно.
Ключевые слова: Fasciola hepatica, диагностика, дот-ИФА, крупный рогатый скот.
Фасциолез крупного рогатого скота - биогельминтоз, характеризующийся, как правило, хроническим течением без проявления специфических симптомов с преимущественным поражением печени и желчевыводящих путей, распространен повсеместно на территории РФ. Однако степень его распространения и поражения животных неодназначна в различных природно-климатических зонах нашей страны. В отдельных регионах более 30 % поголовья скота заражены фасциолами. Фасциолезная инвазия наносит значительный экономический ущерб скотоводству России. Экономические потери при этом складываются из сокращения удоев молока, снижения его качества, уменьшения приростов и утилизации ценного пищевого продукта - печени.
Используемые в настоящее время в ветеринарной практике России методы исследования на фасциолез не позволяют объективно оценить эпизоотическую ситуацию. По данным Котельникова, копрологическими методами диагностики фасциолез можно выявлять только через 3-4 мес после начала инвазии или всего лишь у 40-50 % зараженных животных. К этому времени фасциолы уже выделяет продукты жизнедеятельности, которые приводят к возникновению хронических болезней печени, что не позволяет эффективно откармливать животных и ведет к снижению качества получаемой от них продукции. К тому же яйца паразитов повышают биологическую агрессивность окружающей среды. В то же время развитие научно-прикладных направлений молекулярной биологии позволяет создать эффективные диагностические тест-системы для ранней диагностики фасциолеза. Актуальность совершенствования методов диагностики обусловлена необходимостью создания биологической безопасности среды за счет своевременного выявления больных животных и разработки в связи с этим эффективных оздоровительно-профилактических мероприятий. В последнее время в отечественной литературе появился ряд публикаций о применении прижизненных иммуноло-
гических методов диагностики гельминтозов [1], в частности и фасциолеза [2, 3]. Нами была опробована возможность использования иммуноферментного анализа для диагностики фасциолеза крупного рогатого скота.
Целью нашей работы было разработать иммуноферментную тест-систему на основе дот-ИФА для прижизненной диагностики фасциолеза крупного рогатого скота и провести сравнительный анализ ее эффективности с ИФА на полистироловых планшетах.
Материалы и методы
Объектом исследования служила коллекция из 411 проб сывороток крупного рогатого скота, включающая:
• 150 проб сывороток крови от крупного рогатого скота, спонтанно зараженного Fasciola hepatica;
• 200 проб сывороток крови от крупного рогатого скота, при ветсан-экспертизе продуктов убоя которого не обнаружено никаких гельминтов;
• 24 пробы сыворотки крови от крупного рогатого скота, спонтанно зараженного Echinococcus granulosus;
• 26 проб сывороток крови от крупного рогатого скота, спонтанно зараженного Dicrocoelium lanceatunr,
• 11 проб сывороток крови от крупного рогатого скота, спонтанно зараженного Cysticercus teanuicollis.
Отбор сывороток крови проводили на ОАО «Коломенский опытный мясокомбинат» во время убоя крупного рогатого скота с обязательной последующей ветеринарно-санитарной экспертизой внутренних органов. Была собрана коллекция из 47 проб сыворотки крови от коров с интенсивностью инвазии свыше 50 фасциол в печени, 61 проба сыворотки крови от животных с интенсивностью от 3 до 10 особей в печени и 42 пробы сыворотки крови от крупного рогатого скота со средней степенью инвазии - от 10 до 50.
В качестве антигена использовали полный водно-солевой экстракт фас-циол различного возраста, который впоследствии был истощен против общих антигенов с цистицерками и эхинококками с помощью аффинной хроматографии. Водно-солевой экстракт очищали с помощью антител, полученных к экстракту С. teanuicollis. В качестве конъюгатов использовали антитела быка к IgG и IgM, меченные пероксидазой хрена.
Постановку иммуноферментной реакции проводили в непрямом варианте с целью выявления антител в сыворотке крови животных. Параметры и режим постановки ИФР с соматическим антигеном из полного водно-солевого экстракта фасциол отрабатывали в предварительных экспериментах на сыворотках крупного рогатого скота с гомологичной, гетерологичной инвазией и отрицательным контролем. Твердой фазой служили полистироловые планшеты. Учет результатов реакции вели с помощью полуавтоматического имму-ноферментного микропланшетного анализатора.
Постановку дот-ИФА также осуществляли в непрямом варианте для выявления антител в сыворотке крови крупного рогатого скота [5, 6]. Оптимальные параметры и режим постановки дот-ИФА c соматическим антигеном из полного водно-солевого экстракта фасциол отрабатывали в предварительных экспериментах на той же коллекции сывороток, что и в ELISA на пластиковых планшетах. В качестве твердой фазы использовали нитроцеллю-лозные мембраны с диаметром пор 0,22 мкм. Все манипуляции с мембранами проводили с помощью анатомического пинцета.
Реакцию оценивали визуально по интенсивности окрашивания точек-дотов в сравнении с контрольными сыворотками. Результат считали отрицательным, если на месте нанесения сыворотки пятно не проявлялось или появлялось фоновое светло-бежевое окрашивание. Результат считали положительным, если на месте нанесения сыворотки появлялось коричневое пятно с
четким контуром, по интенсивности окраски сопоставимое со слабоположительным контролем.
Шкала оценки:
• « +++ » - сильноположительная реакция - темно-коричневое пятно;
• « ++ » - положительная реакция - коричневое пятно;
• « + » - слабоположительная реакция - светло-коричневое пятно;
• « - » - отрицательная реакция - пятно не проявляется.
Результаты серологических исследований сопоставляли с данными после-
убойной экспертизы.
Результаты и обсуждение
При учете результатов ИФА сыворотку считали положительной, если им-муноферментный анализатор присваивал ей коэффициент оптической плотности выше 0,2; соответственно, если ниже - то отрицательной. Определение чувствительности ИФА проводили на основании сопоставления результатов реакции и данных послеубойной ветеринарно-санитарной экспертизы печени (табл. 1).
1. Чувствительность ИФА при исследовании проб сывороток крови крупного _рогатого скота с различной степенью инвазии F. hepatica_
Интенсивность фасциолезной инвазии, фасци-ол в печени Исследовано проб сывороток крови Число положительных реакций с экстрактом из F. hepatica Чувствительность, %
Слабая (от 3 до 10) 61 50 82
Средняя (от 10 до 50) 42 38 90
Сильная (свыше 50) 47 46 98
Итого: 150 134 89
Из 47 проб сывороток крови от животных с интенсивностью инвазии более 50 фасциол в печени 46 реагировали с диагностическим препаратом в титрах 1 : 100-200. Из 61 пробы сыворотки крови от крупного рогатого скота с интенсивностью инвазии от 3 до 10 фасциол 50 реагировали в титре 1 : 100, а из 42 пробы сывороток крови с интенсивностью инвазии от 10 до 50 фасциол - 38 в титре 1 : 100-150. Наличие 16 ложноотрицательных реакций можно объяснить невысокими показателями интенсивности инвазии, снижением иммунореактивности организма при хроническом течении болезни, нейтрализацией специфическими иммуноглобулинами циркулирующих растворимых и корпускулярных антигенов. Чувствительность составила в среднем 89 % и зависела от степени интенсивности инвазии.
Специфичность диагностического препарата изучали в ИФА с использованием положительной сыворотки крупного рогатого скота к D. lanceatum с рабочим титром 1 : 100; положительной сыворотки крови крупного рогатого скота к E. granulosus c рабочим титром 1 : 100; положительной сыворотки крови к C. teanuicollis, а также отрицательной - на фасциолез, дикроцелиоз, тонкошейный цистицеркоз и эхинококкоз (табл. 2).
2. Специфичность ИФА при исследовании проб сывороток крови крупного _рогатого скота, зараженного разными гельминтами_
Болезнь Исследовано Число ложноположи- Специфичность,
животных тельных реакций с экстрактом из Г. Ивра-Иеа %
Дикроцелиоз 26 4 85
Эхинококкоз 24 2 92
Цистицеркоз тонкошейный 11 0 100
Здоровые животные (контроль) 200 21 90
Итого: 261 27 90
Исследования на специфичность показали, что из 26 проб сывороток крови от дикроцелиозных животных 4 реагировали с диагностическим препаратом из водно-солевого экстракта фасциол сомнительно (коэффициент экс-тинкции 0,3-0,4). С сыворотками крови от эхинококкозных животных также выявлено 2 перекрестные реакции. При оценке отрицательного контроля с негативной сывороткой крови крупного рогатого скота на фасциолез, дикро-целиоз, тонкошейный цистицеркоз и эхинококкоз было выявлено 21 ложно-положительная реакция. Полученные ложноположительные результаты в пробах сыворотки крови от животных, в печени которых при послеубойной экспертизе не обнаружены половозрелые трематоды, можно объяснить проведенной дегельминтизацией, длительной сенсибилизацией тканей организма метаболитами фасциол. Не исключено наличие общих антигенных детерминант у гельминтов разных видов, а также возможное присутствие в паренхиме печени мигрирующих юных форм фасциол, резистентных к некоторым анти-гельминтикам. Таким образом, специфичность составила 90 %.
Для оценки диагностической эффективности тестов на основе дот-ИФА исходили из шкалы визуальной оценки реакции, указанной выше. Испытания проводили на той коллекции проб сывороток крови, что и при ИФА. Как видно из таблицы 3, чувствительность при испытании дот-ИФА была сопоставима с таковой при ИФА, зависела от степени интенсивности инвазии и составила в среднем 87 %.
3. Чувствительность дот-ИФА при исследовании проб сывороток крови
крупного рогатого скота с различной степенью инвазии
Интенсивность фасциолезной инвазии (фасци-ол в печени) Исследовано проб сыворотки крови Число положительных реакций с экстрактом из Г. ИвраНеа Чувствительность, %
Слабая (от 3 до 10) 61 18 + 30 ++ Всего: 48 79
Средняя (от 10 до 50) 42 21 ++ 16 +++ Всего: 37 88
Сильная (свыше 50) 47 34 +++ 12 ++ Всего: 46 96
Итого: 150 131 87
Наименьшая чувствительность (79 %) установлена при слабой степени инвазии - из 61 пробы сыворотки крови 18 реагировали на 1 крест и 30 - на 2. Гораздо выше регистрировали чувствительность и интенсивность проявления реакции при средней степени инвазии, максимума эти показатели достигали при сильной степени инвазии.
При изучении специфичности отмечали перекрестные реакции в пределах 11 %, которые оценивались, как правило, в 1 крест. Однако в целом она оказалась на уровне 92 % - несколько выше, чем в ИФА.
Таким образом, результаты наших исследований свидетельствуют о равноценной диагностической эффективности дот-ИФА и классической имму-ноферментной реакции на пластике. Дот-ИФА для выявления антител в крови к возбудителю фасциолеза имеет высокий уровень соответствия специфичности и чувствительности. К тому же дот-ИФА обладает рядом преимуществ в сравнении с ИФА. Проведение анализа занимает меньше времени и не требует дорогого оборудования. Простота в применении и экономичность данного теста делают его более удобным для диагностики фасциолеза в полевых условиях.
Литература
1. Написанова Л.А. Диагностическая эффективность иммуноферментных тест-систем (ИФР и дот-ИФА) при трихинеллезе свиней: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. - М., 2004. - 24 с.
2. Онуфриенко М.Е. Диагностика фасциолеза крупного рогатого скота // Ветеринария. - 2003.- № 3.- С. 30-33.
3. Якубовский М.В., Лысенко А.П., Трус И.А. Разработка ИФА тест-системы для диагностики фасциолеза крупного рогатого скота // Матер. меж-дунар. науч.-практ. конф. «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов». - Щелково, 2007. - С. 381-385.
4. Maisonnave J. Standardization of a dot immunoperoxidase assay for field diagnosis of Fasciola hepatica infected cattle // Vet. Parasitol. - 1999. - V. 85, № 2. - P.259-268.
5. Pappas M. G. Recent applications of dot-ELISA in Immunoparasitology // Vet. Parasitl. - 1988. - V. 29, № 1. - P. 105-129.
6. Zimmerman G.L., Nelson M.J., Clark C.R.B. Diagnosis of ovine fascioliasis by a dot enzyme-linked immunosorbent assay: a rapid microdiagnostic technique // Amer. J. Vet. Res. - 1985. - V. 46, № 7. - P. 1513-1515.
Elaboration of diagnostic test-system on the basis of dot enzyme-linked immu-nosorbent assay (dot-ELISA) at cattle fasciolosis
A.I. Korobov, I.G. Glamazdin
One elaborated diagnostic test-system on the basis of dot-ELISA at cattle fas-ciolosis for investigating in field conditions. It had been worked out the method of obtaining somatic antigen from full water-saline extract of Fasciola hepatica with following purifying against antigens of Cysticercus teanuicollis larvae. One conducted comparative analysis of diagnostic efficiency of ELISA and dot-ELISA at cattle fasciolosis. Comparability of the results on sensitivity and specificity of compared tests is established. The specificity of ELISA and dot-ELISA was 90 and 92 % as while sensitivity - 89 and 87 % respectively.
Кеуwords: Fasciola hepatica, diagnosis, dot-ELISA, cattle.
