CC BY
139
кислотность - окисляемость, степени обескровливания, реакциям с сернокислой медью и на активность фермента пероксидазы) мясо свиней, больных лучевой болезнью, осложненной болезнью Ауески, соответствует требованиям ГОСТ 7269-79 к свежему мясу. Однако использование его на пищу рекомендуется после термической обработки в соответствии с Правилами ветеринарного осмотра убойных животных и ветеринарносанитарной экспертизы мяса и мясных продуктов.
VETERINARY -SANITARY ESTIMATION OF PORK,INFECTED BY SWINE FEVER ON THE BACKGROUND OF IMMUNIZATION AND IONIZATION
Yusupova G.R., Volkov A.Kh., Konyukhov G.V., Yusupov R.Kh.,
Shigapova G.Z.
Summary
According to bacterial infecting investigation results, biochemical and physicochemical indices ( to aminoammonical nitrogen of volatile fatty acids, pH, acidity-oxidability coefficient, bleeding rate, reactions with cupric sulphate and for peroxidase enzyme activity) pork affected by radiation sickness, complicated with Aujeszky disease corresponds to the State Standard-7269-79 demands to fresh meat. However its usage as food is recommended only after thermal treating according to veterinary regulations of slaughtered animals investigation and veterinary-sanitary meat and meat produce expertise.
УДК 619:616.98:579.873.21:636.22.28
ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВЛКРС МЕТОДОМ ДОТ-БЛОТ ИММУНОАНАЛИЗА
Якупов Т.Р. - д.в.н, доцент; *Хаертынов К.С. - к.б.н., с.н.с. **Нурутдинова А.Г. -
зав.отделом диагностики лейкоза Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э.Баумана *ГБОУ ДПО Казанская государственная медицинская академия **Республиканская ветеринарная лаборатория, г.Казань тел.: (843) 273-97-05
Ключевые слова: лейкоз крупного рогатого скота, ВЛКРС, антитела, дот-блот иммуноанализ, ИФА, нитроцеллюлозная мембрана.
Keywords: leucosis of cattle, BLV, antibodies, dot-immunoassay, ELISA, nitrocellulose membrane.
Последнее десятилетие стало периодом интенсивного развития и
внедрения в широкую ветеринарную практику иммуноферментных тест-систем и наборов, предназначенных для иммунодиагностики инфекционных болезней животных. Их явные преимущества заключаются не только в высокой чувствительности и специфичности, но и в простоте применения и учета результатов, что существенно расширяет возможности их использования для проведения не только массовых, но и индивидуальных исследований. Дальнейшее развитие данной технологии направлено на расширение спектра анализируемых серологически значимых лигандов, а также на разработку экспресс тест-систем, позволяющих с высокой чувствительностью и специфичностью выявлять минимальные количества исследуемых иммунных комплексов без больших экономических затрат и за минимально короткий промежуток времени.
Наиболее перспективными в иммуноанализе являются экспресс тесты, разработанные на основе иммунохроматографии и модифицированные методы ИФА в дот-блот варианте (дот-иммуноанализ).
Цель настоящей работы заключалась в изучении возможностей «антигена вируса лейкоза для ветеринарного применения» производства ФГУП «Курская биофабрика» в дот-иммуноанализе и в подборе условий иммобилизации антигена на нитроцеллюлозный носитель для изготовления экспериментальной партии диагностического теста по выявлению антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС).
Материалы и методы. В работе использовались положительные и отрицательные контрольные сыворотки коммерческих наборов по определению антител к ВЛКРС методом ИФА, сыворотки крови крупного рогатого скота с неблагополучного по лейкозу хозяйства РТ; полоски нитроцеллюлозной мембраны (НЦМ); антиген вируса лейкоза для ветеринарного применения производства ФГУП «Курская биофабрика»; буферные растворы и реактивы для постановки ИФА.
Дот-иммуноанализ основан на иммунохимической реакции антиген -антитело. Исследуемые образцы биологических жидкостей наносят на твердый носитель в виде матрицы микроточек. Образовавшийся комплекс выявляют с помощью антивидового конъюгата после добавления нерастворимого субстрата, образующего окрашенные пятна различной интенсивности в местах связывания антигена и антитела.
Результаты исследований и обсуждение. Методика постановки дот-блот иммуноанализа является общеизвестной и описывается, применительно для диагностики отдельных инфекций, в работах многих авторов (1, 2, 4). При разработке дот-блот тест-систем для выявления антител основной проблемой является качество применяемого антигена: специфичность, степень чистоты (отсутствия клеточного дебриса, дающего ложные результаты), гомогенность и химическая природа.
Антиген вируса лейкоза для ветеринарного применения производства ФГУП «Курская биофабрика» - лиофилизированная гомогенная аморфная масса светло-коричневого цвета с красноватым оттенком. При добавлении разбавителя полностью растворяется и представляет собой опалесцирующую жидкость темно-красного цвета (3) Для постановки дот-иммуноанализа можно использовать различные твердофазные пористые носители. Носители на основе нитроцеллюлозы считаются наиболее удобными за счет высоких сорбционных свойств для белков (иммобилон) и простоты обращения с ними (4). На полосках нитроцеллюлозной мембраны шириною около 5 мм отметили карандашом положение образцов в виде точек на расстоянии не менее 5мм друг от друга. Антиген ВЛКРС из набора для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота использовали в двух вариантах. Во-первых, после подготовки согласно инструкции производителя и, во-вторых, после обработки специальными методами, направленными на повышение его чистоты и специфичности. Антиген наносили на НЦМ в объеме 10мкл, свободные после сорбции антигена места на мембране блокировали 0,1% раствором человеческого сывороточного альбумина с 0,05% детергентом твин-20, содержащим 50мМ триса (рН 7.2-7.3). Адсорбцию антигена проводили в течение 1-го, 2-х часов при +400С и в течение ночи при комнатной температуре. В качестве контрольных сывороток использовали положительные и отрицательные контроли коммерческого набора для выявления антител к ВЛКРС методом ИФА. Сыворотки наносили в объеме 10 мкл. Для визуализации образовавшихся иммунных комплексов в субстратном растворе использовали диаминобензидин (ДАБ). Учет результатов производили визуально по появлению или отсутствию коричневых пятен на точках нанесения образцов (рис.1).
Рис.1. Визуализация результатов дот-блот иммуноанализа.
По результатам исследований установили, что антиген ВЛКРС из набора для РИД исследований без дополнительной обработки не пригоден для дот-иммуноанализа. На полосках НЦМ проявлялись только едва заметные окрашенные пятна, по которым невозможно судить о характере иммунной реакции. Во втором варианте тест-системы, т.е. при использовании антигена после специальной обработки на НЦМ в точках
нанесения положительной контрольной сыворотки развивались отчетливые окрашенные пятна, позволяющие визуально оценивать результаты реакции. Наибольшую чувствительность тест-системы отмечали при 2-х часовой адсорбции антигена.
Экспериментальную диагностическую тест-систему апробировали для выявления антител к ВЛКРС в пробах сывороток крови коров из неблагополучных по лейкозу хозяйств. Всего исследовали 12 проб. В качестве сравнительного теста использовали ИФА в классическом исполнении. 5 проб сыворотки крови - №№ 1, 3, 4, 6 и 9 были положительно реагирующими.
Результаты ИФА и дот-иммуноанализа в целом совпали, кроме пробы №4, которая в дот-блоте была отрицательной. Однако, нужно отметить, что и в ИФА данная проба сыворотки обладала низким коэффициентом специфичности - около 17, т.е. титры специфических антител не высокие.
Заключение. Проведенные исследования показали, что тест система для выявления антител к ВЛКРС по принципу дот-блот иммуноанализа вполне пригодна для скрининговых исследований на лейкоз крупного рогатого скота. Она обладает меньшей чувствительностью, чем ИФА, однако гораздо проще и дешевле при постановке, не требует специального оборудования. Одним набором можно исследовать до 100 до 500 проб (в зависимости от комплектации).
ЛИТЕРАТУРА: 1. Владыко А.С. Разработка и апробация
диагностической тест-системы для выявления антител к ВИЧ методом дот-иммуноанализа/ А.С.Владыко, Т.В.Школина, Л.Е.Сурикова и др.//Рубрики:76.03.41, 76.35.33. Сроки выполнения НИР:1996-1998; 2. Аронова Н.В. Использование препаратов липополисахарида БгасівеПа ТиІагешІБ в точечном твердофазном иммуноферментном анализе/ Н.В.Аронова, Н.В.Павлович, Н.Л.Пичурина и др.// Ростов-на-Дону. Патент 2362170 от 20.07.2009; 3. Инструкция по применению набора для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота; 4. Таранин А.В. Способ выявления антител к вирусу алеутской болезни норок/ А.В.Таранин, С.М.Мирошниченко, В.В.Перемыслов// Патент. № 2074393 от 27.02.1997;
ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВЛКРС МЕТОДОМ ДОТ-БЛОТ
ИММУНОАНАЛИЗА
Якупов Т.Р., Хаертынов К.С., Нурутдинова А.Г.
Резюме
Показана возможность использования дот-блот ИФА тест-системы, с применением антигена ВЛКРС для серологических реакций, для диагностики лейкоза крупного рогатого скота.
TEST SYSTEM FOR DETECTION OF FNTIBODIES TO BLV BY DOT-BLOT
IMMUNOASSAY
Yakupov TR, Haertinov KS, Nurutdinova AG Summary
The possibility a dot-blots ELISA test systems for diagnostics of bovine leukemia is described.
