CC BY
55
БИОХИМИЧЕСКОЕ ПРОИЗВОДСТВО
УДК 663.1:547.42
Профессор О.С. Корнеева, доцент Г.П. Шуваева, доцент Т.В. Свиридова, аспирант 3. Рафид (Воронеж, гос. ун-т инж. технол.) кафедра биохимии и биотехнологии, тел. (473)255-55-57
Разработка биотехнологий гликозидаз и исследование их физико-химических свойств с делью применения в отраслях пищевой и перерабатывающей промышленности
Разработаны условия получения ферментных препаратов гликозидаз разной степени очистки и изучены их физико-химические свойства. Подобраны условия максимальной деструкции маннанов, инулина, ксилана, сахарозы.
Conditions of receiving fermental preparations glikozidaz different extent of cleaning are developed and their physical and chemical properties are studied. Conditions of the maximum destruction mannanov, inulin, a xylan, sucrose are picked up.
Ключевые слова: ферментные препараты, безопасные продукты, гликозидаза.
Цель исследований - разработка микробного синтеза гликозидаз, изучение их физико-химических свойств и структуры с целью создания качественных, экологически безопасных продуктов питания функционального назначения, а также легкоусвояемых кормов с иммунокорректирующим действием.
Авторами разработаны и защищены патентами РФ [1,2,7,8] продуценты ряда ферментов гидролитического действия, в том числе амилаз, инвертаз, инулиназ. Целесообразность использования разработанных ферментных препаратов в пищевой и перерабатывающей промышленности, кормопроизводстве доказана промышленными апробациями и подтверждена актами производственных испытаний (рисунок).
Основными объектами исследований служили культуры микроорганизмов различных таксономических групп: микромицетов Aspergillus awamori, Rhizopus var microsporus BKMF-595, Rhizopus orisae var tritici tj, Trichoderma harsianum и дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВГШ-2 и Kluyveromyces marxianus. Оптимальные условия их культивирования, обеспечивающие наивысшую активность целевых ферментов, разработаны с использованием методов математического планирования эксперимента (табл. 1).
(£)Корнеева О.С., Шуваева Г.П., Свиридова Т.В., Рафид 3., 2014
Рисунок. Схема методологии и этапов работы
Таблица 1
Условия культивирования продуцентов
Продуцент Синтезируемый фермент Температура, °С pH Время выращивания, ч Способ культивирования
А. аи>атоп Инулиназа 25 5,0-5,5 120 Поверхностный
і?, тісгозрогиз Ксиланаза 32-34 6,0-6,2 46-48 Поверхностный
32-36 6,0-6,2 70-72 Глубинный
і?, співає ігііісі Глюкоамилаза 34-36 5,0-6,0 36-42 Поверхностный
Т. Нагвіапит (5-Маннаназа 28-32 5,5-6,5 36-48 Глубинный
Б. сєгєиізіає Инулиназа 28-32 5,0-6,0 36-38 Глубинный
К. тагхіапив Инвертаза 25-30 6,4-6,6 46-48 Глубинный
Гликозидазы - наиболее широко используемые ферменты с непрерывно расширяющимся спектром применения. Расшифровка механизмов ферментативного катализа с их участием имеет как прикладное, так и сугубо фундаментальное значение. Известно, например, что при определенных условиях некоторые гликозидазы способны осуществлять синтез различных олигосахаридов. Однако до настоящего времени точно не установлена структура активного центра ряда гликозидаз, особенности кинетики ферментативных реакций, в том числе термо и рН-стабильности, знание которых открывает перспективу многообразного применения ферментов, в том числе создания конкурентоспособной продукции (табл. 2, 3).
Таблица 2
Физико-химические свойства гликозидаз
Наименование показателя Инулиназа Ксиланаза і?. тісгозрогиз Инвертаза К. тапаапив Р-Маннаназа Т. Наггіапит
А. аіиатогі сєгєиізіає
Активность, ед/мг белка 75 93 1340 10032 15,6
pH оптимум действия 4,0 4,0 4,6 4,0 4,5
^ , °С 60 60 46 50 60
pH стабильность 3,0-5,0 3,0-5,0 5,0-6,0 4,0-5,0 4,0-5,0
Т ермостабильность, °С 30-50 30-50 30-50 30-50 50-70
Таблица 3
Получение углеводсодержащих гидролизатов
Фермент продуцент Субстрат, массовая доля (%) Параметры деструкции углеводов Целевой продукт
Дози- ровка, ед/г суб- страта Продолжи-тель-ность, ч pH 1, °С Степень гидролиза, %
Инвертаза К. тагхіапив Сахароза, 80 10 3-4 4,0 50 80 Инвертные сиропы
Инулиназа А. аи>атоп Пюре из топинамбура, 16 6 24 4,2 55 97,4 Глюкозо-фруктозные сиропы. Фруктоза
Инулиназа сегеїлвіае Инулин, 20 10 3,0-3,5 4,6 45 80 Функциональные продукты, напитки
Ксиланаза Е. тісгозротз Ксилан, 6 10 48-54 6,0 50 48 Биомодифицирован-ный корм
Маннаназа Т. Наггіапит 9 3 7,0 35 85 Биомасса пробиотических культур
Предпосылкой для создания нанобиотехнологий с использованием гликозидаз стало открытие методов, позволяющих работать с отдельными структурными элементами биоматериалов, а также более глубокое понимание принципов самоорганизации этих материалов.
Исследованы изменения в клеточной стенке зерна и химические изменения в молекулах некрахмальных полисахаридов (НПС) под действием ксиланазы, выделенной из культуры микромицета И. тюгоэрогиз [3], а также химические изменения в молекуле крахмала, обработанного глюкоамилазой микромицета И. опэае иаг ЫИсг Ь. Разработаны условия применения ферментных препаратов с целью улучшения питательных качеств фуражного зерна для комбикорма.
Отмечено изменение структуры НПС, сопровождающееся разрывом связей в полисахаридной цепи, что ведёт к её укорачиванию, потере гелеобразующих свойств, и, как следствие, улучшению переваривания и усвоения крахмала и белков у моногастричных животных.
Установлено, что эффект изменения структуры НПС подобен результату, который получают при влаготепловой обработке с достаточно жесткими режимами гидротермического воздействия на зерно. Внедрение новой технологии позволит значительно сократить расходы на производство комбикорма, улучшив при этом его качество.
Исследовано влияние маннозосодержащих ферментолизатов [9], в составе питательной среды при культивировании промышленных заквасок из молочнокислых бактерий (МКБ) на скорость роста культур, интенсивность анаболических процессов в клетках.
Отмечено, что более интенсивное накопление количества молочной кислоты, соответствующее изменению pH в эксперименте, наблюдается на среде с глюкозой, что, в принципе, не противоречит катаболитной регуляции метаболизма. Глюкоза является наиболее легкоусвояемым углеводом. Однако накопление биомассы (табл. 4) более интенсивно происходит на среде с гидролизатом, содержащим в качестве единственного источника углерода маннозу. Возможно, что исследуемые углеводы с различной интенсивностью вовлекаются в катаболические и анаболические процессы в клетке. Тем не менее, установлено, что замена глюкозы в питательной среде для выращивания молочнокислых бактерий гидролизатом, содержащим маннозу, интенсифицирует накопление биомассы.
Таблица 4
Влияние состава питательной среды на рост молочнокислых бактерий
Состав среды Накопление биомассы, КОЕ /см3
Streptococcus thermo- Lactobacillus paracasei phylus подвид paracasei
Время культивирования, ч
12 24 36 12 24 36
Контроль 1,3х103 6,8х103 5,7x10б 1,7х103 0,7х104 7,1х10б
Среда с маннозой 1,3х103 3,5х104 4,0x108 1,7х103 2,9х104 5,2х108
Таким образом, из вышесказанного можно сделать следующие выводы:
- изучены особенности синтеза гликозидаз продуцентами различных таксономических групп;
- отмечены различия в закономерностях роста и развития продуцентов;
- выявлены общие механизмы в регуляции биосинтеза целевых ферментов;
- разработаны общие подходы и выявлены специфические особенности получения ферментов разной степени очистки;
- проведена сравнительная оценка параметров катализируемых реакций;
- выявлено значительное сходство в структуре между разными ферментами с близкой функцией;
- разработаны биотехнологии с использованием целевых ферментов в различных отраслях промышленности.
ЛИТЕРАТУРА
1. А.с. № 737456 Штамм Йпгориз 1:гШс1 I 1- продуцент глюкоамилазы/ А.Я. Панкратов, Г.П. Шуваева, В.С. Григоров, В.В. Щёголев, 1977.
2. Дрожжи ЭассЬаготусез сегеу1з1ае ВПП-2 для бродильных производств/ Г.П. Шуваева, Е.Л. Гарманова, О.Ю. Мальцева. Патент на изобретение № 2147034
3. Шуваева, Г.П. Ксиланаза микромицета Ийгориз уаг ппсгозрогиз 595: препаративное получение, структурно-функциональные свойства, применение [Текст] /Г.П. Шуваева, М.Г. Сысоева // Прикладная биохимия и микробиология.- 2010. Уо1 / 46.- № 6.- рр. 693-699.
4. Инулиназа дрожжей 8.сегеу1з1ае ВГШ- 2 Препаративное получение и некоторые физико-химические свойства [Текст] / Г.П. Шуваева, О.С. Корнеева, Т.Р. Рутковская // Фундаментальные исследования.- 2010.- № 10.-С. 17-25.
5. Исследование физико-химических свойств инулиназы дрожжей 8.сегеу1з1ае ВГШ-2/ Г.П. Шуваева, О.С. Корнеева, Т.Р. Рутковская // Вопросы современной науки и практики -2010, вып. 11, Т. 31 - № 10-12, -С. 60-64.
6. (З-Маннаназы различного происхождения: получение, характеристика и перспективы практического применения [Текст] / Д.А. Черенков, О.С. Корнеева, Е.П. Анохина, Е. Г. Новоселова, А.С. Глущенко, А.А. Слепокуров, И.В. Черемушкина // Успехи современной биологии. - 2010. - Т. 130. - № 2.- С. 18-23.
7. Ии 2289628 / Способ производства фруктозо-глюкозного сиропа» Корнеева
О.С., Магомедов Г.О., Мальцева Т.В., Фурсова Т.И. опубл. 20.12.2006, Бюл. № 35.
8. Ии 2281330. Способ производства этилового спирта из инулинсодержащего сырья Вагабов М.-З., Корнеева О.С., Керимова З.А., Мангуева З.М., Мальцева Т.В. опубл. 10.08.2006, Бюл. № 22.
9. Шуваев, П.В. Использование углеводных гидролизатов для получения биомассы молочнокислых бактерий (МКБ) [Текст] / П.В. Шуваев, О.С. Корнеева, Е.А. Мо-тина / / Перспективные ферментные препараты и биотехнологические процессы в технологиях продуктов питания и кормов: сб. научных трудов.- М., 2014.-С.248-251.
REFERENCES
1. Ampere-second. № 737456 Rhizopus Tritici T 1-Strain producer glyukoamilazy / A.Ya. Pankratov, G.P. Shuvayeva, V.S. Grigorov, V.V. Shchyogolev, 1977.
2. Saccharomyces cerevisiae VGSh-2 yeast for fermentative productions/G.P. Shuvayeva, E.L. Garmanov, O.Yu. Maltsev, the patent for the invention № 2147034
3. Shuvayeva, G.P. Ksilanaz of Rhizopus var microsporus 595 micromycete: prepara-
tivny receiving, structurally functional properties, application/G.P. Shuvayeva, M.G. Sysoyeva / / Applied biochemistry and microbiology, Vol. / 46, № 6,
pp. 693-699, 2010.
4. Inulinaza of S.cerevisiae VGSh-yeast 2 Preparativnoye receiving and some physical and chemical properties / G.P. Shuvayeva, O.S. Korneeva, T.R. Rutkovskaya // Basic researches, 2010. - № 10. - p. 17-25.
5. Research of physical and chemical properties инулиназы S. cerevisiae VGSh-2 / G.P. Shuvayeva, O.S. Korneeva, T.R. Rutkovskaya // Questions of modern science and practice-2010, вып. 11, T. 31 - № 10-12. - P. 60-64.
6. (3-Mannaza various origin: receiving, characteristic and prospects of practical application of [Text] / A. Cherenkov, O.S. Korneeva, E.P. Anokhina, E.G. Novoselova, A.S. Glushchenko, A.A. Slepokurov, I.V. Cheremushkina // Achievements of modern biology. - 2010 . - T. 130. - № 2.
7. RU 2289628 / Way of production of fruktozo-glucosic syrup" Korneeva O.S., Magomedov G.O., Maltseva T.V. FursovaT.I. it is published 20.12.2006 Bulletin № 35.
8. Ru 2281330. Way of production of ethyl alcohol from inulinsoderzhashchy raw materials Vagabov M.-Z., Korneeva O.S., Kerimov Z.A., Manguyeva Z.M., Maltseva T.V.-it is published 10.08.2006, Bulletin № 22.
9. Shuvayev, P.V. Use of carbohydrate hydrolyzates for receiving biomass of lactic bacteria (MKB) of the [Text] / P.V. Shuvayev, O.S. Korneeva, E.A. Motina / / Perspective fermental preparations and biotechnological processes in technologies of food and forages: book scientific works. - M, 2014. P. 248-251 .
