CC BY
250
БИОХИМИЧЕСКОЕ ПРОИЗВОДСТВО
УДК 577.150
Доцент И.В. Черемушкина,
(Воронеж, гос. ун-т ннж. технол.) кафедра теории экономики, товароведения и торговли, тел. (473)255-63-47 профессор О.С. Корнеева
(Воронеж, гос. ун-т инж. технол.) кафедра биохимии и биотехнологии, тел. (473)255-55-57
Пребиотический препарат на основе природного растительного сырья
Приведены результаты исследования пребиотической активности маннозосодержащего препарата на средах с различными источниками углеводов. В опытах in vivo выявлена способность препарата к восстановлению состава и численности индигенной микрофлоры мышей в условиях экспериментального дисбиоза.
In the article the results of research prebiotic activity manosos-containing drug in environments with multiple sources of carbohydrates. In experiments in vivo revealed the ability of the drug to the restoration of the composition and numbers of the indigenous microflora mice in conditions of experimental dysbiosis.
Ключевые слова: манноза, маннозосодержащий препарат,
/?-маннаназа, пребиотическое действие.
На формирование иммунного ответа организма существенное влияние оказывает нормофлора желудочно-кишечного тракта. Одним из путей ее поддержания является использование пребиотиков. Вещества, обладающие пребиотической активностью, будучи неферментируемыми углеводами в неизмененном виде легко достигают толстой кишки, где избирательно становятся промоутерами нормофлоры микробного пула. Существует доказательство того, что пребиотики могут модулировать различные свойства иммунной системы, включая свойства лимфоидной ткани.
На сегодняшний день, по данным института питания РАМН, 90 % населения имеют те или иные проявления дисбактериоза, поэтому, безусловно, актуальным является поиск и исследование веществ, проявляющих пребиотическую активность и участвующих в восстановлении нормофлоры организма[1].
Самые распространенные бифидогенные факторы - моносахариды и олигосахариды, которые являются источником энергии для микроорганизмов. К таким веществам относится манноза.
Цель работы - исследование пребиотических свойств маннозосодержащего препарата в опытах in vitro и in vivo.
Растительное сырье имеет сложное строение и химический состав, в большей своей части состоит из клеточных стенок. В последние годы полисахариды сложных лигнифицированных клеточных стенок растений, среди которых преобладают гемицеллюлоза и целлюлоза, рассматривают как потенциальный источник моно- и олигосахаридов, в которые они могут быть превращены при действии гемицеллю-лаз. Одними из таких полисахаридов являются маннаны, основная цепь которых состоит из остатков D-маннозы.
<£>Черемушкина И.В., Корнеева О.С., 2014
Маннаны найдены в семенах шести ботанических семейств, в камедях и слизях, содержание их в древесине некоторых пород составляет от 10 до 25 %, в пшеничных и ржаных отрубях - от 20 до 25 %.
Использование маннанов ограничено из-за трудности их выделения и разложения на компоненты, которые могут усваиваться живыми организмами в качестве источника энергии или проявлять другие полезные свойства.
Структурный элемент маннана - манноза - эпимер глюкозы, обладает ростовыми, иммуностимулирующими, радиопротекторными свойствами и гиполипиде-мическим действием. Перспективным является получение маннозосодержащих препаратов ферментативным путем под действием фермента jS-маннаназы [2].
Фермент jS-маннаназа относится к классу 0-гликозид-гидролаз - главной группе ферментов, участвующих в деградации растительных полисахаридов [3].
Спектр микроорганизмов, из которых были выделены jS-маннаназы, довольно обширен. jS-Маннаназы широко распространены в различных типах организмов: бактериях, грибах, высших растениях.
С целью гидролиза маннанов использовали ферментный препарат продуцируемый микромицетом Trichoderma harzianum FI 14.
Для подтверждения пребиотических свойств маннозы осуществляли культивирование бактерий Bifidobacterium bifidum in vitro на средах с различными источниками углевода. Контролем служила среда без внесения углевода. Подсчет клеток бифидобактерий проводили на фиксированных окрашенных мазках по методу Виноградского-Шульгиной-Брига [8].
Опыты проводили в 3-кратной биологической повторности.
Изучение влияния маннозосодержащего препарата на коррекцию экспериментального дисбиоза проводили при определенной раннее оптимальной концентрации
0,02 % к массе тела животного [9].
В результате совместных исследований для культивирования продуцента разработана энергоэффективная технология с применением пароэжекторного теплового насоса [4, 5]. Эксергетический КПД процесса равен 24,02 %, что говорит о повышении степени термодинамического совершенства системы при использовании контуров рециркуляции [7].
Для дальнейшей работы использовали ферментный препарат с активностью целевого фермента 8050 ед/г и представляющий композицию таких ферментов, как целлюлаза, ксиланаза, jS-глюконаза, протеаза, продуцируемых генетически немодифицированной грибной культурой.
В качестве сырья для выделения маннанов использовали пшеничные и ржаные отруби, которые являются отходом зерноперерабатывающей промышленности. Их выбор был обусловлен низкой стоимостью местного широкодоступного растительного сырья и возможностью получения при необходимости, совместно или раздельно галактоглюкоманнанов и глюкоманнанов (рис. 2) [6].
Гидролиз маннанов проводили при оптимальных условиях действия фермента, что позволило достичь степени их гидролиза 95,0-97,0 % [2].
Дальнейшая работа была посвящена изучению пребиотической активности полученного маннозосодержащего препарата.
Данные по динамике роста В. bifidum на различных углеводах показали, что микроорганизмы способны к росту на всех испытанных средах. Максимальное накопление биомассы наблюдалось к 48 ч процесса культивирования бактерий. Однако внесение того или иного углевода оказывало различное влияние на скорость и интенсивность роста бифидобактерий. Наилучшее влияние обеспечивали такие углеводы, как манноза, маннозосодержащий препарат и глюкоза. Так, к 24 ч культивирования микроорганизмов плотность культуры на среде с маннозосодержащим
препаратом была более чем в 3 раза больше по сравнению с контролем (среда без углевода) (рис. 1).
Интенсивность метаболических процессов у бифидобактерий контролировали по изменению pH среды, что служит показателем трансформации сахаров в органические кислоты как конечные продукты метаболизма.
СЮ
и N к »•
Рис. 1. Определение биомассы В. Ы[гс1ит на различных углеводных средах (24 ч): 1 - контроль; 2 - инулин; 3 - маннозосодержащий препарат; 4 - манноза; 5 - глюкоза; б - фруктоза; ОБ - показатель оптической плотности
Рис. 2. Схема выделения маннанов из пшеничных и ржаных отрубей
Анализ полученных результатов свидетельствует о том, что культивирование бифидобактерий В. Ьі/ійит на среде с маннозосодержащим препаратом способствует увеличению скорости и интенсивности их роста, что подтверждает его пребиотические свойства и, как следствие, позволяет использовать данный препарат в рационе питания для поддержания нормобиоценоза кишечника.
С целью дальнейшего изучения иребиотической активности маннозосодержа-щего препарата были проведены исследования на лабораторных животных.
В опытах in vivo выявлена бифидогенная и лактогенная активность препарата. Применение его в условиях экспериментального дисбиоза приводило к увеличению количества бифидобактерий и стимулировало рост молочнокислых бактерий. Изменение количества наиболее важных представителей микрофлоры животных определялось через 5, 10 и 15 дней после начала введения препарата (рис. 3).
Дни исследования материала
Рис. 3. Динамика изменения количества микроорганизмов при введении в рацион маннозо-содержащего препарата в дозе 0,02 % к массе тела опытного животного
Результаты по коррекции экспериментального дисбиоза свидетельствуют о том, что маннозосодержащий препарат способствует восстановлению состава и численности индигенной кишечной микрофлоры мышей, проявляя тем самым пребиотическую активность.
Проведенные медико-биологические исследования иммунного статуса опытных животных, при введении в их рацион маннозосодержащего препарата, выявили тенденцию положительного влияния его на показатели неспецифического иммунитета опытных животных. Пероральное введение препарата оказывало стимулирующее действие на функциональную активность макрофагов, усиливая поглотительную и переваривающую способность клеток. Установлено достоверное повышение активности нейтрофилов при экпериментальном дисбиозе относительно интактных животных, а также способность маннозосодержащего препарата индуцировать экспрессию про- и противовоспалительных цитокинов.
Таким образом, можно сделать следующие выводы:
- показана способность маннозосодержащего препарата проявлять пребиотическую активность в условиях in vito;
- результаты по коррекции экспериментального дисбиоза с помощью маннозосодержащего препарата свидетельствуют о его способности восстанавливать состав и численность индигенной кишечной микрофлоры опытных животных, проявляя тем самым пребиотическую активность;
- проведенные медико-биологические исследования иммунного статуса опытных животных, при введении в их рацион маннозосодержащего препарата, могут быть положены в основу разработки способа иммунокоррекции живого организма.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бабин, В.Н. Молекулярные взаимосвязи между макроорганизмом и его микрофлорой в норме и патологии [Текст] / В.Н. Бабин.- М., 2003.
2. Черемушкина, И.В. Биотехнология маннозосодержащих гидролизатов и исследование пребиотических свойств маннозы [Текст] / И.В. Черемушкина, A.C. Глущенко, Е.П. Анохина, H.A. Чигирина, Д.А. Черенков, A.A. Слепокуров,
О.С. Корнеева, А.Н. Михайлова // Биотехнология. - 2010. - № 5 - С. 56-61.
3. Черенков, Д.А. jS-Маннаназы различного происхождения: получение, характеристика и перспективы практического применения [Текст] / Д-А. Черенков, О.С. Корнеева, Е.П. Анохина, Е.Г. Новоселова, А.С. Глущенко, А.А. Слепокуров, И.В. Черемушкина // Успехи современной биологии. - 2010.- № 2. С. 190-199.
4. Патент № 2484129. Способ производства биомассы аэробных микроорганизмов [Текст] / Корнеева О.С., Шевцов А.А., Черемушкина И.В.,
Мажулина И.В.,Черенков Д.А.
5. Патент № 2495122. Способ получения порошкообразных ферментных препаратов [Текст] / Шевцов А.А., Черемушкина И.В., Ключников А.И., Острикова Е.А., Шатунова Н.В.
6. Патент РФ № 2392332. Способ получения маннанов из растительного сырья [Текст] / Корнеева О.С., Глущенко А.С., Черемушкина И.В., Черенков Д.А., Слепокуров А.А.
7. Черемушкина, И.В Эксергетический анализ инновационной технологии культивирования микробных продуцентов ферментов [Текст] / И.В. Черемушкина., О.С. Корнеева, А.А. Шевцов, И.В. Мажулина // Вестник ВГУИТ. - 2013. - № 4.
- С. 168-177.
8. Практикум по микробиологии [Текст] : учебное пособие / под ред. проф.
Н.С. Егорова. - М. : Изд-во Моск. ун-та, 1976. - С. 275-281.
9. Патент № 2437663. Способ коррекции микрофлоры кишечника [Текст]
/ Корнеева О.С., Глущенко А.С., Черемушкина И.В., Слепокуров А.А., Михайлова Н.А.
REFERENCES
1. Babin V.N. Interrelated molecular link between microorganism and its microflora swarm in health and disease . Moscow, 2003 .
2. Cheremushkina I.V. Biotechnology mannozosoderzhaschih hydrolysates and study of prebiotic properties of mannose [Text] / I.V. Cheremushkina , A.S.Glushchenko , E.P. Anohina , N.A. Chigirina, D.A. Cherenkov , A.A. Slepokurov , O.S. Korneeva , A.N. Mikhailova // Biotechnology. - 2010 . - № 5 - p. 56-61 .
3 . Cherenkov D.A. [3- mannanase different th origin : preparation, characterization and practical perspective [ Text ] / D.A. Cherenkov , O.S. Korneeva, E.P.Anohina , E.G. Novoselov , A.S. Glushchenko , A.A. Slepokurov , I.V. Cheremushkina // Advances in modern biology . - 2010 . Number 2 . Pp. 190-199 .
4. Patent number 2484129 . The method production of biomass aerobic microorganisms [Text] / O.S. Korneeva, A.A. Shevtsov, I.V. Cheremushkina, I.V.Mazhulina, D.A. Cherenkov.
5. Patent number 2495122. A method for producing powdered enzyme preparations [Text] / A.A. Shevtsov, I.V. Cheremushkina, A.I. Kluchnikov, E.A.Ostrikova, N.V. Shatunova.
6. Patent number 2392332. The method of obtaining mannans from plant material [Text] / O.S. Korneeva, A.S. Glushchenko, I.V. Cheremushkina, D.A.Cherenkov, A.A .Slepokurov.
7. Cheremushkina, I.V. Exergy analysis of innovative cultivation of microbial producers of enzymes [Text] / I.V. Cheremushkina, O.S. Korneeva, A.A.Shevtsov, I.V. Ma-zhulina / / Herald VGUIT .- 2013 .- № 4 .- S. 168-177 .
8. Workshop on Microbiology: Textbook -ing manual / [ed. prof. N.S. Egorova ].
- Moscow : Publishing House of Moscow. University Press, 1976 .- S. 275-281.
9. Patent number 2437663 . The method of correcting the intestinal microflora [Text] / O.S. Korneeva, A.S. Gluschenko, I.V. Cheremushkina, A.A. Slepokurov, N.A. Mikhailova.
