CC BY
4
УДК 577.18.08:637.5.04/.07 DOI: 10.21323/2071-2499-2019-3-36-39 Табл. 1. Ил. 5. Библ. 10.
расширение
возможности использования мультискринингового микробиологического метода для определения химиотерапевтических препаратов в мясе
Батаева Д.С.1, канд. техн. наук, Зайко Е.В.1, Юшина Ю.К.1, канд. техн. наук, Горбунов В.Н.2
1 ФНЦ пищевых систем им. В.М. Горбатова
2 ООО «Биотест-Пущино»
Ключевые слова: ГОСТ, мясо, антибиотик, МДУ, G. stearothermophilus Реферат
Чрезмерное применение антибиотиков при выращивании сельскохозяйственных животных имеет серьёзные риски для здоровья человека, а также отражается на качестве и безопасности мясной продукции, изготовленной с использованием стартовых культур. Для эффективного контроля содержания антибиотиков в мясе необходимы мультискрининговые методы, которые позволят определить одновременно большинство используемых групп антимикробных химиотерапевтических препаратов. Одним из них является микробиологический метод, представленный в ГОСТ Р 55481-2013. Целью нашей работы являлась оценка возможности применения метода для выявления расширенного перечня антибиотиков в концентрациях максимально допустимого уровня, установленных в Техническом регламенте Таможенного союза (ТР ТС) 034. На основании полученных нами результатов установлена эффективность для выявления 35 антибиотиков из 14 групп, 22 из которых выявляются на максимально допустимых уровнях, установленных для мяса. Метод не требует высокой квалификации персонала, крупных материальных затрат и может быть реализован в любой производственной лаборатории.
ExPANsioN oF the PossiBiLiTY a MULTi-SCREENiNG MiCRobioLoGiCaL method DETERMiNATiON oF CHEMoTHErAPEuTiC drugs iN meat
Bataeva D.S.1, Zaiko E.V.1, Yushina Yu.K.1, Gorbunov V.N.2
1 Gorbatov Research Center for Food Systems
2 LLC «Biotest-Pushchino»
Key words: GOST, meat, antibiotic, MRL,
G. stearothermophilus
Summary
Excessive using of antibiotics in the growing of farm animals has serious risks to human health, and also affects the quality and safety of meat products manufactured using starter cultures. For effectively control their presence in meat, multi-screening methods are required, which will allow to determine at the same time the majority of groups of antimicrobial chemotherapy drug. One of them is the microbiological method presented in GOST R55481-2013. The aim of our work was to assess the possibility of using the method to identify an expanded list of antibiotics in the concentrations of the maximum permissible level established in the Technical regulations of the customs Union (CU TR) 034. On the basis of our results, we have established the effectiveness for the detection of 35 antibiotics from 14 groups, 22 of which are detected at the maximum permissible level for meat. The method does not require highly qualified personnel, large material costs and can be implemented in any production laboratory.
Введение
Максимально допустимые уровни остатков лекарственных средств, в том числе антибиотиков, в продуктах убоя животных отражены в Техническом регламенте Таможенного союза 034/2013 [1]. В другом Техническом регламенте Таможенного союза 021/2011 к не переработанному продовольственному (пищевому) сырью животного происхождения предъявляется требование к способу получения сырья, оно должно быть получено от продуктивных животных, которые не подвергались воздействию антибиотиков и других лекарственных средств ветеринарного назначения, а если и подвергались, то убой после истечения срока их выведения из организмов животных [2]. При несоблюдении этого требования оно может содержать остаточные количества антимикробных препаратов [3].
Использование лекарственных средств в ветеринарии - неотъемлемая часть интенсивного животноводства.
Первоначально ветеринарные антибиотики использовались только для лечения болезней животных, но постепенно их начали использовать в качестве добавок к кормам для профилактики распространения различных заболеваний [4].
Кроме того, для стимуляции роста интенсивно применяются кормовые ан-
тибиотики. Согласно данным Росстата, каждый год увеличивается производство кормовых антибиотиков, так, более ста тонн продукции было произведено в 2017 году.
Чрезмерное применение антибиотиков у сельскохозяйственных животных имеет серьёзные риски для здоровья человека, так как способствует появлению устойчивых к антибиотикам бактерий и, как следствие, генов резистентности, которые могут быть переданы людям [5].
Особую опасность представляет использование мяса с антибиотикоре-зистентными штаммами бактерий при производстве мясных продуктов, не предполагающих высокотемпературную обработку, например, таких, как сырокопчёные мясные изделия, т.к. некоторые устойчивые бактерии горизонтальным переносом передают другим бактериям, не имеющих генов устойчивости [3].
Для предотвращения контаминации мясной продукции антибиотиками контроль должен осуществляться на всех технологических этапах - от получения мясного сырья (входной контроль каждой партии) до готовой продукции. Контроль за антимикробными лекарственными веществами в мясе и продуктах убоя про-
водится в соответствии с информацией об их использовании, предоставляемой изготовителем или поставщиком при ввозе на территорию Таможенного союза или при поставке продуктов убоя на переработку. При этом, согласно ТР ТС 021, в обязательном порядке исследуют мясо и субпродукты только на наличие лево-мицетина (хлорамфеникола), антибиотиков тетрациклиновой группы и бацитра-цина. Согласно Приложению 5 ТР ТС 034, максимально допустимые уровни определены для 51 антибиотика.
Более того, с 14 августа 2018 года вступило в силу Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 13.02.2018 № 28, содержащее Перечень ветеринарных лекарственных средств и фармакологически активных веществ, максимально допустимые уровни (МДУ) остатков которых могут содержаться в непереработанной пищевой продукции животного происхождения, в том числе в сырье. 72 ветеринарных препарата, наиболее часто используемых на территории стран Таможенного союза, включены в данный список с рекомендуемыми методиками исследований их остаточных количеств.
Контроль за антимикробными лекарственными средствами не обязывает переработчика осуществлять производ-
ственный контроль на наличие всех вышеперечисленных ветеринарных лекарственных средств. Получая информацию от поставщика сырья животного происхождения о применявшихся антибиотиках, переработчик может проверить поступающее сырьё на наличие остатков именно этих антибиотиков.
Ответственность за соблюдение соответствующих требований по применению антибиотиков в сельском хозяйстве полностью возлагается на производителя мяса. Понятно, что такая система контроля нуждается в усовершенствовании и изменении как самого порядка исследований, так и методов контроля.
Анализ методов контроля антимикробных химиотерапевтических веществ в различных пищевых системах демонстрирует мононаправленность их применения [6]. Применение физико-химических методов в силу дороговизны анализа, которая складывается из стоимости оборудования, расходных материалов, а также необходимости наличия высококвалифицированного специалиста, возможно в ограниченном количестве лабораторий, в числе которых редко встречаются производственные [7, 8]. Поэтому эти методы трудно реализуются в условиях производственных лабораторий мясоперерабатывающих предприятий. Для производственного контроля более эффективными являются методы, позволяющие провести скрининговые определения наличия антибиотиков, т.е. уникальный мультискрининговый метод контроля, который даёт возможность определить в образце одновременно все используемые группы антимикробных химиоте-рапевтических препаратов.
Один из них представлен в ГОСТ Р 55481-2013, область применения которого распространяется только на мясо и субпродукты, в т.ч. птицы [9]. Качественный метод определения остаточных количеств антибиотиков, отражённый в этом документе, позволяет через 6 часов получить результаты без использования специального дорогостоящего оборудования. Предложенный метод не требует высокой квалификации персонала и может быть реализован в любой производственной лаборатории. При этом стоимость расходных материалов на один анализ невелика.
Целью данной работы является оценка разработанного нами в 2013 году ГОСТ Р 55481 и успешно используемого в лабораторной практике метода на возможность расширения перечня выявляемых антибиотиков, согласно Приложению 5 ТР ТС 034.
Материалы и методы
В работе использовали:
□ стандартные образцы антибиотиков (Sigma, Германия). Приготовление стоковых растворов проводили согласно инструкции производителя. Из стоковых растворов готовили рабочие растворы, соответствующие по концентрации максимально допустимому уровню антибиотиков в мясе, согласно ТР ТС 034 (таблица 1), а также растворы, концентрации которых превышают МДУ. При приготовлении стоковых и рабочих концентраций антибиотиков использовали разбавители: воду, 1 M раствор NaOH и N, N-диметилфор-мамид (DMF).
□ тест-набор (Биотест-Пущино, Россия), в состав которого входит плотная питательная среда с индикатором бром-крезоловый пурпурный и суспензией спор Geobacillus stearothermophilus, во флаконах по 10 мл, а также пробочное сверло.
Содержимое флакона растапливают на водяной бане, затем охлаждают в условиях комнатной температуры, сразу разливают в чашки Петри и дают агару затвердеть. С помощью пробочного сверла в затвердевшей среде вырезают лунки. Допускается на одной чашке Петри вырезать от 2-х до 7-и лунок. С наружной части чашки Петри контур лунки обводят тонким маркером. Раствор антибиотика вносят параллельно в 2 лунки с помощью дозатора переменного объёма по 0,05 см3. Затем чашки Петри с исследуемым материалом выдерживают при комнатной температуре не менее 30 мин для диффузии надосадочной жидкости в агар. Инкубируют чашки в термостате (Binder, Германия) при температуре (65±1)°C не менее 4 ч крышками вверх до изменения цвета среды с синего на жёлтый.
Ингибирование роста тест-культуры в зоне шириной > 2,0 мм оценивали как положительный результат, т.е. как наличие антибиотиков или других антимикробных химиотерапевтических веществ в анализируемой пробе.
Наличие роста тест-культуры с изменением цвета питательной среды с синего на жёлтый или отсутствие роста тест-культуры в зоне шириной менее 2,0 мм оценивали как отрицательный результат, т.е. как отсутствие антибиотиков или других антимикробных химиотерапевтических веществ в анализируемой пробе.
Результаты исследования
Было исследовано 35 различных антибиотиков, внесённых в Приложение 5 ТР ТС 034 и вошедших в Решение № 28
Таблица 1 Нормируемые антибиотики
Группа Наименование Концентрация (МДУ по ТР ТС 034), мг/кг
Аминогликозиды Гентамицин 0,05
Канамицин 0,1
Неомицин 0,5
Паромомицин 0,5
Стрептомицин 0,5
Спектиномицин 0,5
Пенициллины Амоксициллин 0,05
Ампициллин 0,05
Бензилпенициллин 0,05
Диклоксациллин 0,3
Клоксациллин 0,3
Нафциллин 0,3
Оксациллин 0,3
Тетрациклиновая Доксициклин 0,1
группа Окситетрациклин 0,1
Тетрациклин 0,1
Хлортетрациклин 0,1
Цефалоспорины Цефалексин 0,2
Цефапирин 0,05
Цефкином 0,05
Хинолоны Данофлоксацин 0,2
Марбофлоксацин 0,15
Ципрофлоксацин 0,1
Флорфениколы Флорфеникол 0,2 Линкозамиды Макролиды
Плевромутилины Тиамулин 0,1
Вальнемулин 0,05
Амфениколы Тиамфеникол 0,05
Полимиксины Колистин 0,15
Производные диаминопирими- дина Триметоприм 0,05
Нитрофураны Фуразолидон 0,1
Полипептиды Бацитрацин 0,15
Коллегии Евразийской экономической комиссии от 13.02.2018.
На рисунках 1, 2, 3, 4, 5 отражены результаты исследования.
Из протестированных антибиотиков 22 проявили ингибирующую способность по отношению к тест-микроорганизму ОвоЬасШив stearothermophilus в концентрациях максимально допустимого уровня, установленного для мяса. Они представлены цефалоспоринами, антибиотиками тетрациклиновой группой, пенициллиновой группой, а также
Линкомицин 0,1
Спирамицин 0,2
Тилозин 0,1
Тилмикозин 0,05
аминогликозидами, нитрофуранами и линкозамидами (рисунки 1, 2).
Те антибиотики, которые не проявили ингибирующую способность в концентрациях максимально допустимого уровня, были исследованы в концентрациях, превышающих МДУ. Результаты представлены на рисунках 3, 4, 5.
Результаты исследований по 8 антибиотикам, представленным на рисунках 3, 4, 5, демонстрируют, что чувствительность данного метода исследования находится выше МДУ, указанного в ТР ТС 034. Это не ограничивает возможности метода по их выявлению, что и было доказано при исследовании более высоких концентраций антибиотиков на этих 6-и группах антибиотиков.
Для антибиотиков тиамулина, коли-стина, спирамицина и флорфеникола, при получении отрицательных результатов для концентраций, указанных в таблице 1, проводились исследования других, более высоких концентраций, установленных на уровне 10,0; 15,0 и 20,0 мг/кг соответственно. Данные уровни антибиотиков проявили антибактериальный эффект в агаре на тест-микроорганизмах.
Таким образом, предлагаемым нами методом можно выявить в мясе и в субпродуктах убойных животных, в т.ч. птицы, 14 групп антибиотиков одновременно. При этом не требуется специального оборудования, а также высококвалифицированного персонала для его применения. Максимальная продолжительность исследования может занимать не более 6 час.
Все эти преимущества позволяют внедрить метод в широкую лабораторную практику для испытания большого количества образцов мяса. Установив факт наличия антибиотиков в мясе, можно проводить последующую идентификацию и количественное определение антибиотиков с помощью специальных хроматографических методов. В мире практикуется использование микробиологических тестов, основанных на таком же принципе действия, как и использованный нами метод. Подобные методы показали свою эффективность при качественном определении антибиотиков в мясе и молоке.
Авторы планируют доработать микробиологический метод для возможности классифицировать антибиотики на группы перед последующим хромато-графическим анализом. Разработаны микробиологические тесты, например, для молока, позволяющие определять группы выявленных антибиотиков, в частности, беталактамов, хинолонов,
Рисунок 1. Результаты исследования антибиотиков групп аминогликозидов, тетрациклиновой и пенициллиновой группы
Хлортетрациклин Тетрациклин Окситетрациклин Доксициклин
ю з н
X
<
Оксациллин Нафциллин Клоксациллин Диклоксациллин Бензилпенициллин Ампициллин Амоксициллин
Спектиномицин Стрептомицин Паромомицин Неомицин Канамицин Гентамицин
0,6
0,05 0,1
0,2 0,3 0,4 Концентрация антибиотиков, мг/кг
0,5
0,6
Рисунок 2. Результаты исследования антибиотиков групп цефалоспоринов, нитрофуранов и линкозамидов
Линкомицин
Фуразолидон
Цефкином
Цефапирин
Цефалексин
0,05 0,1 0,15
Концентрация антибиотиков, мг/кг
0,2
0,2
0
0
Рисунок 3. Результаты исследования антибиотиков группы хинолонов
ПМДУ антибиотиков в мясе для группы хинолонов по ТР ТС 034
и Результаты исследования антибиотиков в концентрациях выше МДУ
Данофлоксацин Марбофлоксацин Ципрофлоксацин
Рисунок 4. Результаты исследования антибиотиков группы макролидов
МДУ антибиотиков в мясе для группы макролидов по ТР ТС 034
Результаты исследования антибиотиков в концентрациях выше МДУ
Тилозин
Тилмикозин
сульфамидов и тетрациклинов. Но это требует использование нескольких ми-кроор ганизмов (в. stearothermмphilus, В. ceлeus, В. subtilis), питательных сред и индикаторов. Чувствительность метода, например, для амоксициллина при использовании в. stearothermophilusс с 2-я разными питательными средами составляет 0,007 и 0,Вш мг/л соответственно. Максимально допустимый уровень этогиюнтибиотика в молоке шЯ ставляет 0,004 мг/л, что ниже чувствительности метода [10]. Сравнение МДУ амоксициллина для мяса (0,05 мг/кг) и молока (0,004 мг/л) позволяет указать на существенно различающуюся чувствительность данного метода для разных видов продуктов. При дальнейшем усовершенствовании метода перспективным направлением представляется увеличение его чувствительности до МДУ для некоторых антибиотиков.
Выводы
Возможности качественного микробиологического метода согласно ГОСТ Р 55481-2013 были обоснованы полученными результатами исследования 35 антибиотиков из 14 групп. Результаты были получены в течение 6 часов без использования специального дорогостоящего оборудования. Предложенный метод не требует высокой квалификации персонала и может быть реализован в любой производственной лаборатории. При этом стоимость расходных материалов на один анализ невелика.
Необходимость мультискрининговых методов очевидна и отражена в требованиях ТР ТС.
© КОНТАКТЫ:
Батаева Дагмара Султановна а d.bataeva@fncps.ru Зайко Елена Викторовна а e.zaiko@fncps.ru
Юшина Юлия Константиновна а yu.yushina@fncps.ru Горбунов Валерий Николаевич а biotermal@gmail.com
Рисунок 5. Результаты исследования антибиотиков групп плевромутилинов, амфениколов, полимиксиновы, производных диаминопиримидинов и полипептидов
О МДУ антибиотиков в мясе по ТР ТС 034
И Результаты исследования антибиотиков в концентрациях выше МДУ
i -&■
5 ЩЧ
«Sl
список ЛИТЕРАТУРЫ:
1. Технический Регламент Таможенного союза ТР ТС 034/2013 «О безопасности мяса и мясной продукции». Утверждён Решением Совета Евразийской экономической комиссии от 09.10.2013 № 68.
2. Технический Регламент Таможенного союза ТР ТС 021/2011 «О безопасности пищевой продукции». Утверждён Решением Комиссии Таможенного союза от 09.12.2011 № 880.
3. Зайко, Е.В. Идентификация рисков, связанных с сырьём животного происхождения / Е.В. Зайко, Д.С. Батаева // Теория и практика переработки мяса. - 2018. - № 3 (4). - С. 23-31.
4. Gelband, H. The state of the world's antibiotics / H. Gelband, P. Molly Miller, S. Pant, S. Gandra, J. Levinson, D. Barter, A. White, R. Laxminarayan // Wound Heal. South. Afr. -2015. - № 8. - P. 30-34.
5. Bacanli, M. Importance of antibiotic residues in animal food / M. Bacanli, B. Nur§en // Food and Chemical Toxicology. № 125. - P. 413-421.
6. Юрчак, З.А. Методы выявления антимикробных препаратов в мясе / З.А. Юрчак, Д.С. Батаева // Все о мясе. -2017. - № 3. - С. 6-10.
REFERENCES:
Tekhnicheskiy Reglament Tamozhennogo soyuza TR TS034/2013 «O bezopasnosti myasa i myasnoy produktsii» [Technical Regulations of the Customs Union TR TS034/2013 «On safety of meat and meat products»]. Utverzhdon Resheniyem Soveta Yevraziys-koy ekonomicheskoy komissii ot 09.10.2013 № 68.
Tekhnicheskiy Reglament Tamozhennogo soyuza TR TS021/2011 «O bezopasnosti pishchevoy produktsii» [Technical Regulations of the Customs Union TR TS034/2011 « On safety of food products »]. Utverzhdon Resheniyem Komissii Tamozhennogo soyuza ot 09.12.2011 № 880.
Zayko, Ye.V. Identifikatsiya riskov, svyazannykh s sy^yem zhivot-nogo proiskhozhdeniya [Identification of risks associated with raw materials of animal origin] / Ye.V. Zayko, D.S. Batayeva // Teoriya i praktika pererabotki myasa. - 2018. - № 3 (4). - P. 23-31.
Gelband, H. The state of the world's antibiotics / H. Gelband, P. Molly Miller, S. Pant, S. Gandra, J. Levinson, D. Barter, A. White, R. Laxminarayan // Wound Heal. South. Afr. - 2015. -№ 8. - P. 30-34.
2019. -
Yurchak, Z.A. Metody vyyavleniya antimikrobnykh preparatov v myase [Methodological base of identification antimicrobic medicines in meat] / Z.A. Yurchak, D.S. Batayeva // Vsyo o myase. - 2017. - № 3. - P. 6-10.
Belyakova, Z.Yu. Kontrol' antibiotikov v myasnom sy^ye [Control of antibiotics in raw meat] / Z.Yu. Belyakova // Myasnyye tekh-nologii. - 2018. - № 12 (192). - P. 17-19.
Oganesyants, L.A. Monitoring kachestva pishchevykh produk-tov - bazovyy element strategii [Food quality monitoring - a basic element of the strategy] / L.A. Oganesyants, S.A. Khur-shudyan, A.G. Galstyan // Kontrol' kachestva produktsii. -2018. - № 4. - P. 56-59.
GOST R55481-2013 «Myaso i myasnyye produkty. Kachestvennyy metod opredeleniya ostatochnykh kolichestv antibiotikov i drugikh antimikrobnykh khimioterapevticheskikh veshchestv» [«Meat and meat products. Qualitative Method for detection of antibiotics residues and other antimicrobial chemotherapeutic agents»].
Nagel, O. Microbiological system in microtitre plates for detection and classification of antibiotic residues in milk / O. Nagel, M. Pilar, R. Althaus // International Dairy Journal. - 2013. - № 2. - P. 150-155.
Белякова, З.Ю. Контроль антибиотиков в мясном сырьё / З.Ю. Белякова // Мясные технологии. - 2018. - № 12 (192). - С. 17-19.
Оганесянц, Л.А. Мониторинг качества пищевых продуктов - базовый элемент стратегии / Л.А. Оганесянц, С.А. Хуршудян, А.Г. Галстян // Контроль качества продукции. - 2018. - № 4. - С. 56-59.
ГОСТ Р 55481-2013 «Мясо и мясные продукты. Качественный метод определения остаточных количеств антибиотиков и других антимикробных химиотерапевтических веществ».
