CC BY
29
РАСПРЕДЕЛЕНИЕ АЛЛЕЛЕЙ ГЕНА GPIIIa СРЕДИ ПАЦИЕНТОВ С ДИСЛИПИДЕМИЯМИ, СТРАДАЮЩИХ ГИПЕРТОНИЧЕСКОЙ И ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНЬЮ СЕРДЦА
Е.Н. Касапова, А.В. Иткес
Кафедра биологии и общей генетики Российский университет дружбы народов
Ул. Миклухо-Маклая, 8, 117198 Москва, Россия
Т.Ю. Зотова
Кафедра патологической физиологии Российский университет дружбы народов
Ул. Миклухо-Маклая, 8, 117198 Москва, Россия
Причиной генетической предраспроложенности к целому ряду заболеваний, в том числе коронарному атеросклерозу, ишемической болезни сердца, является наличие деффект-ных интегриновых рецепторов. В работе рассматривалось распространение гена одного из интегринов, гликопротеида GPIIIa (ß-субъединица типа III), у пациентов с дислипидемиями. Нами показано, что наличие в генотипе дефектного аллеля PLA2 является генетическим фактором риска для интенсивного развития ишемической болезни сердца и артериальной гипертензии у больных с дислипидемиями, что сопряжено с большей частотой осложнений и необходимостью более объемной антигипертензивной терапии с целью стабилизации артериального давления.
Ключевые слова: ген GPIIIa, интегрин, дислипопротеинемия, ишемическая болезнь сердца, артериальная гипертензия.
Основной причиной смертности (около 1,2 млн. человек ежегодно) и инвалиди-зации (31,2 на 10000 человек) в России по-прежнему остаются сердечнососудистые заболевания [1]. Одним из наиболее важных факторов риска развития ишемической болезни сердца, гипертонической болезни и других сердечнососудистых осложнений являются нарушения липидного обмена. Еще в 1912 г. H.H. Аничков и С.С. Халатов показали роль гиперхолестеринемии в атерогенезе, а в 1960-1980 гг. на первый план вышли данные о липопротеинах низкой плотности (ЛПНП) и очень низкой плотности (ЛПОНП), как основных источниках липидной инфильтрации артериальных стенок с последующим разрастанием соединительной ткани и образованием фиброзных бляшек, суживающих просвет и нарушающих физиологические функции пораженных артерий, что приводит к расстройствам кровообращения. Установлено, что белковый компонент одного из классов ЛПНП является рецептором холестерина, ответственным за перенос его из плазмы крови в клетки, в то время как липопротеины высокой плотности (ЛПВП), напротив, осуществляют акцепцию холестерина с клеточных мембран и переносят его к местам катаболизма, препятствуя тем самым липидной инфильтрации стенок артерий. В норме перенос холестерина в клетки регулируется как балансом ЛПНП и ЛПВП,
так и уменьшением числа рецепторов холестерина на клетке по мере его поступления в клетку, однако при высокой концентрации в плазме ЛПНП возможен рецеп-тор-независимый путь избыточного проникновения холестерина в клетку.
Для оценки вероятности развития атеросклероза используют так называемый индекс (или коэффициент) атерогенности (ИА), равный отношению:
(ЛПНП + ЛПОНП)
ЛПВП
Как полагают, процесс атерогенеза начинается при значении ИА выше 3-3,5 [2; 3].
Целевые уровни общего холестерина и ЛПНП незначительно различаются согласно американским и европейским рекомендациям: в США они определены как 5,2 ммоль/л и 2,6 ммоль/л, а в Европе — как 5,0 ммоль/л и 3,0 ммоль/л соответственно [2].
В настоящее время чаще всего ограничиваются определением у кардиологических больных уровня общего холестерина и триглицеридов, что не дает возможности полностью оценить нарушение липидного обмена. Для диагностики дислипи-демий важно ориентироваться также на показатели липопротеинов низкой плотности, липопротеинов высокой плотности и их соотношение.
В крупных международных рандомизированных исследованиях доказано, что единственный класс гиполипидемических препаратов, при применении которых у больных с гиперлипидемией снижается общая и сердечно-сосудистая смертность, риск развития инфаркта миокарда и инсульта, необходимость проведения операций по восстановлению коронарного кровотока (аортокоронарного шунтирования и транслюминальной балонной коронарной ангиопластики) — это статины. Статины вызывают наиболее выраженное снижение уровня общего холестерина и ЛПНП, являются достаточно безопасной и удобной в применении группой лекарственных средств.
К сожалению, частота применения статинов в нашей стране недостаточно высока. Широкое применение статинов сдерживается, в первую очередь, высокой стоимостью большинства препаратов этой группы [3].
В этих условиях при оценке выбора лекарственных средств становится важным использование каких-либо критериев, выделяющих среди больных с гиперлипиде-миями группу, первоочередно нуждающуюся в более интенсивном наблюдении и терапии, в том числе статинами.
Интегрины, являясь поверхностными рецепторами клетки, обеспечивают взаимодействие клеток с внеклеточным матриксом и друг с другом, а также участвуют в процессах свертывания крови, премещения клеток в зону воспаления, имплантации и эмбрионального развития, метастазирования опухолевых клеток, процессах апоптоза [4; 5].
Интегрины состоят из а-субъединиц (известно 16 классов) и р-субъединиц (известно 8 классов). Вступая в нековалентное взаимодействие, а- и р-субъединицы образуют гетеродимеры, тем самым обеспечивая существование интегриновых комплексов с разной специфичностью.
Гликопротеиновая р-субъединица типа III, подтипа «а» (вРШа) представлена двумя аллельными формами: РЬА1 и РЬА2. Средняя частота встречаемости в популяции аллеля РЬА2 гена вРШа для населения Европы составляет около 14%. Аллель РЬА2 отличается заменой тимидинового нуклеотида на цитозиновый в пози-
ции 196 мРНК GPIIIa, что влечет за собой включение пролина вместо лейцина в позиции 33 белковой молекулы [6; 7]. Установлено, что наличие данного дефектного аллеля является причиной генетической предрасположенности к некоторым заболеваниям, в числе которых венозные и артериальные тромбозы, коронарный кардиосклероз, наследственная тромбастения Гланцманна, поздний гестоз и задержка развития плода [4; 8-10].
Целью данной работы явилось выяснение распространения различных вариантов гена GPIIIa среди пациентов с дислипидемиями и возможности использования генетической предрасположенности, определяемой аллелем PLA2, как критерия для определения первоочередных групп риска по развитию сердечно-сосудистых осложнений (ишемическая болезнь сердца, гипертоническая болезнь) у данной категории больных.
Материалы и методы.
Были обследованы 41 человек с дислипидемиями (в группу включались пациенты с уровнем общего холестерина выше 5,0 ммоль/л и/или индексом атерогенно-сти выше 3 в возрасте от 40 до 71 года (средний возраст — 53,05 года ), имеющие при поступлении в стационар диагнозы: ишемическая болезнь сердца и/или артериальная гипертензия. Пациенты выписывались на амбулаторное лечение в удовлетворительном состоянии: в отсутствии ангиозных приступов и со стабильной гемодинамикой. При подборе базовой антигипертензивной терапии целевой уровень артериального давления был < 140/90 мм рт. ст. С этой целью применялась монотерапия антигипертензивными препаратами основных групп или, при необходимости, проводилась комбинированная терапия препаратами нескольких групп.
Получение ДНК-матрицы. Отбирали 100 мкл крови на хроматографическую бумагу и хранили при температуре +20°С. Препарат ДНК получали с использованием набора «Цитолизин» (Россия) по прилагаемой методике.
Полимеразная цепная реакция. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили с использованием амплификатора ДНК многоканального МС-2 «Терцик» (Россия) и термоциклера “Trepsonal” (Германия).
В работе использовали нуклеотидные праймеры (номера нуклеотидов приведены по последовательности ACC. М32672): GPIIIL — 1459 GGA СТТ СТС ТТТ GGG СТС CTG; GPIIIR — 1728 С AC CTG СТТ CAG GTC ТСТ СС.
Инкубационные пробы содержали (25 мкл): праймеры по 1 мкл 10 мкМ (1,5 о.е./мл), 2,5 мкл рестрикционного буфера 10х («Бион», Россия), MgCb до концентрации 3,5 мМ, 2,5 мкл смеси dNTP 10х, 20 нг ДНК-матрицы, 0,5 ед. Taq-полимеразы.
В ряде исследований для усиления специфичности ПЦР был применен специальный режим с внутренними праймерами — NESTED ПЦР. Тогда использовали вторую пару праймеров: GPIIInL — 1532 GCTGAA GGA TAA CTG TGC CC; GPIIInR — 1759 СТС CTC AGA CCT CCA CCT TG.
При поведении первого этапа NESTED ПЦР в качестве внешних праймеров использовали GPIIIL и GPIIInR, в результате чего получался продукт длиной 300 п.н. Его разводили в 20 раз и использовали как матрицу для второго этапа NESTED ПЦР с участием другой пары праймеров. В результате длина полноразмерного фрагмента составила 200 п.н.
Программа ПЦР состояла из 35 циклов при следующих условиях каждого из них: 94°С — 40 с, 60°С — 30 с, 72°С — 90 с. Программа NESTED ПЦР при том же количестве циклов имела несколько иной режим: 94°С — 40 с, 60°С — 30 с, 72°С — 1 мин. 30 с. После амплификации пробы осаждали 3 объемами этанола в течение ночи и собирали центрифугированием в течение 30 мин. при 10 тыс. g.
Обработка ДНК рестрикционной эндонуклеазой Mspl. Содержимое пробы растворяли в воде из расчета, что конечный объем рестрикционной смеси составит 100 мкл, в которую вводили 5 ед. рестриктазы Mspl (“Promega”, США). После инкубирования смеси в течение 1,5 ч при 37°С добавляли 9 мкл 5М NaCl и 300 мкл С2Н5ОН. Смесь выдерживали 12 часов при — 20°С, цетрифугировали в течение 10 мин. при 10 тыс. g. и удаляли супернатант. Осадок растворяли в 15 мкл буфера для нанесения на полиакриламидный гель.
Электрофорез в полиакриламидном геле. Разделение фрагментов проводили в 10% полиакриламидном геле при 20мА и 250V в течение 1 часа. В качестве маркера использовали плазмиду pUCIS, обработанную рестриктазой Mspl (размер фрагментов составлял от 501 до 34 п.н.). Размер фрагментов ДНК, полученных в результате ПЦР с использованием полноразмерных праймеров, до расщепления составлял 270 п.н. После расщепления фрагмент, соответствующий аллелю PLA1, составил 212 п.н., а соответствующий аллелю PLA2 — 164 п.н. Фрагмент ДНК, полученный на первом этапе NESTED ПЦР, после обработки рестриктазой соответствовал аллелю PLA1, если включал 220 п.н., а аллелю PLA2 — 165 п.н. После обработки рестриктазой Mspl фрагмента гена GPIIIa, полученного после второго этапа NESTED ПЦР, аллелю PLA1 соответствовал фрагмент 140 п.н., а аллелю PLA2 — 90 п.н. Гель окрашивали бромистым этидием или серебром (“Sigma”, США).
Статистический анализ результатов. Полученные данные подвергали обработке с использованием пакета программ STATISTICA 6.0, StatSoft, США. Достоверность различий оценивали по непараметрическому критерию «Obs/Exp», достоверными считали различия при р < 0,05.
В группе иследовалось аллельное распределение гена GPIIIa, а также частота заболеваемости ишемической болезнью сердца и гипертонической болезнью. Выраженность гипертонической болезни оценивалась по максимальным цифрам систолического артериального давления (1 степень: 140-160 мм рт. ст.; 2 степень: 160-180 мм рт. ст.; 3 степень: выше 180 мм рт. ст.), а также по объему антигипертензив-ной терапии, применяемой у каждого конкретного пациента.
Надо отметить, что многие лекарственные средства способны вызывать появление или обострить уже имеющиеся гиперлипидемические расстройства. Сказанное прежде всего относится к некоторым препаратам, используемым для лечения гипертонии и стенокардии. Наиболее существенными гиперлипидемическими свойствами обладают тиазидные диуретики и ß-блокаторы, а препараты группы ингибиторов ангиотензин-превращающего фермента, антагонисты кальция, инда-памид не действуют на концентрацию сывороточных липидов. Однако негативные эфекты наблюдаются не у всех ß-адреноблокаторов. Ряд многоцентровых исследований показал, что селективный ß-адреноблокатор бисопролол не оказывает влияния на общий холестерин и триглицериды, а уровень липопротеидов высокой плотности достоверно возрастал на 9% (р<0.05) [11]. Учитывая вышесказанное, при подборе антигипертензивной терапии пациентам с дислипидемиями использовались ингибиторы-АПФ (Диротон), антагонисты кальция (Верапамил), индапамид и селективный ß-адреноблокатор бисопролол (Конкор). В терапии ишемической болезни сердца использовались по показаниям препараты нитратов (Кардикет).
Результаты и обсуждение.
При исследовании аллельного распределения гена GPIIIa в вышеуказанной группе больных, не были выявлены гомозиготы по аллелю PLA2. Гомозиготы по аллелю PLA1 и гетерозиготные генотипы PLA1/PLA2 соотносились как 63 и 37 соответственно (табл. 1).
Таблица 1
Основные показатели контингента больных в зависимости от их генотипа
JV» Показатель PLA1/A1 PLA1/A2
1. Количество пациентов, (чел.) 29 (63%) 17(37%)
2. Средний возраст, (годы) 53.20 54.69
3. Уровень холестерина, (ммоль/л) 6.43 6.38
4. Индекс атерогенности 3.48 3.30
5. Частота ИБС 14 (48%) 10(59%)
6. Частота осложнений ИБС (ОИМ, МА) (от общего числа больных ИБС в группе) 6 (37%) 7 (70%)
7. Артериальная гипертензия (частота в группе) 24 (83%) 17(100%)
8. Среди больных артериальной АГ: гипертензия 1 -й степени гипертензия 2-й степени гипертензия 3-й степени 7 (29%) 7 (29%) 10(42%) 4 (24%) 3(18%) 10(59%)
Примечание: ОИМ — острый инфаркт миокарда в анамнезе;
МА — мерцательная аритмия, постоянная или пароксизмальная форма
Среди гомозигот по аллелю РЬА1 средний уровень общего холестерина крови составил 6,43 ммоль/л, средний индекс атерогенности составил 3,48. Из 29 пациентов этой группы страдали гипертонической болезнью 24 чел., т.е. 8% (в том числе: гипертоническая болезнь 1 -й степени — 7 чел., 2-й степени — 7 чел., 3-й степени — 10 чел. или 29%, 29%, 42% соответственно). Ишемическая болезнь сердца в данной группе наблюдалась у 14 пациентов (48%), в том числе осложненная инфарктом миокарда и/или нарушением ритма по типу мерцательной аритмии — у 6 (37%). Результаты исследования представлены в табл. 1.
При подборе антигипертензивной терапии достигался уровень артериального давления < 140/90 мм рт. ст. С этой целью применялась монотерапия антигипертен-зивными препаратами основных групп или, при необходимости, проводилась комбинированная терапия. Помимо числа комбинируемых групп препаратов учитывались применяемые суточные дозировки антигипертензивных средств (в % от максимальной суточной терапевтической дозы). Надо отметить, что анализировались дозы препаратов, используемые на момент выписки из стационара для амбулаторного лечения, т.е. рассматривался объем базовой длительной амбулаторной терапии, необходимой для поддержания стабильной гемодинамики на уровне АД< 140/90 мм рт. ст. При этом часть пациентов — с симптоматической пароксизмальной артериальной гипертензией — не нуждалась после выписки из стационара в длительном постоянном приеме антигипертензивных препаратов. Результаты представлены в таблицах 2 и 3.
Таблица 2
Объем антигипертензивной базовой терапии (постоянный прием) в процентах от максимальной терапевтической суточной дозы в группах гетеро- и гомозигот по гену вРШа
Группа препаратов Пациенты РЬЛ1 /А 1 (% от максимальной терапевтической суточной дозы препарата) Пациенты РЬА1/А2 (% от максимальной терапевтической суточной дозы препарата)
Ингибиторы АПФ (100%= диротон Юмг/сут.) 31,56% 72,44%
Диуретики (100%= арифон 2.5 мг/сут.) 46,05% 84,70%
Р~6локаторы (100%=конкор Юмг/сут.) 14,34% 30,14%
Блокаторы Са-канаюв (100%= верапамил 80мг х2р/сут.) 15,14% 7,14%
Таблица 3
Количество антигипертензивных препаратов основных групп, используемых в комбинации при подборе базовой терапии АГ (артериальной гипертензии),
% от общего числа пациентов в группе гомо- и гетерозигот по ЄРШа
Число групп препаратов, используемых в комбинированной базовой терапии АГ Пациенты PLA1/A1 (% от всех в группе) Пациенты PLA1/A2 (% от всех в группе)
Ноль групп (без препаратов) 11 0
Одна группа 27,60 29,61
Две группы 43,14 20,32
Гри группы 11,85 37,14
Четыре группы 0 16,04
Заключение.
В результате данного исследования выявлено, что наличие в генотипе аллеля PLA2 является у больных с дислипидемиями генетическим фактором риска не для развития ишемической болезни сердца и артериальной гипертензии как таковых. Данный аллель определяет осложненное нестабильное течения этих заболеваний. У больных с дислипидемиями аллель PLA2, что сопряжено с большей частотой осложнений. Эти больные требуют больших доз препаратов, большего числа препе-ратов, относящихся к различным группам антигипертензивных средств, и большей продолжительности лечения для стабилизации артериального давления. Таким образом, носители аллеля PLA2 гена GPIIIa представляют собой генетически детер-минированнюу группу больных, требующих более активной, продолжительной и многокомпонентной антигипертензивной терапии.
ЛИТЕРАТУРА
\.Гурвич И.Н. Состояние здоровья населения России: 1989-2003 гг. // СПИД, рак и общее здоровье. — 2005. — Т.9. — С. 72-83.
2. Thompson, G.R. Handbook of Hyperlipidaemia. G.B.: Current Science, 1994. — 258 p.
Ъ.Либов И.А., Гультикова O.C. Некоторые клинические аспекты применения статинов для лечения больных ишемической болезнью сердца и гиперлипидемиями // Московский медицинский журнал.— 2001. — Дек. — С. 14-15.
4. Гигани О.О., Буянова Н.И. и др. Аллельные формы гена бетта-цепи интегрина как фактор к генетической предрасположенности к некоторым гинекологическим заболеваниям // Вестник РУДН. Сер. Медицина. — 2003. — №5 (24). — С. 23-28.
5. Фаллер Д.М., Шилдс Д. Молекулярная биология клетки. — М.: БИНОМ-Пресс, 2003. — 272 с.
6.Lansa F., Kieffer N.. Phillips D.R. et al. Characterization of the human platelet glycoprotein Ilia gene. Comparison with fibropectin receptor beta-subunit gene // J. Biol. Chem.— 1994, —Vol. 61, —P. 812-814.
7. Newman P.J., Derbes R.S., Aster R.H. The human platelet alloantigens, PLA1 and PLA2, are associated wiht a leucine33/proline33 amino acid polymorfism in membrane glycoprotein Ilia, and arc distinguishable by DNA typing // J. Clin. Invest. — 1989. — Vol. 83, —P. 1778-1781.
8. Weiss D., Payback M. et al. Polymorfism of platelet glycoprotein receptor as an inherited risk factor for coronari trombosis // N. Engl. J. — 1996. — Vol.334. — P. 1990-996.
9. Ridker P.M., Hennekens C.H. et al. PLA1/PLA2 polymorfism of platelet glycoprotein Ilia and risks of myocardial infarction, stroke and venous trombosis // N. Engl. J.
— 1997. — Vol.349. — P. 385-388.
10. Beer J.H., Pederiva S. Genetics of platelet receptor singlle-nucleotide polymorfism: clinical implications in trombosis // J. Neural Transm. — 2000. — Vol. 107. — P. 266-272.
11. Терещенко C.H, Акимова О С Использование Р-адреноблокаторов у больных с относительными противопоказаниями к их применению // Сердце. — 2002.
— — С. 180.
ALLELIC DISTRIBUTION OF GPlIIa GENE AMONG DISLIPIDAEMIA PATIENTS WITH ARTERIAL HYPERTENSION AND CORONARY HEART DISEASE
E.N. Kasapova, A.V. Itkes
Department of Medical Biology and Genetics Peoples’ Friendship University of Russia
Mikluk.ho-Mak.laya st. 8, 117198 Moscow, Russia
T.Yu. Zotova
Department of Pathological Physiology Peoples’ Friendship University of Russia
Miklukho-Maklaya st. 8, 117198 Moscow, Russia
As well known presence of defective integrin receptors is the reason of serious diseases such as coronary atherosclerosis and coronary heart disease. The distribution of gene region coding type III p-subunit of GPlIIa glycoprotein among dislipidaemia patients genomes was described in current paper. The correlation between presences of defective PLA2 alleles and higher probabilities of coronary heart disease and arterial hypertension for such patients was demonstrated here. As was shown dislipidaemia patients with defective PLA2 alleles can be characterized with higher risk of complication of coronary heart disease and arterial hypertension and require additional medical treatments.
Key words'. GPlIIa gene, integrin, dislipidaemia, coronary heart disease, arterial hypertension.
