CC BY
50
АЛЛЕЛЬНЫЕ ФОРМЫ Г ЕНА БЕГА-ЦЕПИ ИНТЕГРИНА КАК ФАКТОР ГЕНЕТИЧЕСКОЙ
ПРЕДРАС ПОЛОЖЕННОСТИ К НЕКОТОРЫМ ГИНЕКОЛОГИЧЕСКИМ ЗАБОЛЕВАНИЯМ
О.О. ГИГАНИ, Н.И. БУЯНОВА, С.Л. СОКОЛОВА, А.В. ИТКЕС
Кафедра биологии и общей генетики РУДН. Москва, 117198, ул. Миклухо-Маклая, д. 8.
Медицинский факультет Э Х. ФАХРУТДИНОВА, О.Д. ЛОБАНОВА, Н.Ю. ГРИГОРЬЕВА,
В.Е. РАДЗИНСКИЙ
Кафедра акушерства и гинекологии РУДН. Москва, 117198. ул. Миклухо-Маклая, д. 8.
Медицинский факультет Т.Е. САМОЙЛОВА, В.Г1. СМЕТНИК Отделение гинекологической эндокринологии НЦ АГиП РАМН.
Москва, 117815, ул. ак. Опарина, д. 4
Наличие дефектных интегриновых рецепторов является причиной генетической предрасположенности к целому ряду заболеваний, в числе которых инфаркт миокарда, ишемическая болезнь сердца, коронарный атеросклероз, венозные и артериальные тромбозы, наследственная тромбастения Гланцмаина, а также - поздний гестоз и задержка развития плода. Один из интегринов, гликопротеид ОРША (Р-субъединица типа III), представлен двумя аллельными формами - РЬА1 и РЬА2. Мы исследовали распространение различных вариантов гена ОРИ 1а у пациенток с миомой матки, внугренним эндометриозом и их сочетаниями, а также - с акушерскими кровотечениями. Нами показано, что наличие в генотипе дефектного аллеля РЬА2 гена ОРШа не является генетическим фактором риска для развития миомы матки. Однако присутствие в генотипе женщины этого аллельного варианта существенно снижает риск развития у нее аденомиоза или сочетания внутреннего >ндометриоза и миомы матки Кроме того, у носителей аллеля Р1.А2 существенно возрастает вероятность появления акушерскою кровотечения.
Ключевые слова: интегрин, ген ОРШа, акушерские кровотечения, аденомиоз, миома матки, генетическая п ре драс п ол ожен н ость.
Интегрины являются поверхностными рецепторами клетки. Большинство таких рецепторов функционально соединяют ее с внеклеточным матриксом (посредством соединения с колла! сном, фибронектином, ламинином, а также с фибриногеном и др.) и с другими клетками. К настоящему времени известно, что интегрины участвуют во многих клеточных процессах, включая имплантацию и эмбриональное развитие, рост и ме-тастазирование опухолевых клеток, апоптоз, свертывание крови и перемещение клеток в зоны воспаления [18]. Кроме этого, интегрины могут кооперировать с другими рецепторами своей клеточной поверхности (например, с РОСтБ) и тем самым влиять на пути передачи сигналов [И].
Всего известно 16 классов а- и 8 классов [3- субъединиц интегринов. Вступая в нековалентное взаимодействие, а- и [5- субъединицы образуют гетеродимеры, тем самым обеспечивая существование интегриновых комплексов с разной специфичностью, 20 из которых уже идентифицированы [1].
Помимо того, что интегрины, являясь поверхностными рецепторами, обеспечивают взаимодействие клеток друг с другом и с внеклеточной средой, они способны контактировать с вну триклеточным матриксом, в первую очередь с белками цитоскелета. Причем известно, что такие связи могут возникать и в местах фокальных контактов, и за их" пределами. Такой способностью отличаются, по крайней мере, субъединицы (32 и р3 [5].
Кроме этого, в современной литературе много внимания уделяется связи между действием интегринов и регуляцией апопгоза [3, 12, 13]. Так, например, известно, что одним из этапов апоптоза клетки является изменение конформации ее плазматической мембраны, что в сочетании с наличием в мембране интегриновых (сф3) рецепторов для витронектина делает клетку более притягательной для макрофага. Вместе с этим, неоспоримым является тот факт, что интегрины, обладая способностью связываться со специфическими белками экстрацеллюлярного матрикса, являются компонентом каскада
передачи сигнала, запрещающего апоптоз. Разрыв же связи рецептор - лиганд, наоборот, генерирует сигнал, индуцирующий апоптоз [4]. Нарушения запрограмированной гибели клетки повлекут за собой развитие аутоиммунных, гинекологических заболеваний (в том числе миомы матки и внутреннего эндометриоза), заболеваний сердечно-сосудистой системы, злокачественных образований и др.
Наибольший интерес для нас в связи с вышесказанным представляет гликопротеино-вая р - субьединица типа III, подтипа a (GPIIla), представленная двумя аллельными формами: PLA1 и PLA2 [6]. Среднепопуляционная частота встречаемости аллеля PLA2 гена GPIIla для населения Европы составляет по разным данным около 14% [14, 16, 17]. Аллель PLA2 отличается заменой тимидинового нуклеотида на цитозиновый в позиции 196 мРНК GPIIla, что влечет за собой включение пролина (вместо лейцина) в позиции 33 белковой молекулы [10]. Установлено, что наличие данного дефектного аллеля является причиной генетической предрасположенности к целому ряду заболеваний, в числе которых инфаркт миокарда, ишемическая болезнь сердца, коронарный атеросклероз, венозные и артериальные тромбозы [2, 9, 15], наследственная тромбастения Гланцманна [9], а также — поздний гестоз и задержка развития плода .
Нельзя не отметить, что возможно и нарушение функции совершенно нормальных интегриновых рецепторов, которое в первую очередь может быть связано с их пониженной экспрессией или аномальной кластеризацией в мембране клетки [8]. В этих случаях перечисленные заболевания могут возникать с повышенной вероятностью у носителей нормальных, а не мутантных аллелей GPIIla.
Целью данной работы явилось выяснение распространения различных вариантов гена GPIIla среди пациенток с акушерскими кровотечениями, миомой матки, внутренним эндометриозом и их сочетаниями. Эти данные позволили нам предложить схему определения групп риска по перечисленным заболеваниям, основанную на генетической предрасположенности, определяемой аллелем PLA2.
Материалы и методы исследования.
Получение ДНК-матрицы
Отбирали 100 мкл периферической крови в пробирку, содержащую 25 мкл 50 мМ раствора Na-ЭДТА ("Sigma", США), перемешивали и хранили при температуре —20°С.
Препарат ДНК получали с использованием набора "Цитолизин" (Россия) по прилагаемой методике.
Полимеразная ценная реакция.
Полимеразную цепную реакцию (Г1ЦР) проводили с использованием амплификатора ДНК многоканального МС 2 "Терцик" (Россия) и термоциклера "Trepsonal" (Германия).
В работе использовали нуклеотидные праймеры (номера нуклеотидов приведены по последовательности АСС. М32 672) :
GP1IIL - 1459 GGA СТТ СТС ТТТ GGG СТС CTG
GPIIIR - 1728 САС CTG СТТ CAG GTC ТСТ СС
Инкубационные пробы содержали (25 мкл): праймеры по 1 мкл 10 мкМ (1,5 о.е./мл),
2.5 мкл рестрикционного буфера 10х ("Бион", Россия), MgCl2 до концентрации 3,5 мМ,
2.5 мкл смеси dNTP 10х, 20 нг ДНК-матрицы, 0,5 ед. Taq-полимеразы.
В ряде исследований для усиления специфичности ПЦР был применен специальный режим с внутренними праймерами - NESTED ПЦР. Тогда использовали вторую пару праймеров:
GPIIInL - 1532 GCTGAA GGA ТА A CTG TGC СС
GPIIInR - 1759 СТС СТС AGA ССТ CCA ССТ TG
При поведении первого этапа NESTED ПЦР в качестве внешних праймеров использовали GPIIIL и GPIIInR, в результате чего получался продукт длиной 300 п.н. Его
разводили в 20 раз и использовали как матрицу для второго этапа NESTED ПЦР с участием другой пары праймеров. В результате длина полноразмерного фрагмента составила 200 п.н.
Программа ПЦР состояла из 35 циклов при следующих условиях каждого из них: 94°С - 40 с, 60°С - 30 с, 72°С - 90 с. Программа NESTED Г1ЦР при том же количестве циклов имела несколько иной режим: 94°С - 40 с, 60°С - 30 с, 72°С - 1 мин 30 с. После амплификации пробы осаждали 3 объемами этанола в течение ночи и собирали центрифугированием в течение 10 мин. при 10 тыс. g.
Обработка ДНК рестрикционной эндонуклеазой Mspl.
Содержимое пробы растворяли в воде из расчета что конечный объем рестрикционной смеси составит 100 мкл, в которую вводили 5 ед. рестриктазы Mspl ("Promega", США). После инкубирования смеси в течение 1,5 ч при 37°С добавляли 9 мкл 5М NaCl и 300 мкл С2Н5ОН. Смесь выдерживали 12 часов при -20°С, цетрифугировали в течение 10 мин. при 10 тыс. g. и удаляли супернатант. Осадок растворяли в 15 мкл буфера для нанесения на полиакриламидный гель.
Электрофорез в полиакриламидном геле.
Разделение фрагментов проводили в 10% полиакриламидном геле при 20мА и 250V в течение 1 часа. В качестве маркера использовали плазмиду pUC18, обработанную рест-риктазой Mspl (размер фрагментов составлял от 501 до 34 п.н.). Размер фрагментов ДНК, полученных в результате ПЦР с использованием полноразмерных праймеров, до расщепления составлял 270 п.н. После расщепления фрагмент, соответствующий аллелю PLA1, составил 212 п.н., а соответствующий аллелю PLA2 - 164 п.н. Фрагмент ДНК, полученный на первом этапе NESTED ПЦР, после обработки рестриктазой соответствовал аллелю PLA1, если включал 220 п.н., а аллелю PLA2 - 165 п.н. После обработки рестриктазой Mspl фрагмента гена GPIIIa, полученного после второго этапа NESTED ПЦР, аллелю PLA1 соответствовал фрагмент 140 п.н., а аллелю PLA2 - 90 п.н.
Гель окрашивали бромистым этидием или серебром ("Sigma", США).
Статистический анализ результатов.
Полученные данные подвергали обработке с использованием пакета программ STA-TISTICA 6.0, StatSoft, США. Достоверность различий оценивали по непараметрическому критерию «Obs/Ехр», достоверными считали различия при р < 0,05.
Результаты и обсуждение.
Были обследованы 181 женщина в возрасте от 19 до 71 года, имеющие вышеперечисленные заболевания. По известной патологии женщины были разделены на 4 группы:
I - акушерские кровотечения (не менее 400 мл) 16 чел.
II - миома матки 94 чел.
III •- внутренний эндометриоз 26 чел.
IV - миома матки и внутренний эндометриоз 45 чел.
Таким образом, всего миомой матки страдали 139 из обследованных женщин, а
внутренний эндометриоз имели 71 пациентка.
В каждой группе было проведено исследование аллельного распределения гена GPIIIa. В результате ни в одной из групп не были выявлены гомозиготы по аллелю PLA2. Как показывают приведенные в таблице 1 данные, большинство пациенток во всех группах являются гомозиготами по аллелю PLA1. Доля гетерозиготных генотипов в группе с акушерскими кровотечениями составила 50%, тогда как в группах с миома-
ми, внутренним эндометриозом и сочетанием двух последних патологий эта величина оценивалась как 15%, 0% и 4,5% соответственно.
Из 139 пациенток, всего страдающих миомой матки, как гомозиготы по аллелю РЬА1 идентифицировано 123 человека, что составило 88,5%. Общее количество больных аденомиозом составило 71 человек, гомозиготы среди которых составляют 97,2%. При этом выявленная процентная доля гетерозигот в этих суммарных группах соответствует 11,5% и 2,8%.
Исходя их того, что среднепопуляционная частота встречаемости аллеля РЬА2 гена СРШа составляет по данным разных авторов от 11 до 14,5%, и доля гетерозиготных генотипов, соответственно, может быть принята за 20%, мы попытались сравнить полученные нами данные с контрольными по популяции. Как показали результаты исследований, в группах пациенток с акушерскими кровотечениями, внутренним эндометриозом, а также с сочетанной патологией миометрия частота встречаемости аллеля РЬА2 гена вРШа достоверно отличается от среднепопуляционной (для всех трех групп р < 0,01). Причем для группы с акушерскими кровотечениями это отличие еще более значительно (р < 0,003). Вместе с тем, в группе больных с миомой матки достоверных отличий от популяционной не выявлено (р < 0,18).
Таблица 1.
Аллельное распределение гена СРШа
Г руппа Коли- чество С генотипом А1А1 С генотипом А1А2 Р
Число % Число %
Популяционная норма 78 20
Родовые Кровотечения 16 8 50 8 50 Р< 0,003
Миома матки 94 80 85 14 15 р < 0,18
Внутренний эндометриоз (аденомиоз) 26 26 100 0 0 р < 0,01
Сочетание миомы матки и внутреннего эндомет-риоза 45 43 95,5 2 4,5 р<0,01
Миома магки, включая сочетание миомы матки и внутреннего эндомегриоза ВСЕГО 139 123 88,5 16 11,5 р < 0,01
Внутренний эндо-метриоз, включая со-четание миомы матки и внутреннего эндо-метриоза ВСЕГО 71 69 97,2 2 2,8 р < 0,0002
Исходя из полученных результатов мы можем предположить, что наличие в генотипе аллеля РЬА2 не является генетическим фактором риска для развития миомы матки. Однако, присутствие в генотипе женщины этого аллельного варианта гена вРШа существенно снижает риск развития у нее аденомиоза или сочетания внутреннего эндомегриоза и миомы матки. Кроме того, у носителей аллеля РЕА2 существенно возрастает вероятность появления акушерского кровотечения.
Нами также была проведена оценка распределения аллельных форм РЬА1 и РГА2 в двух объединенных группах пациенток, страдающих, во-первых, миомой матки, а во-
вторых - аденомиозом. Это позволило нам сделать следующие выводы. Само по себе развитие миомы матки, по-видимому, все-таки не зависит от присутствия в генотипе аллеля PLA2 гена GPIIIa. Однако, для сводной группы с указанным заболеванием частота аллеля PLA2 обозначилась как достоверно отличающаяся от среднепопуляционной (р < 0,01). Возможность появления такого рода искажений, возникающих при анализе генетической предрасположенности к комплексу заболеваний, включающему миому матки (не зависящую от аллеля PLA2) и внутренний эндометриоз (напротив, связанный с данным аллелем), необходимо учитывать при определении групп риска по названным заболеваниям. Что касается группы с аденомиозом, в которой на чистый эндометриоз приходилось более половины больных, то здесь никаких противоречий с первоначальными результатами обнаружено не было. Наличие аллеля PLA2 существенно снижает вероятность развития внутреннего эндометриоза, о чем говорит несомненная дос товерность отличия частоты PLA2 в этой группе по сравнению со среднепопуляционной (р < 0,0002).
Тем не менее, нельзя не отметить, что молекулярные причины развития названных заболеваний гораздо более сложны и требуют дальнейших всесторонних исследований. Так, например, известны случаи, когда развитие эндометриоза сочеталось с полным отсутствием (33 субьединиц интегрина [7]. Кроме того, количество описанных типов ин-гегринов растет с каждым днем, что позволяет делать вывод и о появлении новых членов в семействе родственных генов, кодирующих эти поверхностные рецепторы. Вполне вероятно, что в скором времени можно будет составить более полную картину зависимости развития нарушений в пространственной и функциональной организации тканей и органов с одной стороны, и особенностями экспрессии/неэкспрессии интегрино-вых генов с другой. Решение этой задачи представляется нам интересным, перспективным и значимым для практической медицины.
Литература
1. Фаллер Л.М., Шилдс Д. Молекулярная биология клетки. М.:БИНОМ - Пресс, 2003. 272 с.
2. BcerJ.H., Pederiva S.. Pontiggia L. Genetics of platelet receptor single-nucleotide poiymorfisms: clinical implications in thrombosis. //.I Neural Transm. - 2000. - V. 107. - P. 266-272.
3. Boudreau N.. Sympson C.J., Werb '/.. el all. Suppression of 1CH and apoptosis in mammary epitelial cells by extracellular matrix. //Science. - 1995. - V.267. - P.891-893.
4. Frish S.М., Screalon R.A. Anoikis mcchanisms.// Curr Opin Cell Biol. - 2001. - V. 13. - P.555-562.
5. Kucik D.F., O'Toole I.E., Zhcleznyak A. et all. Actination-enhanced ацьРз-Integrin-Cytoskcleton Interactions Outside of Focal Contacts Require the а-Subunit. //Mol Biol Cell. - 2001. - V.12. P.- 1509-1518.
6. I.ansa Kieffer N.. Phillips D.R. et all. Characterization of the human platelet glycoprotein Ilia gene. Comparison with fibropectin receptor beta-subunit gene.//.I Biol Chem. - 1994. - V. 61. - P.812-814.
7. Lessey B.A.. Castelbaum A.J., Wolf L. el all. Use of inlegrins to date the endometrium.//Fertil Steril. - 2000.
V.73.’P.-779-787.
8. Me Dowall A., fnwald D., Leitinger B. el all.A novel form of integrin dysfunction involving (31, (32, and [33 inte-grins.// J Clin Invest. - 2003. - V.l I 1. P. - 51-60.
9. Mikkelsson J., Perola М., Laippala P. et all. The GPIIIa (beta3 integrin) PI A polymorfism in the early development of coronary atherosclerosis.//.I Am Coll Cardiol. - 2000. - V. 36. - P. 1317-1323.
10. Newman P.J., Derbes R.S.. Aster R./l. The human platelet alloantigens, PI.A1 and PLA2, are associated wiht a leucine33/proline33 amino acid polymorfism in membrane glycoprotein Ша, and are distinguishable by DNA typing.//.I Clin Invest. - 1989. - V. 83. - P. 1778-1781.
1 1. Potter J.C.. Hogg N. Integrins.//Trends in Cell Biology. - 1998. - V.8. - P.390-396.
12. Pullan S., Wilson J., Metcalfe A. et all. Requirement of basement membrane for the suppression of programmed cell death in mammary epithelium.//,! Cell Sci. - 1996. V. 109. - P.631-642.
13. Re F.. Zanetti A.. Sironi М., Polentnaarulti N. et all. Inhibition of anchorage-dependent cell spreading triggets apoptosis in cultured human cndotelial cells.//.I (’ell Biol. - 1994. - V.l27. - P.537-546.
14. Ridker P.M.. ffennekens С.П., Schmits C. et all. PLA1/PLA2 polymorfism of platelet glycoprotein Ilia and risks of myocardial infarction, stroke, and venous thrombosis.//Lancet. - 1997. V. 349. - P. 385-388.
15 Scliwippert-floutermans B.. Strapatsakis S., Roesen P. et all. Evaluation of an antibody-based genotype classifi-
cation of the platelet fibrinogen receptor (GPlIb/IIla).//Cytometry . - 2001. -- V. 46. - P. 238-242.
16. Simsek S., Faber N.M., Blacker P.M. et all. Determination of human pletelet antigen frequencies in the Dutch
population by immunophenotyping and DNA (allele-specific rectriction enzyme) analysis.//Blood. - 1993. — V. 81. - P. 835-840.
1 7. Weiss J.. Bray P.F., Tayback M. el all. A polymorfism of platelet glycoprotein receptor as an inherited risk factor
for coronary thrombosis.// N. Engl. J. Med. - 1996. - V.334. - P.1990-1996.
18. Woods D.. Cherwinski N.. Venetsanakos E. et all. Induction of p3 - Integnn Gene Expression by Activation of
the Ras Regulated Raf-MEK-Extracellular Signal-Regulated Kinase Signaling Pathway .//Mol Cell Biol. - 2001.
V. 21. - P. 3192-3205.
THE AIXELES OF THE INTEGRIN BETA-Sl'BUNIT GENE AS A FACTOR OF GENETIC PREDISPOSITION TO SOME GINECOLOGIC DISEASES
O.O.GIGANI, N.I.BUYANOVA, S.L.SOKOLOVA, A.V.ITKES
Department of Biology and General Genetics of PFUR. 117198, Moscow, M.-Mciklaya St., 8. Medical faculty E.Kh. FAKHRUTDINOVA, O.D. LOBANOVA, N.Yu. GRIGORIEVA,
V.E. RADZINSKI
Department of Obstetrics and Ginecologyof PFUR. 117198, Moscow, M.-Maklaya st., 8.
Medical faculty T.E. SAMOILOVA
Dpt. Ginecological Endocrinology, Obstetrics and Ginecology Research Center RAMS. Moscow, 117815, Oparin str., 4
Integrin receptors defects cause genetic predisposition to series of diseases such as myocardial infarction, myocardial ischemia, arterial and venous thrombosis, Glanzmann thrombasthenia, late gestosis and delay in fetus development. One of the integrins, glycoprotein Ilia (GPIIIa) is known to be presented with two allelic forms, PLA1 and PLA2. We analyzed the frequency of these alleles among patients with uterus myoma, internal endometriosis and their combination, and obstetric bleeding. We have shown that presence of the defective allele PLA2 of the GPIIIa gene in the female genotype is not a factor of genetic risk for development of uterus myoma. However, allele PLA2 in the female genotype considerably reduccs the risk of development of internal endometriosis or internal endometriosis and uterus myoma together. Besides, the frequency of obstetric bleeding increases among the PLA2 allele carriers.
Key words: integnn, glycoprotein 11 la gene, obstetric bleeding, internal endometriosis, uterus myoma, genetic predisposition
