CC BY
22
УДК 619: (16:981.42 Т.Г.ПОПОВА
В.С.БРОННИКОВ, А, А. ПОДКУЙКО О. В. ЛЬВОВА А.Ю.ПАВЛОВА
Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных СО Россельхозакадемии, г. Омск
РАДИАЛЬНАЯ ИММУНОДИФФУЗИЯ КАК ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭПИЗООТИЧЕСКОЙ СИТУАЦИИ ПО БРУЦЕЛЛЕЗУ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
В статье представлены результаты серологических исследований сыворотки крови от коров в период с 1992 по 2006 год в стадах, имеющих различный иммунный фон (прививка коров против бруцеллеза вакцинами из шт. В. abortus 19, 82, химической по различным схемам) в благополучных, неблагополучных и с неясной эпизоотической ситуацией по бруцеллезу. Дана высокая оценка дифференциально-диагностическому методу РИД с О-ПС антигеном в близкие сроки после реиммунизации коров (21 сутки — 3 месяца).
Использование противобруцеллезной вакцины из штамма 82 сыграло значительную роль в деле оздоровления Российской Федерации от бруцеллеза крупного рогатого скота. Во многом этому способствовали не только высокие иммуногенньге свойства вакцины, но и возможность осуществлять диагностику в фазе достаточно выраженного иммунитета. Однако многолетний опыт применения вакцины показал необходимость совершенствования поствакцинальной диагностики бруцеллеза.
Впервые Diaz R., Garatea Р., Jones L.M., Moriyon J. [8) выделили поли-В антиген, с помощью которого представилась возможность дифференцировать коров, иммунизированных живой вакциной из штамма 19 от естественно инфицированных. Cher-wonogrodzky J.W., Nielsen К.Н. [7] из В. abortus 1119-3 получили О-полисахаридный антиген, который функционально не отличался от поли-В антигена. Филиппенко М.Л., Киселевым Е.А., Чекишевым В.М., Файзрахмановым Ш.Р. [4] из В. abortus штамма 19 был получен О-ПС антиген с помощью мягкого гидролиза бактериальной массы и последующего его выделения и очистки. О-ПС антиген для экспериментальных и производственных исследований апробировали в реакции радиальной иммунодиф-фузии (РИД) в геле агара. Было установлено, что РИД с О-ПС антигеном была отрицательной во всех случаях с сывороткой крови вакцинированных животных (штаммы 19, 82 и 104 М) через 1,5 месяца и во все сроки исследований в течение года после иммунизации [5]. Понять сущность такого феномена можно при более детальном рассмотрении химической структуры грамотрицательной микрофлоры вообще и бруцелл в частности. «Клеточные стенки бруцелл представлены гидрофобными макромолекулами липополисахаридов, содержащими специфические
О-полисахариды, связанные с ядерной коровой частью и липидом А гетерополисахаридами. О-поли-сахарид, отщепленный с помощью мягкого кислотного гидролиза от коровой части и липида А, оказался различным по молекулярной массе у слабовирулентных и у вирулентных штаммов бруцелл. У вакцинированных штаммов бруцелл О-ПС из-за низкой массы (около 10 КДН) ведет себя как гаптен» [6].
Авторы предложенного О-ПС антигена, отмечая его достоинства как дифференциального метода, указывают и на его недостатки, связанные с тем, что при введении живых вакцин из шт, В. abortus (19 и 82) в больших дозах или при использовании адъго-вантов у отдельных животных могут регистрироваться через 1,5-2 месяца после иммунизации положительные показатели РИД с О-ПС антигеном [6]. Цель нашего исследования состояла в том, чтобы проследить закономерность проявления реакции преципитации у коров, многократно иммунизированных живой противобруцеллезной вакциной из шт. В. abortus 82 и химической (полусинтетической) противобруцеллезной вакциной у находящихся в стадах с различной эпизоотической ситуацией по бруцеллезу.
Материалы и методы
На первом этапе были подвергнуты анализу материалы серологических исследований сыворотки крови от коров из хозяйств Омской и Курганской областей, проведенных в лаборатории специфической профилактики бруцеллеза крупного рогатого скота ВНИИБТЖ, в период с 1992 по 2006 год.
Показатели реакции иммунной диффузии (РИД) у коров, иммунизированных по фону вакциной из штамма 19 и 82 и многократно реиммунизированных химической противобруцеллезной вакциной, изуча-
Примечания: 1." — ежегодная иммунизация,
2. ХВ — химическая вакцина ВНИИБТЖ.
Таблица 2
Результаты исследования сыворотки крови коров в РИД с О-ПС антигеном, реиммунизированных живой вакциной шт. В. abortus 82, в угрожаемых по заносу бруцеллеза стадах
Таблица 1
Схемы применения вакцин в хозяйствах с различной эпизоотической ситуацией
Обозначенные схемы иммунизации Возраст животных, применяемая вакцина Эпизоотическая ситуация по бруцеллезу Сроки исследования
4-6 мес. 14 мес. 24 мес./36 мес. (ежегодно)"
1-я ХВ ХВ ХВ благополучные 21 сутки, 1,5, 3, 6 мес.
2-я 82 82 82 +ХВ-
1-я 82 82 82... ХВ' неблагополучные
2-я 19 ХВ ХВ'
3-я 82 82 хв-
№ п/п Хозяйство, ферма Годы Кол-во исслед. Выявлены реагирующие в РИД с О-ПС антигеном Процент реагирующих по группе
1 «Красный Октябрь» 1992-1994 4122 47 1,14
2 «Б-Атмасский» 1993-1995 4452 88 1,9
3 «Октябрьское» 1992-1996 2231 52 2,3
4 «Сибирь» 1993-1995 1238 30 2,42
5 «Мысовское» 1994 798 12 1,5
6 «Россия» 1993 198 2 1,0
7 «Агрофирма «Колос» 1994 751 3 0,4
8 «Северо-Любинский» 1993 364 12 3,2
9 «Чебаклинский» 1992 316 16 5.1
10 «Красноусовский» 1992-1993 1510 85 5,6
11 «К-Курское» 1993 472 45 9,5
12 Им. Кирова 1992 325 10 3,0
13 «XIX Партсъезда» 1992 195 10 5,1
14 «Вишневское» 1992-1994 3582 139 3,9
15 «Лузино» 1995 47 6 12,7
ли в благополучных и неблагополучных по бруцеллезу стадах крупного рогатого скота (табл. 1).
Пробы сыворотки крови от коров и других возрастных групп крупного рогатого скота исследовали в общепринятых диагностических реакциях: реакцией агглютинации (РА), реакцией связывания комплемента (РСК), радиальной иммунодиффузией (РИД с О-полисахаридным антигеном). Молоко исследовали в кольцевой реакции с молоком (КР). Отбор проб сывороток крови и молока производили в разные сроки после вакцинации: на 21 сутки, 1,5 мес., 3 мес., б мес. (до угасания поствакцинальных реакций).
Результаты исследований
При исследовании 10 тысяч 324 проб сыворотки крови от коров 26 хозяйств Шадринского района Курганской области через 2 месяца после реимму-низации коров вакциной из штамма В. abortus 82 не
было выделено ни одного положительно реагирующего животного в РИД с О-ПС антигеном, что подтвердило, с одной стороны, благополучие хозяйств по бруцеллезу, а с другой — специфичность использованной реакции (РИД).
Диагностическая значимость РИД была также изучена при оздоровлении от бруцеллеза неблагополучных стад, реиммунизированных вакциной из штамма В. abortus 82. При исследовании 29889 проб сыворотки крови в суммарном итоге на бруцеллез комплексом РА + РСК зарегистрировано 1752 (5,9%) реагирующих, из них у 476 (1,6%) установлено РА + РСК в высоких титрах, характерных для бруцеллезной инфекции, тогда как РИД установлено только у 389 больных (1,3%). На основании этих исследований мы пришли к мнению о сравнительно низкой чувствительности данной реакции (РИД).
Получив такие данные в неблагополучных по бруцеллезу стадах, мы стали накапливать материал (с 1992 по 1996 год) о диагностической значимости РИД
Таблица 3
Результаты серологических исследований сыворотки крови от коров неблагополучного по бруцеллезу стада без иммунного фона (коровы индивидуального пользования)
Таблица 4
Результаты поствакцинальных реакций на бруцеллез в близкие сроки после реиммунизации химической противобруцеллезной вакциной в благополучных по бруцеллезу стадах
§ о РА МЕ РСК
№ п/п Хозяйство, ферма Годы I о 3 . СО <и ■—■ £ « < о а § о < и, ^ — и и К Реагирую щи в РИД + РА+РСК 50/100 200 и более 1:10 и более 1__
1 «Октябрьское», Ильинка 1992 30 24 3 20 17 3
2 Им. Романенко, Октябрьское 1997 219 1 9 10
3 «Вишневское» 1998 586 19 17 31 37 н
4 «Уленкульское», Черкалы 1998 99 0 3 Н н
5 «Уленкульское», Каракуль 1998 24 0 1 - 1
6 «Уленкульское», Уленкуль 1999 21 19 - 21 - 21
7 «Б-Атмасский», М-Атмас 2001 129 5 7 10 4 3
8 «Комсомольское», Тишанка 2001 82 3 8 4 9 1
9 «Кабурлинский», Кабурлы 2000-2002 243 31 16 41 24 31
Примечание: 1. * числа — абсолютные величины, 2, Н — не исследовали.
Эпизоотическая ситуация Иммунный фон Сроки исследования после реиммунизации Кол-во проб Результаты исследований (количество реагирующих, %)
РА МЕ, % РСК, % РИД
50/100 200 1:5 1:10 Полож.
Благополучные по бруцеллезу ХВ +ХВ+ ХВ ежегодно (схема 1) 21 сутки 162 56,1 5,5 11,7 - 0
1,5 мес. 274 23,4 4,1 12,7 - 0
2 мес. 481 22,8 1,8 0
4 мес. 393 , 22,1 0,2 2,5 - 0
82+82 + 82 +ХВ ежегодно (схема 2) 21 сут. 239 58,0 - 41,0 6,2 0
1,5 мес. 145 42,3 2,7 10,3 0,7 0
3,5 мес. 140 29,4 11,4 - 0
при оценке крупного рогатого скота из хозяйств, считавшихся официально благополучными, но находившихся в угрожаемой по бруцеллезу зоне.
Все стада, в которых были проведены исследования сыворотки крови в РИД, РА, РСК, были иммунизированы с применением живых противобруцел-лезных вакцин из шт. 19 и 82. Сыворотку крови от коров исследовали в отдаленные сроки после реиммунизации: через 6-12 мес. Результаты этих исследований представлены в таблице 2.
Учитывая, что недостатки специфической профилактики бруцеллеза, а также односторонняя и неполноценная диагностика часто приводят к быстрому распространению инфекции в стадах индивидуального пользования, мы провели исследования в крестьянских и мелких фермерских хозяйствах с применением РИД и других серореакций (РА, РСК) (табл. 3).
Особый интерес представляло изучение специфичности и чувствительности РИД с ОПС-антигеном
в стадах, подвергшихся иммунизации не только живыми (шт. 19,82), но и химической противобруцеллезной вакцинами. Использование химической вакцины и сочетанного применения живых противобруцел-лезных вакцин из шт. 19 и 82 с последующей реимму-низацией химической противобруцеллезной вакциной проводили в различных эпизоотических условиях.
В благополучных стадах проведены исследования сыворотки крови коров в РИД, РА и РСК в различные сроки после реиммунизации по схемам 1 (ХВ + ХВ + ХВ) и 2 (82 + 82 + 82 + ХВ) (табл. 4).
Из таблицы 4 видно, что у здоровых животных, находящихся в благополучных по бруцеллезу стадах, после введения только химической вакцины или же в сочетании с живой вакциной из шт. 82 появляются специфические антитела, которые в сыворотке крови обнаруживаются и в РА, и в РСК в течение 3,5 — 4 мес. (срок наблюдений). В отличие от РА и РСК, применяемая РИД с О-ПС антигеном во все сроки исследований была отрицательной.
В неблагополучных по бруцеллезу фермах применение РИД проводилось по различному иммунному фону. Основные исследования проходили в официально неблагополучном хозяйстве СПК ООО «Меркутлинское» Колосовского района Омской области.
В этом хозяйстве с 1992 по 1998 год оздоровление от бруцеллеза крупного рогатого скота проводилось под контролем работников районной ветеринарной лаборатории, с 1999 года противоэпизоотические мероприятия осуществлялись с участием сотрудников ВНИИБТЖ с использованием всего комплекса серологических реакций с сывороткой крови и молока, но без изменения схемы специфической профилактики, т.е. с применением вакцины из шт. В. abortus 82. За год от крупного рогатого скота было взято и исследовано 3419 проб сыворотки крови, при этом выявлено РАв высоких титрах (200/400 ME) 33 пробы; в РСК в титрах 1:20 - 1:40 - 30 проб; в РИД с О-ПС антигеном 65 голов дали положительную реакцию. Всего выявлено положительно реагирующих 97 голов. Положительные показатели кольцевой реакции (КР) с молоком также свидетельствовали о наличии бруцеллеза в стаде, число таких реакций составило 2,0% (в титрах 1:8-1:32) от числа исследованных (300 проб). С 1999 года в хозяйстве стали использовать химическую вакцину ВНИИБТЖ.
Динамика РИД завесь период применения в этом хозяйстве была следующей: (табл. 5) + в первый год контроля (с иммунизацией вакцины из шт. В. abortus 82) за 12 мес. выявлено 10,2 % реагирующих в РИД, во второй год при использовании химической вакцины — 5,1%. Через 12 месяцев коров, реагирующих в РИД с О-ПС антигеном, отмечено 0,4%. В 2003 году с учетом отрицательных показаний РИД ООО «Меркутлинское» признано благополучным по бруцеллезу. В последующие годы (2004, 2005, 2006) реагирующего на бруцеллез крупного рогатого скота в хозяйстве также не отмечено.
Заключение
На основании проведенных исследований по изучению диагностической эффективности РИД с О-полисахаридным антигеном в стадах, многократно иммунизированных живой противобруцеллезной вакциной из шт. В. abortus 82 и химической противобруцеллезной вакциной ВНИИБТЖ, можно сделать следующие выводы:
1. Отрицательные РИД с О-ПС антигеном, полученные в близкие сроки (1-2 мес.) после последней реиммунизации коров живой вакциной из штамма (шт.) 82, свидетельствуют о благополучии оцениваемого стада крупного рогатого скота по бруцеллезу.
2. Стада крупного рогатого скота, находящиеся в угрожаемой по заносу возбудителя зоне, при исследовании которых получены в отдаленные сроки после вакцинации (реиммунизации) живой вакциной из шт. 82 (через 8-12 мес. и более) положительные результаты РИД с О-ПС антигеном, следует считать сомнительными в отношении бруцеллеза, и в них необходимо дополнительно провести весь комплекс диагностических исследований с применением общепринятых серологического и бактериологического методов.
3. В неблагополучных по бруцеллезу стадах крупного рогатого скота РИД с О-ПС антигеном не выявляет дополнительно к обычным РА и РСК больных бруцеллезом животных.
4. В благополучных по бруцеллезу стадах крупного рогатого скота, многократно привитого химической (полусинтетической) вакциной ВНИИБТЖ, ни в близкие (1-2 мес.), ни в отдаленные (8-12 мес. и более) сроки после последней иммунизации положительные показатели РИД с О-ПС антигеном не регистрируются.
5. Если при эпизоотической оценке стад крупного рогатого скота, однократно или многократно иммунизированных химической вакциной ВНИИБТЖ, выявлены животные с помощью РА в титрах 1:501:100 и РСК в титрах 1:5, но РИД с О-ПС антигеном у них отрицательная, то такие стада следует считать благополучными по бруцеллезу.
Библиографический список
1. Вершилова П.А. Бруцеллез / П.А. Вершилова. — М.: Медицина, 1972. - 439 с.
2. Новицкий А.А. Изучение значимости методов серологической диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота / А.А. Новицкий, Л.В. Дегтяренко, Т.Г. Попова, Г.В. Разницына // Инфекционная патология животных: Сб. науч. тр. Юбилейный вып. РАСХН, Сиб. отд-ние, ВНИИБТЖ, Омск, 2001. - С. 44-51.
3. Попова Т.Г. Оценка эпизоотической ситуации в стадах с помощью О-ПС антигена в радиальной иммунодиффузии (РИД) / Т.Г. Попова, А.А. Новицкий, B.C. Бронников, С.В. Савицкий // Актуальные проблемы инфекционных, паразитарных и незаразных болезней домашних животных и меры борьбы с ними: Матер, юбил. научно-произв. конф. сотрудников и аспирантов. ОмГАУ, Омск. - 1998. - С. 268-272.
4. А.с. 2035188 РФ. МПК А61К39/10. Способ получения антигена для дифференциальной диагностики вакцинированных и больных бруцеллезом животных / М.Л. Филиппенко (РФ). - 2 с.
5. Чекишев В.М. Дифференциация вакцинированных и больных бруцеллезом животных / В.М. Чекишев, Ш,Р. Файз-рахманов, Е.А. Киселев, М.Л . Филиппенко // Ветеринария. — 1993. - № 8 - С. 25-32.
6. Чекишев В.М. Проблемы серологической диагностики бруцеллеза животных / В.М, Чекишев // Актуальные проблемы ветеринарной медицины в России: Сб. науч. тр., посвящ. 100-летию вет. науки в России и 30-летию СО РАСХН / РАСХН. Сиб. отд-ние, Новосибирск. - 1998. - С. 273-282.
7. Cherwonogrodzky, J.W., Nielsen К..Н. Brucella abortus 1119-3 O-chain polysaccharide to differentiate sera from B.abortus S-19 - Vaccinated and fieldstrain infected cattle by agar gel immunodiffusion. //J. Clin. Microbiol. - 1988. - V. 26. - №6. -P. 1120-1123.
8. Diaz R., Garatea P., Jones L.M., Moriyon J. Radial immu-nodifusion test with a Brucella polysaccharide antigen for differentiating infected from vaccinated cattle. // J. Clin. Microbiol. -1979. - V. 10. - P. 37-41.
ПОПОВА Тамара Гавриловна, кандидат ветеринарных наук, заведующая лабораторией специфической профилактики крупного рогатого скота. БРОННИКОВ Василий Сергеевич, кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник той же лаборатории.
ПОДКУЙКО Александр Анатольевич, младший научный сотрудник той же лаборатории. ЛЬВОВА Оксана Владиславовна, научный сотрудник той же лаборатории.
ПАВЛОВА Алла Юрьевна, младший научный сотрудник той же лаборатории,
Статья поступила в редакцию 27.11.06 г. © Попова Т. Г., Бронников В. С., Подкуйко А. А., Львова О. В., Павлова А. Ю.
УДК:619.618.14-002:636.2
А. Г. ЕРЕМЕЕВА О.С. ЕПАНЧИНЦЕВА
Омский государственный аграрный университет
ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ НЕТРАДИЦИОННЫХ СПОСОБОВ ДИАГНОСТИКИ И ТЕРАПИИ КОРОВ СО СКРЫТЫМ ЭНДОМЕТРИТОМ_
В статье представлены способы лечения коров со скрытым эндометритом. Наибольшую эффективность оказало лечение с применением препарата «Анавидин» в сочетании с внутримышечным введением «Эндометриум композитум» и с сеансами акупунктуры.
Наиболее распространенными осложнениями послеродового периода у коров, которые в значительной мере замедляют восстановление их репродуктивной функции, являются эндометриты. Несвоевременное, неквалифицированное и несистематическое лечение животных с острым послеродовым эндометритом часто приводит к осложнению их хроническим, в том числе и скрытым эндометритом [4]. Заболевание часто регистрируется у животных после оказания родовспоможения, оперативного отделения последа, а также после искусственного осеменения, проведенного без соблюдения установленных правил (инфицированной спермой, необеззара-женными инструментами) [2].
Под скрытым эндометритом понимают воспалительный процесс эндометрия, протекающий без выраженных клинических признаков, при отсутствии патологических выделений из половых органов в периоды между течками и сопровождается длительным или постоянным бесплодием на фоне многократных неплодотворных осеменений животных. Ритм половых циклов обычно не нарушается, но оплодотворение не наступает. Ряд исследователей регистрировали скрытый эндометрит как причину симптоматического бесплодия у коров в 19,8-64,7% случаев [7, 9].
В этиопатогенезе скрытого эндометрита лежат те же факторы, что и в развитии хронического воспаления матки. Обычно скрытый эндометрит у коров развивается при ослаблении в тканях ма гки воспалительной реакции, которая не заканчивается выздоровлением, а принимает хроническое течение. Это наблюдается в тех случаях, когда лечение животных с эндометритом проводится нерегулярно, с перерывами или не доводится до полного выздоровления [5, 6].
При наличии предрасполагающих условий воспалительный процесс может возникнуть даже под влиянием малопатогенных микроорганизмов, проникших в матку. Иногда он развивается из-за активизации имеющейся в полости матки микрофлоры (аутоинфекция). Инфицирование и травмирование эндометрия облегчает проникновение в его толщу микробов. На месте размножения микробов возникает ответная реакция тканей в виде воспалительного процесса (9].
Следует отметить, что ввиду отсутствия выраженных клинических проявлений заболевание часто не диагностируется, животных не лечат, и они дли-
тельное время остаются бесплодными. Осеменение животных проводят сразу после выявления признаков половой охоты, а прожилки гноя появляются в течковой слизи, как правило, в конце половой охоты. Нарушаются условия для имплантации зародыша, что приводит к многократному осеменению больных животных и, как следствие, к иммунному бесплодию и преждевременной выбраковке животных.
На практике диагноз на скрытый эндометрит ставят чаще всего визуально. В период течки у коров берут слизь, которая выделяется в большом количестве из половых органов. Затем ее помещают в чашки Петри и просматривают. Наличие прожилок, мелких хлопьев гноя белого или желтого цвета, опалесцен-ция указывают на латентное воспаление слизистой матки. Однако при этом выявляют не всех больных животных. Поэтому для уточнения диагноза, кроме клинических исследований, необходимо применять различные лабораторные тесты.
Самым достоверным методом диагностики скрытого эндометрита является гистологическое исследование биопрепаратов эндометрия. Данный метод хотя и является объективным средством диагностики скрытой патологии матки, однако используется только в научных исследованиях, так как он является очень трудоемким и его применение в условиях производства не всегда представляется возможным.
Сравнительно легко выполнимыми лабораторными методами, которые вполне могут быть использованы в период массовых исследований для диагностики скрытого эндометрита у коров, являются биологическая проба по H.A. Флегматову, экспресс-метод Г.Н. Калиновского, модифицированная проба по Г.Г. Козлову и ляписная проба В.Г. Гавриша.
Из всех известных методов лечения при скрытом эндометрите предпочтение отдается, как правило, внутриматочному введению антибактериальных препаратов широкого спектра действия в форме эмульсий, суспензий, мазей и растворов. Однако широкое и не всегда рациональное применение антибиотиков и сульфаниламидов нарушает равновесие в эволюционпо сложившихся экологических системах микробных ассоциаций, приводит к увеличению числа бактерионосителей среди животных, изменению микробного пейзажа гениталий животных [1, 3, 8].
Поиск средств и способов, более эффективных, экологически чистых и гипоаллергенных, является
