CC BY
42
УДК 619:616 - 07:616.981.42:636.22/28
перспективность применения дифференциальных экспресс-тестов при диагностике бруцеллеза крупного рогатого скота
Л.В. ДЕГТЯРЕНКО1, доктор ветеринарных наук, зав. сектором
О.Д. СКЛЯРОВ2, доктор ветеринарных наук, зав. отделом
1 Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных, ул. Лермонтова, 93, Омск, 644001, Россия
2Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов, Звенигородское шоссе, 5, Москва, 123022, Россия
E-mail: [email protected]
Резюме. Исследования проводили с целью изучения диагностической ценности реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) и реакции агглютинации пластинчатой (РАП) с молоком при исследовании 8542-х проб молока от коров из хозяйств с различной эпизоотической ситуацией по бруцеллезу. При обследовании 196 животных с заболеваниями молочной железы маститами в клинической и субклинической формах РНГА с молоком и РАП показали себя как специфические реакции, которые обеспечивают получение отрицательных результатов. Исследование молока от 69 глубокостельных коров продемонстрировало возможность использования РНГА при проведении диагностики, тогда как РАП с молоком в таком случае применять нецелесообразно из-за проявления ложноположительных реакций (18,2%) реагирующих. Обследование молока от 1600 коров, не привитых противо-бруцеллезными вакцинами из благополучных по бруцеллезу хозяйств, дало отрицательные показатели РНГА в титре 1:50 и РАП, что указывает на специфичность тестов. Исследование молока от 2876-и коров благополучных и 4378-и гол. неблагополучных по бруцеллезу хозяйств продемонстрировало перспективность применения РНГА и РАП с молоком при контроле эпизоотической обстановки по бруцеллезу и оздоровлении неблагополучных хозяйств через 1 месяц и в последующие сроки после иммунизации животных вакциной из штамма B.abortus 82. В благополучныххозяйствах у коров, иммунизированных вакциной из штамма B. abortus 82, получены отрицательные результаты РНГА и РАП с молоком во все сроки исследований, в том числе ранние - 1-2 месяца после вакцинации. В неблагополучных по бруцеллезу гуртах более высокой диагностической чувствительностью характеризовалась РНГА с молоком - 95,9 % реагирующих от общего количества животных с позитивными результатами тестов с молоком (121), в кольцевой реакции и РАП с молоком величина этого показателя была равна соответственно 79,3 и 69,4%. Несмотря на меньшую чувствительность РАП, тест позволил выявить больных бруцеллезом коров во всех пяти неблагополучных хозяйствах.
Ключевые слова: крупный рогатый скот, бруцеллез, вакцины, иммунизация, диагностика, антигены, антитела. Для цитирования: Дегтяренко Л.В., Скляров О.Д. Перспективность применения дифференциальных экспресс-тестов при диагностике бруцеллеза крупного рогатого скота // Достижения науки и техники АПК. 2015. Т.29. №4. С. 58-60.
В Российской Федерации нерешенной проблемой ветеринарной медицины остается бруцеллез сельскохозяйственных животных. При этом в последние годы в стране наметилась тенденция к ухудшению эпизоотической обстановки по бруцеллезу крупного рогатого скота.
По данным Россельхознадзора в первом квартале 2014 г. было зарегистрировано 135 неблагополучных пунктов по бруцеллезу крупного рогатого скота, во
втором - 292 очага, к 01.10.2014 г. их количество возросло до 567. Больше всего неблагополучных пунктов (507) сосредоточено в Южном и Северо-Кавказском федеральных округах [1]
Недостаточная эффективность проводимых проти-вобруцеллезных мероприятий часто обусловлена не-довыявлением источников инфекции из-за неполного использования диагностических тестов, позволяющих устанавливать специфические иммуноглобулины разных классов на всех стадиях заболевания [2].
Для эпизоотического контроля за благополучием по бруцеллезу крупного рогатого скота необходимы диагностические средства и методы, предпочтительно экспрессные, обеспечивающие своевременную и объективную постановку диагноза у непривитых животных, а также позволяющие на фоне применения противо-бруцеллезных вакцин достоверно дифференцировать больных бруцеллезом животных от здоровых, реагирующих на вакцину.
Поиск эффективных простых, не требующих дорогостоящего оборудования, экспресс-методов выявления бруцеллезных антител в молоке крупного рогатого скота как наиболее доступном биоматериале для проведения исследований имеет большое практическое значение в целях улучшения качества и упрощения диагностики.
Для определения бруцеллеза у непривитого вакцинами крупного рогатого скота за рубежом и в РФ используют кольцевую реакцию (КР) с молоком [3]. Недостаток этого теста - вероятность неспецифических реакций у здоровых особей, одной из причин которых служат маститы в клинической и субклинических формах, в связи с чем таких животных исключают из исследований на бруцеллез[4].
В то же время в благополучных по бруцеллезу стадах мастит может быть обусловлен наличием возбудителя инфекции в молочной железе, в этой связи исключение таких коров из исследования в КР с молоком означает снижение диагностической значимости теста.
Кроме того, к недостаткам кольцевой реакции с молоком следует отнести нестабильность показаний, так как специфические антитела у больных бруцеллезом животных могут находиться в разных долях вымени [5].
Во ВНИИБТЖ и ИЭВСиДВ в предыдущие годы была разработана методика проведения КР с молоком для обследования крупного рогатого скота, привитого вакциной из штамма 82, доказана ее диагностическая и противоэпизоотическая эффективность, однако она до сих пор не регламентирована для применения в производственных ветеринарных лабораториях [6, 7].
В 2006 г. в ветеринарную практику для экспресс-диагностики бруцеллезных антител в сыворотке крови непривитого, а также иммунизированного слабоаг-глютиногенными вакцинами из штаммов B. abortus 82, 75/79 АВ крупного рогатого скота был введен бруцеллезный эритроцитарный диагностикум для РНГА, разработанный ВНИИБТЖ совместно с ДагЗНИВИ и ВГНКИ [8].
Вместе с тем, сведений о чувствительности РНГА при исследовании молока от животных, привитых вак-
циной из штамма B. abortus 82, в разные сроки после иммунизации, недостаточно.
Наиболее простой и экономичный тест, который можно применять в полевых условиях - реакция агглютинации пластинчатая (РАП), но для ее осуществления при исследовании молока необходимо использовать цветной антиген с определенным значением pH с целью предотвращения выпадения молочных белков в кислой среде. Такой способ диагностики был разработан во ВНИИБТЖ [9].
Цель наших исследований - изучить диагностическую ценность РНГА и РАП с молоком при дифференциальной диагностике бруцеллеза у коров, привитых слабоагглютиногенной вакциной из штамма B. abortus 82.
В задачи исследований входило: изучение специфичности РНГА и РАП с молоком, а также определение диагностической значимости тестов при исследовании молока коров из хозяйств с различной эпизоотической ситуацией по бруцеллезу.
Условия, материалы и методы. Постановку и учет КР, РНГА и РАП с молоком осуществляли по разработанным методикам ВНИИБТЖ. При изучении специфичности РНГА и РАП, в сравнительном аспекте с КР, определяли влияние на показание реакций маститов у коров, в том числе обусловленных глубокой стельностью. С этой целью в двух благополучных по бруцеллезу хозяйствах обследовали 518 непривитых противобруцеллезными вакцинами животных, из которых 437 находились в состоянии лактации, 69 были глубокостельными.
Диагностику мастита проводили при постановке пробы с мастидином в соответствии с наставлением по его применению.
Специфичность РНГА с молоком и РАП изучали при исследовании молока от 1600 гол. не привитого противобруцеллезными вакцинами крупного рогатого скота из шести благополучных по бруцеллезу хозяйств Омской области.
Изучение специфичности испытуемых тестов и определение диагностического титра РНГА с молоком осуществляли при обследовании 2046-и коров, привитых вакциной из штамма B. abortus 82, в сроки от 1 до 15 мес. после иммунизации из семи благополучных по бруцеллезу хозяйств Омской области.
Чувствительность РНГА и РАП, в сравнительном аспекте с КР, оценивали при исследовании 4378-и проб молока от коров, привитых вакциной из штамма B. abortus 82, из пяти неблагополучных по бруцеллезу хозяйств Омской области. При этом больными по показаниям КР считали коров, имевших позитивные результаты в разведении молока 1:4 и выше.
Эпизоотическую опасность животных с положительными результатами в РНГА с молоком и РАП определяли при исследовании сыворотки крови и молока в разных серологических реакциях от восьми коров
Таблица. иммунологические реакции у коров из
из трех неблагополучных по бруцеллезу пунктов с постановкой биопробы на 15-и морских свинках. Кроме того, исследовали молоко от пяти коров с помощью ПЦР на базе БУОО «Омская областная ветеринарная лаборатория».
результаты исследований. При изучении возможности использования РНГА с молоком и РАП у лактирующих коров с заболеваниями молочных желез маститом у 196 (44,9%) особей диагностировали мастит в клинической и субклинических формах. Положительные показания КР с цельным молоком установлены у 5,0% коров с наличием маститов, тогда как при использовании РНГА с молоком и РАП результаты были отрицательными.
Изменение физико-химических свойств молока коров в состоянии глубокой стельности привело к тому, что в РАП имели позитивные показатели 18,2% животных, в КР - 27,3%. Более специфичной оказалась РНГА с молоком, положительные результаты в титре 1:50 отмечены только в 1,4% случаев.
Исследование молока от 1600 непривитых противобруцеллезными вакцинами коров дало отрицательные результаты РНГА в титре 1:50 и РАП, что указывает на специфичность этих тестов.
В молоке от 2046 коров из благополучных по бруцеллезу хозяйств, привитых вакциной из штамма B.abortus 82, в ранние (1-2 мес.) и отдаленные (15 мес.) сроки после иммунизации результаты КР в титре 1:4 и РНГА в разведении 1:100, были отрицательными. Лишь в 0,2% случаев в молоке коров регистрировали гемагглютини-ны в РНГА в титре 1:50. В РАП реагирующие животные не обнаружены во все сроки исследований.
При исследовании 4378-и проб молока от животных, привитых вакциной из штамма B. abortus 82, из неблагополучных по бруцеллезу гуртов, комплексом КР+РНГА+РАП выявлена 121 реагирующая особь, в том числе в КР с молоком позитивные результаты имели 96 коров (79,3 %), в РНГА с молоком - 116 (95,9 %), в РАП - 84 (69,4 %). При этом совпадение позитивных показателей КР с молоком и РНГА составляло 96,4%, с РАП - 89,3%.
Несмотря на более низкую чувствительность РАП, в сравнении с КР и РНГА с молоком, необходимо подчеркнуть, что во всех неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах с помощью этого теста были выявлены больные бруцеллезом животные, что подтвердили последующие результаты исследования сыворотки крови от них в реакции агглютинации (РА), реакции связывания комплемента (РСК), РНГА и реакции им-мунодиффузии (РИД).
При изучении эпизоотической опасности коров, реагировавших с испытуемыми антигенами в РНГА и РАП с молоком, установлено, что позитивные результаты в РА и РСК с единым бруцеллезным антигеном имели 100,0% животных, гемагглютинины в сыворотке крови обнаружены у 75,0% гол. (см. табл.). Из восьми живот-неблагополучных по бруцеллезу гуртов
Порядковый номер коров Результаты исследования Выделена культура
сыворотки крови молока
РА (МЕ) РСК 1 РНГА РИД КР РНГА РАП ПЦР
1 - 1:20 1:800 + 1:2 1:100 + + -
2 50 1:10 1:800 + - 1:50 + + -
3 - 1:10 1:100 - - 1:100 - + н/и
4 100 1:80 1:800 + 1:8 1:800 + + +
5 - 1:10 - - - 1:50 + + н/и
6 50 1:5 1:200 - цельн 1:100 + н/и +
7 50 1:40 1:1600 - 1:4 1:400 + н/и +
8 - 1:10 - - - 1:50 - - +
ных, реагировавших в РНГА и РАП с молоком, в 50,0% случаев отмечали высокие титры гемагглютининов (1:800 - 1:1600) в сыворотке крови; у 37,5% регистрировали преципитины в РИД, что свидетельствует об инфекционном статусе этих животных по бруцеллезу.
Положительный результат бактериологического исследования (с постановкой биопробы) получен у четырех коров (66,6%) из шести обследованных этим методом. Изучение биологических свойств изолированных от животных культур бактерий показало, что они имели признаки полевых штаммов бруцелл. Методом ПЦР эпизоотическая опасность животных, реагировавших в РНГА и РАП, установлена в 83,3% случаев.
выводы. Экспресс-тесты РНГА и РАП с молоком обладают специфичностью, на их показания не влияют заболевания лактирующих коров маститами в клинической и субклинических формах. РАП с молоком нецелесообразно применять при исследовании коров в состоянии глубокой стельности из-за проявления ложноположительных реакций (18,2% реагирующих).
Животные, реагирующие в РНГА и РАП с молоком, относятся к числу бруцеллоносителей, что подтвердили результаты бактериологических исследований (66,6 % случаев) и ПЦР с выделением ДНК рода Brucella (83,3% коров).
При обследовании крупного рогатого скота в благополучных по бруцеллезу хозяйствах в ранние (12 мес.) и отдаленные (15 мес.) сроки после вакцинации штаммом B. abortus 82 РНГА и РАП с молоком дают отрицательные результаты, что показывает возможность использования тестов уже через 30 сут. после иммунизации в отличие от РА и РСК с сывороткой крови, которые применяют не ранее 6 мес. после прививки.
При исследовании молока от коров в неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах более высокую чувствительность, в сравнении с КР и РАП, имеет РНГА с молоком (95,9% реагирующих). Несмотря на меньшую чувствительность РАП (69,4% реагирующих), тест позволяет выявлять больных бруцеллезом коров во всех неблагополучных хозяйствах.
РНГА и РАП с молоком перспективны для применения в качестве рекогносцировочных тестов при контроле эпизоотической обстановки по бруцеллезу на непривитых противобруцеллезными вакцинами животных, а также иммунизированных слабоагглюти-ногенными вакцинами в благополучных по бруцеллезу хозяйствах и при оздоровлении неблагополучных стад с целью выявления коров с локализацией возбудителя инфекции в молочной железе.
Литература.
1. Эпизоотическая ситуация в РФ в 2014 г. URL: http://www. fsvps.ru/fsvps-docs/ru/iac/rf/report 2quater.pdf (дата обращения 24.02.2015)
2. Жанбырбаев М.Ж. Сравнительное изучение методов диагностики бруцеллеза животных// Материалы междунар. конф., посвящ. 80-летию Самарской НИВС Россельхозакадемии. Самара: ООО «Матрикс», 2009. С. 155-158
3. Наставление по диагностике бруцеллеза животных; утв. Департаментом ветеринарии Министерства сельского хозяйства Российской Федерации 29 сентября 2003 г. № 13-5-02/0850: ФГМУ «Росинформагротекс». - М., 2003 - 64 с.
4. Silva, Junior F.F. Evolution of the ring test in an epidemiological surveillance of bovine brucellosis in herds and dairies// Arg. Brasil. Med. Veter. Zootech. 2007. V. 9. № 2. P. 295-300.
5. Лазарев Н.П. Кольцевая реакция с молоком и с сывороткой крови для диагностики бруцеллеза // Ветеринария. 1968. № 4. С. 98-99.
6. Диагностическая эффективность кольцевой реакции с молоком при бруцеллезе у коров, привитых вакциной из штамма 82/И.А. Косилов, С.К. Димов, Л.В. Дегтяренко, Г.В. Разницына, П.К. Аракелян, А.Г. Хлыстунов//Вопросы эпизоотологии, диагностики и мероприятия по ликвидации туберкулеза и бруцеллеза животных. Новосибирск: РПО СО ВАСХНИЛ. 1987. С. 87-91.
7. Гольцов А.С. Кольцевая реакция с молоком при ранней диагностике бруцеллеза у коров, реиммунизированных вакциной из штамма 82 // Пути совершенствования профилактики и диагностики бруцеллеза сельскохозяйственных животных. Омск: РПО СО РАСХН, 1990. С. 39-42.
8. Инструкция по применению набора для серологической диагностики бруцеллеза крупного и мелкого рогатого скота в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА). Москва: ООО «Научно-информационный Производственно-коммерческий центр «Восход-А», 2006. 11 с.
9. Пат. 2491545 РФ. МПК G01N 33/04. Способ диагностики бруцеллеза / Дегтяренко Л.В., Гордиенко Л.Н.; заявитель и патентообладатель: Всерос. науч. ин-т бруцеллеза и туберкулеза животных. - №2012119605; заявл. 11.05.2012; опубл. 27.08.2013, Бюл. № 24
availability of application of differential express tests in diagnostics
of brucellosis of cattle
L.V. Degtyarenko1, O.D. Sklyarov2
'All-Russian Research Institute of Brucellosis and Tuberculosis of Animals, Lermontova str., 93, Omsk, 644001, Russia 2All-Russian State Center of Quality and Standardization of Medicines for Animals and Feed, Zvenigorodsky highway, 5, Moscow, 123022, Russia
Summary. The aim of the investigation was to study the diagnostic value of the reaction of indirect hemagglutination (RIHA) and of lamellar agglutination (RLA) with milk in testing of 8542 milk samples from cows from farms with different epizootic situation on brucellosis. The examination of 196 animals with diseases of mammary gland in clinical and subclinical forms identified that RIHA with milk and RLA were specific reactions, which secure negative results. The investigation of milk from 69 pregnant cows presented the possibility of RIHA usage in diagnostics, whereas it is inexpedient to use RLA with milk due to appearance of false-positive reactions (18.2 %). In the examination of milk from 1600 cows not vaccinated with anti-brucellosis vaccines from clear of brucellosis farms there were negative exponents of RIHA in titer 1:50 and RLA, which indicates the specificity of the tests. The investigation of milk from 2876 cows from clear of brucellosis farms and 4378 cows from problem farms presented the availability of application of RIHA and RLA with milk during the control of epizootic situation on brucellosis and sanitation of problem farms in 1 month and subsequent periods after immunization of cattle with vaccine from strain B. abortus 82. In clear farms in cows, immunized with vaccine from strain B. abortus 82, there were obtained negative results of RIHA and RLA with milk in all terms of studies, including early dates - 1...2 months after vaccination. RIHA with milk had higher diagnostic sensitivity in problem herds, 95.9 % reacting cows of the total population of animals with positive results of tests with milk (121), in Ring test and RLA with milk this value is 79.3 % and 69.4 %, respectively. In spite of the lower sensitivity of RLA this test identified cows sick of brucellosis in all five problem farms. Keywords: cattle, brucellosis, vaccines, immunization, diagnosis, antigens, antibodies.
Author Details: L.V. Degtyarenko, Dr. Sc. (Vet.), Head of Sector (e-mail: [email protected]), O.D. Sklyarov, Dr. Sc. (Vet.), Head of Department
For citation: Degtyarenko L.V., Sklyarov O.D. Availability of application of differential express tests in diagnostics of brucellosis of cattle. Dostizheniya nauki i tekhnikiAPK. 2015. T.29. №4. pp. 58-60 (In Russ)
