CC BY
83
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
DOI 10.25930/2687-1254/009.4.14.2021 УДК 638.132
ПЫЛЬЦЕВОЙ АНАЛИЗ МЕДА ПО ИЗМЕНЕННОЙ МЕТОДИКЕ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПРЕПАРАТА
Качество собираемого пчелами меда зависит от вида медоносной растительности. В литературе имеются сведения, характеризующие медоносные растения, их фенологию и посещаемость пчелами. Эти исследования обладают ограниченностью и недостаточной объективностью, не дают реального представления о качестве собранного и накопленного в улье меда,по результатам анализа которого с большой долей вероятности можно оценить его натуральность, флористическое и географическое происхождение, выявить наличие всевозможных примесей, наличие пыльцевых зерен ядовитых растений, способных вызвать токсичное влияние на организм человека и т.д.Нами в рамках изучения ботанического происхождения тверских медов отработана собственная методика приготовления препаратов из меда для его микроскопического исследо-вания,имеющая преимущества над другими.
Ключевые слова: мед, пыльца, препарат, пыльцевой анализ, собственная методика.
The quality of honey, which is collected by bees, depends on the type of melliferous plants. There is some information in publications which characterizes melliferous plants, their phenology and bee attendance. These studies have limited and insufficient objectivity. They do not give a true picture of the quality of the collected and accumulated honey in the hive. With the help of its analysis, it is possible to assess its naturality, floristic and geographical origin, to reveal the presence of all kinds of impurities and pollen grains of poisonous plants which can cause toxic effect on the human body, etc. with a high degree of probability. Within the study of the botanical origin of Tver honeys, we have developed our own method of specimen preparation from honey for its microscopic examination, which has advantages over other ones.
Key words: honey, pollen, specimen, pollen analysis, own method.
О. А. Лёгочкин, Н. П. Сударев
POLLEN ANALYSIS OF HONEY ACCORDING TO THE MODIFIED METHOD OF SPECIMEN PREPARATION
O.A. Lyogochkin, N.P. Sudarev
Введение. Продуктивность пчелиных семей, качество собираемого ими меда находятся в прямой зависимости от видового состава медоносной растительности[1,2]. Большое количество исследований проведено в сфере изучения характеристик медоносных растений, фенологии их цветения, степени посещаемости пчелами[3]. Однако, несмотря на безусловную значимость этих исследований, они имеют некоторую ограниченность и недостаточную объективность, так как наиболее реальное представление о медоносной и пыльценосной ценности растений возможно получить только на основе анализа накопленного в ульях меда и перги, установления их точного ботанического происхождения[4,5]. В данном случае наибольшую ценность приобретает микроскопический анализ меда, направленный на изучение содержащейся в нем пыльцы (пыльцевой анализ). По результатам анализа с большой долей вероятности можнооценить его натуральность, флористическое и географическое происхождение, выявить наличие всевозможных примесей, в том числе и падевых, наличие пыльцевых зерен ядовитых растений, способных вызвать токсичное влияние на организм человека и т.д.[6,7].
Материал и методы исследования. В условиях базирования пчеловодства на естественных кормовых источниках, а именно на дикорастущих медоносах, важное значение приобретают методики, направленные на их выявление и всестороннее изучение. Для проведения пыльцевого анализа меда необходимо приготовление препарата для микроскопического исследования. Данная методика подробно описана в литературе, в частности в справочном издании Бурмистрова А.К. и Никитиной В.А. «Медоносные растения и их пыльца» [8]. Приготовление препарата из меда обычно проводят по методике А. Маурицио и Ж. Луво[9]: 10 гмеда заливают 20 мл холодной дистиллированной воды и ставят в водяную баню с температурой + 45°С до полного растворения меда. Затем раствор центрифугируют в течение 10-15 мин со скоростью 2 500-3 000 об/мин. После чего жидкость сливают, а осадок платиновой петлей переносят на предметное стекло. После просыхания капли пыльцу фиксируют 96-процентнымспиртом,окрашенным фуксином. Далее препарат заливают каплей разогретого глицерин-желатина и накрывают покровным стеклом.
Нами на базе РГАУ - МСХА им. К.А.Тимирязева и Тверской лаборатории разведения сельскохозяйственных животных ФГБНУ ВНИИплем в рамках изучения ботанического происхождения тверских медовотработана методика приготовления препаратов из меда для его микроскопического исследования, несколько отличающаяся от описанной выше и имеющей преимущества перед ней.
Результаты исследования и их обсуждение. Для определения видовой принадлежности меда необходимо провести тщательное изучение всего пыльцевого спектра препарата, идентифицировать пыльцевые зерна по принадлежности к тем или иным семействам, родам и видам растений. Пыльцевые зерна в медовом препарате могут располагаться под различным ракурсом, что усложняет их идентификацию. Некоторые растения одних видов имеют пыльцевые зерна,похожие по своим очертаниям и размерам с другими и даже неродственными им по семействам, не говоря уже о схожести-пыльцы многих растений одного и того же рода. Все это в значительной степени усложняет работу исследователя. Для достоверного определения отличий пыльцевых зерен при микроскопическом анализе должно быть ясное и четкое изображение данных зерен в окуляре микроскопа на одной глубине резкости. Необходимо проводить сравнение одного пыльцевого зерна с другими, не подстраивая резкость на каждое пыльцевое зерно в отдельности. При этом исследование препарата должно проводиться на достаточно большом увеличении: в 400, 600 и 1 000 раз, для того чтобы изучить не только
форму пыльцевого зерна, но его скульптуру и текстуру, апертуры и меж апертурные участки, борозды, поры, и т.д. В ходе проведения такой кропотливой работы, пользуясь препаратом, подготовленным по описанной выше методике, мы сталкиваемся с существенным недостатком. После нанесения пыльцевого осадка, полученного после центрифугирования, на предметное стекло и его высыхания мы имеем достаточно толстый слой субстанции, в которой на разной глубине находятся пыльцевые зерна, несмотря на распределение ее по предметному стеклу тонким слоем. В процессе исследования такого препарата, особенно при большом увеличении, приходиться подстраивать резкость на каждое находящееся в объективе пыльцевое зерно в отдельности, при этом изображение других пыльцевых зерен начинает расплываться или вообще исчезает из поля зрения. Данное обстоятельство не дает возможность увидеть четкую картинку, на которой очертания и мелкие детали всех пыльцевых зерен видны сразу на одной глубине резкости, что очень сильно затрудняет работу с препаратом.Данный недостаток возникает по причине высокой концентрации сахара в капле нанесенного на предметное стекло осадка, которая после высыхания будет иметь достаточно толстый слой.
В процессе длительной работы по изучению ботанического происхождения медов, связанного с идентификацией огромного количества пыльцевых зерен, мы опытным путем выработали свою методику приготовления препарата, в основе которой, конечно, лежит классическая методика, описанная выше. Для приготовления препарата берем 10 г меда, растворяем в 20 мл дистиллированной воды. Раствор меда распределяем поровну в две пробирки - получается около 13-14 мл в каждой. Пробирки с раствором центрифугируем в течение 10-15 мин. После этого из каждой пробирки осторожно сливаем надосадочную жидкость, но не полностью, оставляя на дне по 1-2 мл. Далее в одну из пробирок вливаем около 10-15 мл дистиллированной воды и энергично взбалтываем таким образом, чтобы осадок, находящийся на дне пробирки, полностью перемешался с водой. Содержимое данной пробирки переливаем в другую, где также оставался отцентрифугированный осадокс небольшим количеством надосадочной жидкости. После проведения объединения таким образом обоих осадков в одной пробирке раствор вновь подвергаем центрифугированию на протяжении 10-15 мин со скоростью 2500-3000 об/мин. Затем осторожным движением полностью сливаем жидкость, перевернув пробирку вертикально открытым концом вниз. После возвращения пробирки в положение открытым концом вверх через незначительное время внутрь пробирки с ее стенок сползет незначительное количество влаги в виде капли, достаточной для проведения исследования. Разместив пробирку на подставке, вносим в нее пипеткой две капли 96-процентного спирта, подкрашенного фуксином, и легким постукиванием по пробирке (или иным способом) добиваемся перемешивания содержимого на дне - осадка из пыльцы, надосадочной жидкости и спирта с фуксином. Удлиненной пипеткой втягиваем в нее содержимое со дна пробирки (все без остатка), после чего содержимое полностью распределяем на двух предметных стеклах(по 2-3 капли на каждом). Затем тонкой препаровальной иглой жидкость на предметном стекле аккуратно распределяем по диаметру, соответствующему нашему покровному стеклу, и оставляем для высыхания. Высушенный препарат заливаем разогретым глицерин-желатиномследующим обра-зом:разогретый в водяной бане глицерин-желатиннаносим стеклянной палочкой в виде капли на середину покровного стекла, которую затем быстро распределяем в виде креста. Подготовленное таким образом покровное стекло быстро и осторожно накладываем на объект наблюдения на предметном стекле и придавливаем пальцем до застывания. Суть проведенного изменения традиционной методики сводится к тому, что мы в
процессе второго центрифугирования снижаем концентрацию сахара в исследуемом осадке до минимума. Это позволяет распределиться всем пыльцевым зернам после высыхания осадка на предметном стекле на одном уровне. При изучении такого препарата мы имеем в микроскопе картинку, где все пыльцевые зерна, не зависимо от кратности увеличения, располагаются на одной глубине. При одной и той же резкости очертания всех пыльцевых зерен просматриваются очень четко, благодаря чему все их морфологические различия хорошо видны. Добавление спирта с фуксином непосредственно в пробирку способствует полному и равномерному окрашиванию пыльцевых зерен, что также положительно влияет на качество полученного препарата. Кроме того, при условии использования одного и того же количества спирта (в нашем случае две капли) с красителем определенной концентрацииможно косвенно указать на высокое или низкое количество пыльцевых зерен в препарате. Чем ярче окрашены пыльцевые зерна, тем меньше их количество, и, наоборот, в препаратах, приготовленных из меда с высокой концентрацией пыльцевых зерен, они имеют бледную окраску. При изучении препаратов, приготовленных из медовых образцов по такому принципу, мы можем сравнивать их по степени окрашивания, выделять более или менее насыщенные пыльцой, не прибегая к ее пересчету. Приготовленный из медового образца центрифугат пыльцы мы полностью, без остатка, распределяем на два стекла и подвергаем исследованию, поэтому почти вся пыльца, содержащаяся в 10 г меда, попадает под объектив нашего микроскопа.
Заключение.На протяжении ряда лет нами исследовано по данной методике более 1000 образцов меда из тверской области и других регионов[2].В каждом из них проведена идентификация от 500 до 1 500 пыльцевых зерен. Качество проведения пыльцевого анализа напрямую зависит от качества приготовленного препарата для исследования. Описанный нами способ приготовления препаратов для проведения пыльцевого анализа медов как раз позволяет получить препарат соответствующего качества, работа с которым позволит провести не только точное научное исследование, но и доставит истинное эстетическое удовольствие, о чем свидетельствуют прилагаемые фотографии (рис. 1-6).
• -4
• %
V
Рис. 1. Зерна пыльцы ивы, черники и растения семейства зонтичные при 1 000-кратном увеличении
Рис. 2. Пыльцевые зерна ивы, рябины, клевера, растений семейства зонтичные и ели европейской при 400-кратном увеличении
Рис. 3. Зерна пыльцы василька лугового, ивы, сныти, лабазника, растения семейства розоцветные при 400-кратном увеличении
Рис. 4. Зерна пыльцы красного клевера, ивы и сныти при 1 000-кратном увеличении
Рис. 5. Зерна пыльцы бодяка, василька синего и лугового, золотарника и др. растений при 400-кратном увеличении
гкч^Д
В
Рис.6. Зерна пыльцы ивы, золотарника, бодяка и рябины при 1 000-кратном увеличении
Литература
1. Лавренов В.К. Все о меде и других продуктах пчеловодства: Энциклопедия. М., 2004. С. 77-103.
2. Маннапов А.Г., Лёгочкин О.А., Скачко А.С. Коэффициент пыльцевого анализа при оценке батанического происхождения мёда // Пчеловодство. 2017. №6. С.55-59.
3. Кривцов Н.И., Лебедев В.И., Родионова В.А., Чупахина О.К. Пчелы бесценные дары. М., 2005.С.67-70, 103-107.
4. Атлас пыльцевых зёрен / И.В. Карпович, Е.С. Дребезгина, Е.А. Еловикова, Г.И. Ле-готкина и др. Екатеринбург. 2015. 320с.
5. Курманов Р.Г., Ишбирдин А.Р. Пыльцевой атлас. Уфа, 2013. 304с.
6. Маннапов А.Г., Антимирова О.А. Пчеловодство. М. РГАУ-МСХА. 2012. С. 196200.
7. Sawyer R. Honey identification; Cardiff Academic Press, Cardiff, U.K., 1988.Р.115. 72
8. Бурмистров А.Н., Никитина В. А. Медоносные растения и их пыльца. М. 1990. С. 3 - 12.
9. Demianowicz Z. Beitrag zur Pollenanalyse der Lindenhonige // Zeitschrift fur Bienenforschung, 9, 1968. р. 185 - 195.
References
1. Lavrenov V.K. All about honey and other beekeeping products: Encyclopedia. - M., 2004. P.77-87,103.
2. Mannapov A.G., Legochkin O.A., Skachko A.S. Pollen analysis coefficient in assessing the botanic origin of honey // Bee breeding. - 2017. - No. 6. P.55-59.
3. Krivtsov N.I., Lebedev V.I., Rodionova V.A., Chupakhina O.K. Bees are priceless gifts. -M., 2005. P. 67-70, 103-107.
4. Karpovich I.V., Drebezgina E.S., Elovikova E.A., Legotkina G.I., Zubova E.N., Kuziaev R.Z., Khismatullin R.G. Pollen grains atlas. - Yekaterinburg, 2015.320p.
5. Kurmanov R.G., Ishbirdin A.R. Pollen atlas. - Ufa, 2013.304p.
6. Mannapov A.G., Antimirova O A. Bee breeding. - M. RSAU - MTAA, 2012, P. 196-200.
7. Sawyer R. Honey identification; Cardiff Academic Press, Cardiff, U.K. 1988, P. 115.
8. Burmistrov A.N., Nikitina V.A. Honey plants and their pollen. - M., 1990.P. 3 - 12.
9. Demianowicz Z. Beitrag zur Pollenanalyse der Lindenhonige // Zeitschrift fur Bienenforschung, 9, 1968. p. 185 - 195.
Лёгочкин Олег Анатольевич, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Тверской лаборатории разведения сельскохозяйственных животных Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Всероссийский научно-исследовательский институт племенного дела», Московская область, Пушкинский р-н, п/о Лесные Поляны, ул. Ленина, 13. тел./факс: +7(495)515-95-57.
Сударев Николай Петрович, доктор сельскохозяйственных наук, профессор кафедры биологии животных и зоотехнии ФГБОУ ВО Тверская ГСХА, главный научный сотрудник Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Всероссийский научно-исследовательский институт племенного дела», Московская область, Пушкинский р-н, п/о Лесные Поляны, ул. Ленина, 13., тел./факс: +7(495)515-95-57.
Oleg Anatolyevich Lyogochkin, Candidate of Biological Sciences, Senior Researcher of the Tver Laboratory of Breeding Farm Animals, FSBSI "All-Russian Research Institute of Animal Breeding", Moscow Region, Pushkinsky District, Lesnye Polyany, Lenin st., 13. tel./fax: +7 (495) 515-95-57.
Sudarev Nikolai Petrovich, Doctor of Agricultural Sciences, Professor of the Department of Animal Biology and Animal Science, FSBEI of Higher Education "Tver State Agricultural Academy", Chief Researcher of the FSBSI "All-Russian Research Institute of Animal Breeding", Moscow Region, Pushkinsky District, Lesnye Polyany , Lenin st., 13., tel./fax: +7 (495) 515-95-57.
