CC BY
6О.Ю. Урбанович, П.В. Кузмицкая
ПЦР-ОСНОВАННОЕ КЛОНИРОВАНИЕ ГОМОЛОГА ГЕНОВ HcrVf ИЗ ГЕНОМА ГРУШИ СОРТА ПАМЯТЬ ЯКОВЛЕВА
ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, Академическая, 27
Введение
Груша является одной из ведущих плодовых культур умеренного пояса. По данным FAO, объем производства плодов груши в 2010 г. составил более 22 млн. т., заняв второе место после яблони среди плодовых. В настоящее время груша рассматривается как важный экспортный вид в садоводстве Республики Беларусь, так как в мире постоянно растет спрос на ее свежие плоды. При выращивании этой культуры плодоводы сталкиваются с рядом проблем, среди которых важное место занимает распространение различных инфекций. Одним из наиболее опасных заболеваний груши в промышленных садах является парша обыкновенная, вызываемая грибными патогенами рода Venturia. Сорта груши могут поражаться двумя видами Venturia. Уссурийская груша (P. ussuriensis Maxim.), груша Бретшнейдера (P bretschneideri Rehd.) и груша грушелистная (японская) (P pyrifolia Naka) восприимчивы к V. nashicola, а европейская груша (P communis L.) - к V. pirina Aderh. [1, 2]. Интенсивному размножению патогена способствует высокая влажность воздуха, характерная для Беларуси. Особенно широко болезнь распространяется в дождливое лето. На пораженных паршой плодах и листьях возникают темные бархатистые пятна, при сильном поражении дерева его плоды трескаются, а листья осыпаются. По данным разных авторов, потери урожая, вызванные данным заболеванием, могут составлять до 50-70%. Помимо этого, пораженные паршой деревья менее морозостойки.
Существует несколько методов защиты растений от этого заболевания. Наиболее распространенным является химический способ, при котором происходит обработка деревьев фунгицидами, причем число таких обработок может достигать 15 в год. Недостатки этого способа очевидны - высокая трудоемкость, дороговизна, загрязнение окружающей среды и повышение содержания ксенобиотиков в плодах.
Большинство возделываемых в Европе сортов груши являются в той или иной степени восприимчивыми к парше [3]. Поэтому в селекции груши приоритетным становится направление по созданию высокопродуктивных сортов, имеющих генетическую устойчивость к парше в сочетании с хорошим качеством плодов [4]. С этой целью ведется направленный поиск аллельных форм генов в геномах невосприимчивых сортов, обеспечивающих такую устойчивость, для последующего использования их в селекционном процессе.
По имеющимся в литературе сведениям, в формировании устойчивости к различным возбудителям немаловажную роль играют R-гены. Устойчивость, определяемая этими генами, обеспечивается реакцией гиперчувствительности, ведущей к гибели зараженной клетки, что препятствует дальнейшему распространению патогена. Продукты R-генов являются рецепторами, взаимодействующими с белками, кодируемыми Avr-генами патогена. Такое взаимодействие запускает сигнальный каскад, в результате которого активируется система защиты растений от патогена [5].
Среди растений первый кластер R-генов, названный С/, был найден у томата. Гены этого кластера обеспечивают устойчивость томата к Cladosporium fulvum [6, 7]. Впоследствии гомологичные области были описаны у многих растений, находящихся довольно далеко от томата в эволюционном отношении. Среди ближайших родственников Ругш лучше всего изучен геном яблони. Для яблони был описан //-кластер R-генов [8]. Первичное заключение о функции генов кластера было сделано на основе гомологии с генами С/ кластера томата, позже его подтвердили экспериментально [8, 9]. //-гены наследуются как доминантные. Способ доминирования - неполный, так как гомозиготы по этим генам обычно более устойчивы по сравнению с гетерозиготами. Предполагают, что степень выраженности
реакции растения на проникновение патогена может зависеть от других генов того же кластера, а также от генов-модификаторов [9].
Геном груши и яблони имеет много общего в структуре и организации [10, 11]. Их нуклеотид-ные последовательности идентичны на 96,35% [12]. Высока вероятность того, что геном груши
также содержит гены устойчивости к парше, гомологичные ИегУ/генам яблони, которые могут обладать функциональной активностью. В связи с этим, целью данного исследования являлось выделение из генома устойчивого к парше сорта груши последовательности, гомологичной ИегУ/генам яблони, и анализ ее структуры.
Материалы и методы
Исследования проводились на двух различных генотипах груши, один из которых - Память Яковлева - являлся устойчивым, в то время как второй - сортообразец 90-39/65 - восприимчивым. Образцы груши получены из питомника РУП «Институт плодоводства». Поиск полиморфизма между исследуемыми генотипами проводили при помощи ДНК-маркеров к Vf-генам яблони. Предположительный гомолог одного из генов Vf-кластера яблони был найден в геноме устойчивого сорта груши Память Яковлева с помощью праймеров FD5for (5'-ATGGAGAGA-ACCATGAGAGTTG-3') и FD5rev (5'-TACTG-GCATATTCGTCGCAG-3'), амплифицирующих открытую рамку считывания гена hcrVf2, придающего устойчивость видам рода Malus к возбудителю парши яблони V inaequalis [13]. Амплификацию проводили в соответствии с [13]. Остальные маркеры, использованные в исследовании, не выявили полиморфизма между изучаемыми генотипами (данные не представлены).
Полученный продукт амплификации размером около 3000 п.н. после электрофоре-тического разделения был выделен из геля с использованием GeneJet™ Gel Extraction Kit
Результаты
Сорт груши Память Яковлева характеризуется высокой устойчивостью к парше. Он был получен в результате скрещивания сорта Тёма с французским сортом Оливье де Серр. Сорт Тёма представляет собой межвидовой гибрид сорта европейской груши Финляндская желтая с уссурийской грушей.
Для выделения гомологов семейства генов HcrVf из генома груши был использован метод ПЦР-основанного клонирования. В результате амплификации с праймерами FD5, ограничивающими открытую рамку считывания генов-гомологов HcrVf яблони, в геноме устойчивого к парше сорта груши Память Яковлева выявлялся фрагмент длиной 3081 п.н. У восприим-
(Thermo scientific (EC)) согласно протоколу производителя. Клонирование в плазмиду pTZ57R/T и последующую трансформацию E. coli DH5a проводили с помощью Ins TA-cloneTM PCR Cloning Kit (Thermo scientific (EC)) согласно рекомендациям производителя. После выращивания на LB-Amp среде из трансформантов выделяли плазмидную ДНК, используя Plasmid GeneJet™ Miniprep Kit (Thermo scientific (EC)). Фрагмент, встроенный в плазмидную ДНК, секвенировали с помощью праймеров к последовательности полилинкера вектора pTZ57R/T М13 и специально выбранных внутренних праймеров к исследуемой ну-клеотидной последовательности. Для проведения реакции использовали BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems). Амплификацию для секвенирования и очистку полученных продуктов амплификации проводили в соответствии с методикой производителя. Компьютерный анализ полученной ну-клеотидной последовательности выполняли с помощью программного обеспечения, предоставленного на сайте NCBI (http://www.ncbi. nlm.nih.gov) и программы Geneious 4.7.6.
и обсуждение
чивого образца 90-39/65 данный фрагмент отсутствовал. Фрагмент был клонирован и затем секвенирован в прямом и обратном направлении с помощью дополнительных праймеров к его внутренней части. Последовательность получила название PVfl (номер доступа в GenBank - KC806058). Сравнение нуклеотидной последовательности PVfl с базой данных GenBank показало, что она гомологична последовательностям кластера генов яблони HcrVf (табл. 1). В частности, степень идентичности последовательности PVfl из генома груши и последовательности гена яблони HcrVf2, который участвует в формировании устойчивости к парше, составляет 93,1%.
Таблица 1
Степень идентичности нуклеотидной последовательности PVf1 с последовательностями семейства генов яблони HcrVf
Номер доступа в GenBank Название гена Источник гена Длина последовательности Процент попарной идентичности E Value
AJ297739 hcrvfl Malus floribunda 1109 92,5 0
AJ297740 hcrvf2 Malus floribunda 1822 93,1 0
AJ297741 hcrvß Malus floribunda 1929 93,1 0
Поиск по базе данных Plant Resistance Genes (http://prgdb.crg.eu/), содержащей более 16 000 известных и гипотетических R-генов 192 видов растений, отвечающих за устойчивость к 115 различным патогенам, также выявил гомологию изучаемой последовательности с R-генами других растений.
Нуклеотидная последовательность PVfl содержит открытую рамку считывания длиной в 3036 п.о., которая была транслирована в последовательность гипотетического белка размером в 1012 аминокислотных остатков. Известно, что R-гены растений кодируют продукты, участвующие в распознавании Avr-белков патогена. По своей структуре они представляют собой достаточно гетерогенную группу, в которой выделяют 7 классов в зависимости от присутствия определенных структурных мотивов. Чаще всего в структуре белков, кодируемых R-генами, отмечают протеинкиназные каталитические домены и вариабельное число лейцин-богатых повторов (LRR). LRR участвуют в связывании лигандов за счет белок-белковых взаимодействий. Клеточная локализация белковых продуктов R-генов различна. Часть из них является цитоплазматическими белками (некоторые - прикрепленными к цитоплазмати-ческой мембране), в то время как другие представляют собой рецептороподобные структуры, имеющие внеклеточный, трансмембранный и внутриклеточный домены [14].
Поиск консервативных доменов в последовательности исследуемого гипотетического белка с помощью базы данных консервативных доменов NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/ wrpsb.cgi) выявил в нем следующие структуры:
1. N-концевой домен лейцин-богатого повтора - короткий мотив, присутствующий во многих белках с различными функциями и
клеточной локализацией. Этот домен часто встречается на N-конце тандемных лейцин-богатых повторов [15].
2. LRRRI - лейцин богатые повторы (LRRs) из подсемейства рибонуклеаз-подобных ингибиторов (RI). Представляют собой мотивы из 20-29 остатков. Такие структуры присутствуют во многих белках, вовлеченных в белок-белковые взаимодействия с различными функциями и клеточной локализацией. LRRs соответствуют структурной единице, состоящей из бета-цепи и альфа-спирали. Исследуемая последовательность гипотетического белка состоит из 12 цепей, соответствующих 11 полным повторам. Подобные структуры присутствуют в подсемействе белков, активирующих ГТФазу Ran (RanGAPl) [16, 17].
Примечательно, что при поиске консервативных доменов в аминокислотной последовательности белка Hcrvf2 были найдены эти же структуры (рис. 1).
Интересно отметить, что сходные R-генам структуры присутствуют и в геноме животных. Была найдена гомология между белками, кодируемыми R-генами, и белками-регуляторами апоптоза в клетках животных, что указывает на консервативность реакции на проникновение патогена у эукариотических организмов [18].
В настоящее время активно ведутся работы по поиску новых генов, формирующих устойчивость плодовых культур к парше. К кандидатам на роль таких генов у яблони относят последовательности, предположительно кодирующие рецептороподобные белки, серии генов MAM, выделенные посредством ПЦР-основанного клонирования из генома M. micromalus, и серии генов MAB, выделенные из геномаM. baccata [19]. Эти последовательности, как видно из рис. 2, гомологичны PVfl.
Последовательность белка
Hctvü
Суперсемейства
1 125 250 375 500 625 750 875 980
Субстрат-связывающий сайт Лейцин-богатые повторы
Субстрат-связывающий сайт Лейцин-богатые повторы Субстрат-связывающий сайт Лейцин-богатые повторы
[ Суперсемейство LRR_RI ] ^ Суперсемейство LRR_Rl)
Суперсемейство LRR_RI
Последовательность гипотетического белка PVf1
Суперсемейства
1 125 250 375 500 625 750 875 1012
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 lili
Субстрат-связывающий сайт Лейцин-богатые повторы
Субстрат-связывающий сайт Лейцин-богатые повторы
|lrrnt|
Суперсемейство LRR_RI
1 Суперсемейство LRR_RI
Рис. 1. Консервативные домены белка Hcrvf2 и гипотетического белка PVf1
-^ Ricinus communis serine- threonine protein kinase, plant type, putative, mRNA
— >Gossypium barbadense verticillium wilt resistance- like protein (Vd1) mRNA, complete cds > Ricinus communis serine- threonine protein kinase, plant-type, putative, mRNA Ricinus communis serine/threonine- protein kinase bri1, putative, mRNA
Ricinus communis serine- threonine protein kinase, plant-type, putative, mRNA
Ricinus communis serine- threonine protein kinase, plant-type, putative, mRNA IJ Vitis vinifera contig VV78X265740.12, whole genome shotgun sequence j Vitis vinifera contig VV78X265740.13, whole genome shotgun sequence Vitis vinifera contig VV78X242445.23, whole genome shotgun sequence
-> Vitis vinifera contig VV78X034071.9, whole genome shotgun sequence
I-J PREDICTED: Glycine max uncharacterized protein LOC 100777881 (LOC 100777881), mRNA
^_y PREDICTED: Glycine max uncharacterized protein LOC 100784241 (LOC 100784241), mRNA
PREDICTED: Glycine max probable leucine-rich repeat receptor-like protein kinase At1g35710-like (LO...
PREDICTED: Vitis vinifera probable LRR receptor-like serin. Vitis vinifera, whole genome shotgun sequence, config VV7. Vitis vinifera, whole genome shotgun sequence, con.. Vitis vinifera config VV78X032908.3, whole genome shotgun sequence Populus trichocarpa predicted protein, mRNA
PREDICTED: Vitis vinifera LRR receptor-like serine/threonine-protein kinase G502-like (..
J Vitis vinifera config VV78X123832.6, whole genome shotgun sequence -J Malus floribunda clone HB06-As HB06p gene, complete cds
-J Malus floribunda clone HB06-Bs Vf apple scab resistance protein HcrVf2-like gene, complete sequence
y Malus floribunda clone HB01s Vf apple scab resistance protein HcrVf2-like gene, complete sequence > Malus floribunda clone AM19 5s Am19 5p gene, complete cds ^Malus floribunda clone Hb04s HB04p gene, complete cds — J Malus x domestica clone ANT4 receptor-like protein gene, partial cds
J Malus floribunda clone AL07-3Bs Vf apple scab resistance protein HcrVf2-like gene, complete sequence Malus floribunda clone HB09s HB09p gene, complete cds Malus floribunda clone HB03s HB03p gene, complete cds Malus floribunda clone AL07-2As Al07 2p gene, complete cds Malus x domestica clone PIN16 receptor-like protein gene, partial cds Malus sieversii clone MAS41 receptor-like protein gene, partial cds Malus floribunda clone M18S-5As M18-S5p gene, complete cds Malus floribunda clone M18S-3As M18S-3Ap gene, complete cds Malus floribunda clone M18S-6As M18S-6p gene, complete cds Malus floribunda hcrVf1 gene
Malus floribunda clone M18S-3Bs M18-S3Bp gene, complete cds
-J Malus floribunda clone M18S-5Bs Vf apple scab resistance protein HcrVf2-like gene, complete sequence
Malus floribunda hcrVf2 gene
Malus micromalus clone MAM31 receptor-like protein gene, partial cds Malus baccata clone MAB12 receptor-like protein gene, partial cds Malus baccata clone MAB10 receptor-like protein gene, partial cds Malus micromalus clone MAM16 receptor-like protein gene, partial cds Malus micromalus clone MAM16 receptor-like protein gene, partial cds Malus sieversii clone MAS1 receptor-like protein gene, partial cds Malus x domestica clone ANO9 receptor-like protein gene, partial cds Malus x domestica clone PIN18 receptor-like protein gene, partial cds Malus x domestica clone GAL5 receptor-like protein gene, partial cds Malus x domestica clone APO1 receptor-like protein gene, partial cds Malus x domestica clone APO21 receptor-like protein gene, partial cds Malus floribunda clone M18-6Cs HcrVft gene, complete cds Malus micromalus clone MAM4 receptor-like protein gene, partial cds Malus micromalus clone MAM13 receptor-like protein gene, partial cds Malus floribunda hcrVf3 gene
Malus micromalus clone MAM36 receptor-like protein gene, partial cds -J Pvf1
Malus floribunda clone M18S-3Cs M18S-3Cp gene, complete cds
Malus x domestica clone RS44 receptor-like protein gene, partial cds
Рис. 2. Дендрограма генетического родства нуклеотидной последовательности PVfl с последовательностями
из базы данных GenBank
На сегодняшний день число известных генов груши, отвечающих за устойчивость к парше, невелико. Исследование межвидовых гибридов груши позволило идентифицировать ген Vn, обеспечивающий устойчивость к V nashicola [20]. В геноме японской груши сорта КтЛаки обнаружен ген Vnk [21]. Он также обеспечивает устойчивость к V Nashicola, как и ген Rvn2, картированный в геноме сорта европейской груши ВагЙей [22]. Идентифици-
рованный позже у сорта европейской груши Navara ген Rvpl участвует в формировании устойчивости к виду V. ртпа [3]. В геноме груши обнаружено также два больших QTL локуса на 3 и 7 хромосомах, ассоциированных с устойчивостью к V ртпа [23]. Нуклеотид-ные последовательности генов устойчивости к парше груши пока не установлены. Последовательность PVf1 может являться кандидатом на эту роль.
Заключение
В результате ПЦР-основанного клонирования из генома высокоустойчивого к парше сорта груши Память Яковлева была выделена последовательность PVf1. Анализ секвениро-ванной последовательности позволяет сделать
вывод о ее гомологии с R-генами, в частности, с геном устойчивости к парше яблони Нс^/2. Последовательность PVf1 может служить кандидатом на роль гена устойчивости к парше в геноме груши.
Список используемых источников
1. Studies in pear scab. II. Taxonomy of the causal fungus of Japanese pear scab / S. Tanaka, K. Yamamoto // Ann. Phytopathol. Soc. Jpn. -1964. - Vol. 29. - P. 128-136.
2. Heterothallism and variability in Venturia pirina / M.H. Langford, E.N. Keitt // Phytopathology. - 1942. - Vol. 32. - P. 357-369.
3. A new pear scab resistance gene Rvpl from the European pear cultivar 'Navara' maps in a genomic region syntenic to an apple scab resistance gene cluster on linkage group 2 / L. Bouvier [et al.] // Tree Genet. and Genom. - 2012. -Vol. 8. - P. 53-60.
4. Pear breeding for scab and Psylla resistance / Y. Lespinasse [et al.] // Acta Hortic. -2008. - Vol. 800. - P. 475-481.
5. Genetics and molecular analysis of tomato Cf genes for resistance of Cladosporum fulvum / C.M. Thomas [et al.] // Phiols. Trans. R. Soc. Lond. - 1998. - Vol. 353. - P. 1413-1424.
6. The tomato Cf-2 disease reistance locus comprises two functional genes encoding leu-cine-rich repeat proteins / M.S. Dixon [et al.] // Cell. - 1996. - Vol. 84. - P. 451-459.
7. Isolation of the tomato Cf-9 for resistance to Cladosporium fulvum by transposon tagging / D A. Jones [et al.] // Science. - 1994. - Vol. 266. - P. 789-793.
8. Apple contains receptor-like genes homologous to the Cladosporium fulvum resistance gene family of tomato with a cluster of genes cosegregating with Vf apple scab resistance /
B.A. Vinatzer [et al.] // Mol. Plant-Microbe Interact. - 2001. - Vol. 14. - P. 507-515.
9. The HcrVf2 gene from a wild apple confers scab resistance to a transgenic cultivated variety / E. Belfanti [et al.] // Proc Natl Acad Sci USA. - 2004. - Vol. 101. - P. 886-890.
10. Integrated genetic linkage maps for pear based on SSR and AFLP markers / T. Yamamoto [et al.] // Breeding Science. - 2007. - Vol. 57. -P. 321-329.
11. Update on comparative genome mapping between Malus and Pyrus / J.-M. Celton [et al.] // BMC Research Notes. - 2009. - Vol. 2. - P. 182.
12. The genome of the domesticated apple (Malus x domestica (Borkh.) / R. Velasco, A. Zharkikh, J.e.a. Affourtit // Nature genetics. -2010. - Vol. 42, № 10. - P. 833-841.
13. HcrVf paralogs are present on linkage groups 1 and 6 ofMalus / G.A.L. Broggini [et al.] // Genome. - 2009. - Vol. 52. - P. 129-138.
14. Receptor-like proteins involved in plant disease resistance / M. Kruijt, M.J.D. de Kock, P.J.G.M. de Wit // Molecular plant pathology. -2005. - Vol. 6. - P. 85-97.
15. The leucine-rich repeat: a versatile binding motif / B. Kobe, J. Deisenhofer // Trends Biochemical Sciences. - 1994. - Vol. 19, № 10. -P. 415-421.
16. The leucine-rich repeat as a protein recognition motif / B. Kobe, A.V. Kajava // Current Opinion in Structural Biology. - 2001. - Vol. 11, № 6. - P. 725-732.
17. Structural diversity of leucine-rich repeat proteins / A.V. Kajava // J. of Molecular Biology. - 1998. - Vol. 277, № 3. - P. 519-527.
18. Programmed cell death in plants resembles apoptosis of animals / C. Collazo, O. Chacón, O. Borrás // Biotecnología Aplicada. - 2006. -Vol. 23. - P. 1-10.
19. Molecular cloning and analysis of apple HcrVf resistance gene paralogs in a collection of related Malus species / F. Dunemann [et al.] // Tree Genet. and Genom. - 2012. - Vol. 8, № 5. -P. 1095-1109.
20. Inheritance of resistance to pear scab from European pears to Asian pears / K. Abe [et al.] //
J. Jpn. Soc. Hortic. Sci. - 2000. - Vol. 1. - P. 1-8.
21. Genetic mapping of the pear scab resistance gene Vnk of Japanese pear cultivar Kinchaku / S. Terakami [et al.] // Theor Appl Genet. - 2006. - Vol. 113. - P. 743-752.
22. Development of AFLP and CAPS markers linked to the scab resistance gene, Rvn2, in an inter-specific hybrid pear (Pyrus spp.) / K.H. Cho [et al.] // J. Hortic Sci. Biotechnol. - 2009. -Vol. 84. - P. 619-624.
23. Pear scab resistance QTLs via a European pear (Pyrus communis) linkage map / L. Pieran-toni [et al.] // Tree Genet. and Genom. - 2007. -Vol. 3. - P. 311-317.
Дата поступления статьи 11 июня 2013 г.
