23УДК631.52:577.213
МАРКЕР-ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЙ ОТБОР ГЕНОТИПОВ ЯБЛОНИ НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ПАРШЕ
Пикунова А.В. канд. биол. наук Седов Е.Н. доктор с.-х. наук, академик РАН Серова З.М. канд. с.-х. наук Должикова М.А.
ФГБНУ ВНИИ селекции плодовых культур, Орёл, Россия,, info@vniispk.ru Аннотация
Парша яблони - наиболее вредоносный патоген яблони. В настоящее время в помощь селекционерам разработаны методы детекции генотипов с генами устойчивости на ранних этапах онтогенеза растения путем анализа полиморфизма ДНК. В статье изложены результаты ДНК-генотипирования гибридов яблони на присутствие генов устойчивости к парше (Vf Vm). Всего семьсот тридцать восемь гибридных сеянцев из двадцати двух гибридных семей гибридного фонда Всероссийского Научно-Исследовательского Института Селекции Плодовых Культур были протестированы на наличие ДНК-маркеров. В результате выявлены гибриды имеющие ДНК-маркеры гена Vf, гибриды имеющие ДНК-маркеры гена Vm, гибриды имеющие как маркеры гена Vf так и маркеры гена Vm. Впервые в России анализ полиморфизма микросателлитного локуса Ch-Vf1 использован для выявления гомозиготных по гену Vf генотипов. В семьях полученных от скрещивания гетерозиготных по гену Vf родителей (Кандиль Орловский (Vfvf) х Свежесть (Vf Старт (Vfvf) х Свежесть (Vf Имрус (Vfvf) х Приокское (Vfvf) ) обнаружено тринадцать взрослых плодоносящих гибридов гомозиготных по аллелю локуса Ch-Vf1 сцепленному с геном Vf. Из них несколько гибридов обладают приемлемым вкусом плодов и могут быть оперативно вовлечены в дальнейшие селекционные скрещивания. Проведено сравнение различных методик детекции гена Vf: анализа полиморфизма рецептор подобных генов, амплифицируемых VfC праймерами для быстрой детекции гена, AL07-SCAR маркер и полиморфизм микросателлитного локуса Ch- Vf1 для выявления гомозиготной формы гена Vf. Методы маркер-вспомогательной селекции будут способствовать повышению эффективности селекционных исследований.
Ключевые слова: ДНК-маркеры, маркер-вспомогательная селекция,
гены устойчивости, яблоня, гибридный фонд, парша, Malus Mill., Venturia inaequalis.
MARKER-ASSISTED SELECTION OF APPLE FOR SCAB RESISTANCE
Pikunova А^. cand. biol. sci.
Sedov Е.И. doctor agr. sci., academician of RAAS
Serova 1.М. cand. agr. sci.
Dolzhikova М.А._
Russian Research Institute of Fruit Crop Breeding, Russia, Orel, info@vniispk.ru Abstract
Scab of apple is the most harmful pathogen of apple. Now days to help breeder methods of detection of genotypes with resistant genes on early stage of plant development based of DNA polimorphysm analysis have been developed. This paper reports on results of apple hybrids DNA-genotyping for identification of scab resistance genes (Vf, Vm). At all 738 hybrid seedlings from 22 families developed at All Russian Research Institute for Fruit crop breeding have been tested with DNA markers. Hybrids amplifying DNA-markers of Vf gene as well as hybrids amplifying DNA-markers of Vm gene and hybrids amplifying both DNA-markers of Vm
and Vf genes have been found. For first time in Russia analysis of SSR loci Ch-Vf1 has been used for detection of VfVf genotypes. Among hybrids form families obtained from cross of Vfvf parents ('Kandil' Orlovskij' (Vfvf) х 'Svezhest'' (Vf 'Start' (Vfvf) х 'Svezhest'' (Vfvf); 'Imrus' (Vfvf) х 'Priokskoe' (Vfvf) ) 13 VfVf fruiting hybrids have been revealed based on Ch-Vf1 analysis. Several of them also have acceptable taste o fruits and may be operatively engaged in further breeding crosses. Different methods of Vf detection have been compared, including analysis of receptor-like genes amplified by VfC primers for fast gene detection, AL07-SCAR and Ch- Vf1 loci for detection of VfVf genotypes. Marker-assisted selection will help to increase efficiency of breeding.
Key words: DNA-markers, Marker-assisted selection, resistant genes, apple, hybrids, scab, Malus Mill., Venturis inaequalis
Введение
Во ВНИИСПК долгие годы ведется селекция яблони (Malus Mill.) на устойчивость к парше(Venturia inaequalis) (Седов и др., 2011). Выведено более 30 иммунных сортов с геном Vf, а так же сорта с геном Vm. В настоящее время, ген Vf, пожалуй, самый востребованный ген в селекции яблони на устойчивость к парше. В связи с этим он хорошо изучен с помощью молекулярно генетических методов. Ген Vf был клонирован, и на данный момент разработан целый ряд ДНК маркеров, различных типов для его детекции: есть SNP, SCAR, CAPS и другие типы маркеров (Tartarini et al., 1999, Vinatzer et al., 2004, Afunian et al., 2004, Jänsch et al., 2015 и др.).
Для детекции наличия гена (независимо от гомо- или гетерозиготности) достаточно данных доминантного ДНК-маркера. Например, анализа полиморфизма рецептор подобных генов, амплифицируемых VfC праймерами. Это доминантный маркер, разработанный Afunian et al. (2004) и позволяющий сравнительно быстро выявить присутствие Vf гена, используя разделение фрагментов путем электрофореза в агарозном геле. Этот маркер успешно прошел валидацию на отечественном материале (Ульяновская и др. 2011, Шамшин и др. 2011) и в настоящее время используется в целях маркер-вспомогательного отбора гибридов в школке сеянцев во ВНИИСПК.
Выявление гомозиготных доноров гена Vf будет способствовать повышению эффективности селекции на устойчивость к парше, поскольку использование этих доноров для скрещивания теоретически позволит получить в потомстве 100 % гибридов с геном Vf. Однако, только кодоминантный ДНК-маркер может отличить гомозиготу от гетерозиготы. В этих целях могут быть использованы несколько ДНК-маркеров. В нашей работе мы впервые в России используем анализ полиморфизма Ch- Vf1 локуса (Пикунова и др., 2013). Данный ДНК-маркер так же используется нашими зарубежными коллегами для маркер-вспомогательной селекции (Kellerhals et al., 2007). В работе Савельева и Савельевой (2014) использовался другой маркер: амплификация геномной ДНК сортов и гибридных форм яблони с праймером AL07-SCAR (Tartarini et al., 1999) так же позволила идентифицировать аллельные состояния гена Vf.
В данной статье описаны результаты ДНК-генотипирования гибридов яблони, в т.ч. выявление гомозиготных по гену Vf генотипов.
Материалы и методика исследований
Выделение ДНК проводили из свежесобранных или замороженных молодых листьев СТАВ методом. Всего 738 гибридных сеянцев из 22 гибридных семей были протестированы на наличие ДНК-маркеров.
Последовательности праймеров и ПЦР условия были описаны для VfC основанного метода у Afunian et al. (2004), для детекции локуса Hi07h02 у Patocchi et al. (2005), для детекции локуса Ch-Vf1 у Vinatzer et al. (2004) с небольшими изменениями. Последовательности праймеров и ПЦР условия для AL07 SCAR описаны у Tartarini et al. (1999). Используемые температуры отжига праймеров представлены в таблице 1.
Таблица 1 - Температура отжига праймеров
Локус Ген Температура отжига
Амплификация с VfC праймерами Vf 56
C^Vf1 Vf 62
Hi07h02 Vm 57
AL07 SCAR Vf 55
Детекцию ПЦР продуктов осуществляли путем разделения в 10 % ПААГ (Hi07h02, CH-Vf1), 2% (Vfc основанный маркер, AL07 SCAR) и 4% (CH-Vf1, если позволяла разница аллелей) агарозном гелях или путем фрагментного анализа на ABI Prizm 3130xl genetic analyzer (Applied Biosystems, USA) (CH-Vf1) .
Результаты и их обсуждение
Исходя из задач селекции на устойчивость к парше, наибольшее внимание при молекулярно-генетическом изучении уделялось нами детекции гена Vf. Начиная с 2013 года всего 738 гибридных сеянцев из 22 гибридных семей были протестированы на наличие ДНК-маркеров гена Vf, в т.ч. различающих гомо- и гетерозиготную форму гена. Некоторые гибриды из семей 6223, 6296, 6298 были так же протестированы на наличие ДНК маркера гена Vm.
Сводная таблица результатов анализа представлена ниже (таблица 2).
Таблица 2 - Результаты молекулярно-генетического анализа гибридов на наличие ДНК-маркеров гена Vf
Семья, номер (если имеется) и схема скрещивания F1, шт Маркер гена Vf (амплификация с VfC праймерами) Гомозиготная форма по аллелю локуса СН-Vf1 сцепленному с Vf геном
6038 Имрус (Ш) х Приокское (Ш) 21 21 (100%)*** 4 (19%)***
6223 Поэзия ^т,Со) х 30-47-88 (4^ 131 100 (76%) --
6224 Приокское ^,Со) х 30-47-88 (4^ 61 47 (77%) --
6225 Гирлянда (V, Со) х 25-37-45(4^ 60 21 (35%) --
6226 29-35-123 (Со,М) х 25-37-45(4^ 23 15 (65%) --
6267 Уэлси х Памяти Хитрово ^М) 30 12 (40%) --
6282 Свежесть^М) х Краса Свердловска 48 23 (50%) --
6283 Свежесть^М) х Скрыжапель 14 7 (50%) --
6289 Орлик х Восторг (Ш) 13 6 (50%) --
6292 Антоновка обыкн. х 30-47-88 (4х^М) 34 7 (20%) --
6296 Поэзия (УМ Vmvm) х Афродита ^М) 11 8 (73%) --
6298 Поэзия (УМ Vmvm) х 31-5-15 3 2 (67%) --
6299 Созвездие ^М) х 31_5_42 (Северный Синап х Река) 26 15 (58%)
6300 Созвездие ^М) х Болотовское ^М) 37 22 (60%) 8 (22%)*
6301 Приокское ^М) х Свежеть (УМ) 30 23 (77%) 6 (20%)**
6302 Зеленый шум (Ш) х31-5-42 6 4 (67%) --
6303 Северный синап х Приокское (УМ) 12 4 (33 %) --
6311 Северный синап х Свежесть ^М) 4 2 (50%) --
5776 Кандиль Орловский ^М) х Свежесть ^М) 14 14 (100%)*** 8 (57%)***
Старт ^М) х Свежесть ^М) 7 7(100%)*** 1 (14%)***
Орлик х Ивановское ^М) 82 49 (60%) --
Орлик х Свежесть (УМ) 80 40 (50%) --
Подвой, опыленный колонновидным сортом 16 8 (50%)
Итого 763
* - 20 гибридов из 22 имеющих VГС-основанный маркер гена Vf протестировано ** - 19 гибридов из 23 имеющих VГС-основанный маркер гена Vf протестировано -- - не тестировались
*** - анализ взрослых плодоносящих гибридов, ранее отобранных после искусственного заражения паршой Ждановым В.В.
Продукты амплификация с VfC праймерами представлены на рисунке 1.
Ijjag М.М.
Ч М.М.
Ч М.М.
Рисунок 1 - Электрофореграмма продуктов амплификации на ДНК гибридов яблони с VfC праймерами, фрагмент 286 п.н. (указан стрелкой) свидетельствует о присутствии гена Vf. М.М. - маркер молекулярного
веса DNA MW Ladder M100 (Диалат Ltd., Москва).
Данный метод детекции гена VI прост в исполнении и трактовке, однако не позволяет различить гомозиготную форму от гетерозиготной. Tartarini с соавт. (1999) для различения гомо- и гетерозиготной форм гена VI рекомендовал использовать сразу два фланкирующих ДНК-маркера AL07-SCAR и M18-CAPS. Эти маркеры, как показали дальнейшие исследования, не являются внутригенными маркерами, а находятся с обеих сторон от Vf региона (Vinatzer е1 а1., 2001) (рис. 2).
М18
AM 19
AL07
Vf region (350 kb)
Susceptible chromosome
Resistan! chromosome
Рисунок 2 - Схематическое представление Vf региона. Самые темные линии показывают ВАС клоны, содержащие Vf ген. Показано так же положение ДНК-маркеров M18, AM19 и AL07 (обведен) на хромосоме относительно региона гена Vf ( из Vinatzer et al., 2001).
Маркер AL07 успешно прошел валидацию на отечественном материале и использовался для отбора гибридов в школке сеянцев в научно-ииследовательской группе под руководством Савельева Н.Н. (Савельев и др., 2015, 2016). Интересно отметить, что у сорта Свежесть (Антоновка Краснобочка х PR12T67) в работе
Савельева с соавт. (2016) по данным AL07SCAR наблюдается гомозиготное состояние гена VI Только один из родителей сорта Свежесть имеет ген Vf и в гибридном потомстве от сорта Свежесть наблюдается расщепление по гену VI Возможно, у этого сорта при амплификации с AL07-SCAR обнаруживается ноль аллель.
Позднее был обнаружен микросателлитный локус СН^1, находящийся внутри Vfрегиона (рис 3, Vinatzer в1 а1., 2004, ВгоддШ в1 а1., 2009).
Рисунок 3 - Генетическая карта 1 -ой группы сцепления генома яблони с указанием положения ВАС клонов и Vf региона на ней. Микросателлитный локус CH-Vf1, находится внутри Vf региона (из Broggini et al., 2009).
В наших исследованиях, впервые в России мы использовали анализ полиморфизма микросателлитного локуса Ch-Vf1 для выявления гомозиготных форм гена Vf в семьях, полученных от скрещивания гетерозиготных по гену Vf родителей.
При анализе гибридов семьи 6301 (Приокское х Свежесть) в локусе Ch-Vf1 для разделения фрагментов оказалось возможным использовать электрофорез в 4% агарозном геле. Ранее нами достаточно точно были установлены размеры аллелей для этих сортов путем разделения в длинных ПААГ с окрашиванием нитратом серебра (Пикунова и др., 2013). Сорт Приокское амплифицирует аллели 179 п.н. и 192 п.н. (разница между размерами фрагментов 13 п.н.), Сорт Свежесть - 158 п.н. и 179 п.н. (разница составляет 21 п.н.). Достаточно большая разница между размерами фрагментов позволила успешно проводить детекцию в 4 %
агарозном геле (рис. 4), что значительно упрощает и ускоряет процедуру детекции гомозигот по сравнению с разгонкой фрагментов в ПААГ.
Рисунок 4 - ПЦР продукты микросателлитного локуса Ch-Vf1 амплифицируемые на ДНК гибридов и родителей семьи 6301 (цифрами условно обозначены номера гибридов). Стрелкой указан фрагмент, сцепленный с геном Vf (in coupling phase), размером приблизительно 179 п.н. У гибридов 1-3, кроме искомого фрагмента присутствует ещё один, наследованный от одного из родителей (у гибридов 1,3 - от сорта Свежесть, у гибрида № 2 - от сорта Приокское). И только у гибрида № 4 фрагмент размером 179 п.н. присутствует в двойной дозе, что видно как по интенсивности свечения, так и по отсутствию других фрагментов. Данный гибрид является гомозиготным по маркеру, сцепленному с геном Vf.
Выявление гомозиготных по гену Vf гибридов интересно прежде всего с точки зрения поиска доноров, которые можно оперативно вовлечь в селекционный процесс. Следует учесть, что при выборе форм для скрещивания селекционер учитывает не только параметры устойчивости к патоген, но и вкус плода, размер, урожайность и др. В связи с чем, был проведен поиск гомозиготных форм и среди взрослых плодоносящих гибридов, для которых имеются многолетние фенотипические данные, и которые при необходимости можно оперативно вовлечь в селекцию. С этой целью провели генотипирование гибридов из семей 6038 (Имрус х Приокское), 5776 (Кандиль Орловский х Свежесть), Старт х Свежесть. Все тестируемые гибриды по ранее полученным данным Жданова В.В. основанным на результатах фитопатологического тестирования имеют ген Vf. На первоначальном этапе мы перепроверили эти данные с помощью методики ДНК маркирования основанной на амплификации с Vfc праймерами (Afunian, 2004). Все тестируемые гибриды показали наличие этого доминантного маркера. Следующий этап работы был направлен на выявление гомо- или гетерозиготности гена у каждого из гибридов с помощью анализа полиморфизма микросателлитного локуса Ch-Vf1 (Vinatzer et al., 2004). Выявлены генотипы, унаследовавшие от обоих родителей только аллель, ассоциированный с устойчивостью к парше обусловленной геном Vf, и таким образом, с высокой вероятностью, гомозиготные по гену Vf (рис. 5). Всего обнаружено 13 гомозиготных по гену Vf гибридов. Из них несколько гибридов имеют оценку вкуса плода 3,9-4,1 (по пяти бальной шкале).
200
300
100
п.н.
О
VfVf Старт Свежесть л с; s ci X i« ас VfVf • VfVf \ VfVf VfVf VfVf
Старт х Свежесть (Vf vf х Vf vf) т Кандиль Орловский х Свежесть (Vf vf х Vf vf)
Рисунок 5 - Выявление гомозиготных по гену V! генотипов. Электрофореграмма продуктов амплификации микросателлитного локуса С1> Vf1 у гибридов семей Старт х Свежесть и Кандиль Орловский х Свежесть, 10% ПААГ, ПЦР с 17 мерным дополнительным праймером.
Для сравнения методик гибриды семей 6038 и 5776 были протестированы так же по AL07-SCAR маркеру. В целом, полученные данные идентичны данным анализа локуса. Некоторые сложности
интерпретации AL07-SCAR маркера возникли с двумя гибридами семьи 6038, у которых верхний фрагмент (присутствие которого говорит о наличичи рециссивного алллеля и гетерозиготности гена VI) ампифицировался, но слабее по сравнению с другими образцами (рис.6). При этом по данным полиморфизма СН-VI локуса, эти образцы являются гомозиготными по гену VI.
\_____\ > ■■ _ мм у - - — —
Ш 1 s a> oi о 1 Свежесть О -О с;
1 И е* I CD ш
Рисунок 6 - Электрофореграмма амплификации AL07-SCAR маркера на ДНК гибридов семей 6038 и 6776. Нижний фрагмент амплифицирует доминантный аллель гена Vf, а верхний - рецессивный. Амплификация обоих фрагментов говорит о гетерозиготности гена Vf. Амплификация только нижнего - о гомозиготном состоянии гена Vf. Сложности интерпретации возникли с двумя гибридами помеченными голубыми стрелками, у которых интенсивность амплификации верхнего фрагмента значительно слабее чем у нижнего, в то время, как у остальных образцов оба фрагмента одинаковы по интенсивности.
Учитывая, что локус СН-Vfl находиться внутри Vf региона, а AL07-SCAR находиться рядом с Vf регионом, теоретически, возможность рекомбинаций между геном Vf и AL07-SCAR больше. В работе Vinatzer et al. (2004) при изучении 2071 гибридов у 26 была выявлена рекомбинация между геном Vf и AL07. Однако, аллель сцепленный с геном в локусе CH-Vf1 по литературным данным иногда амплифицируется и у генотипов не связанных с источником гена Vf, например у Malus prunifolia 19651. Для компенсации недостатков имеющихся у обоих маркеров, авторы, обнаружившие CH-Vfl локус, рекомендуют для надежности использовать его вместе с ранее разработанными маркерами M18 и AL07 (Vinatzer, 2004).
C нашей точки зрения, для маркер-вспомогательной селекции и детекции гомо- или гетерозиготной формы гена допустимо использование только анализа полиморфизма СН-Vf1 локуса, в том случае если известны данные о полиморфизме этого локуса у родителей и у них наблюдается сцепление ДНК-маркера с
геном Vf. Например, в семье от скрещивания Malus prunifolia 19651 с сортом имеющим ген Vf недостаточно использовать только анализ полиморфизма СН- Vf1 локуса, поскольку Malus prunifolia 19651 не имея гена Vf так же амплифицирует аллель того же размера, что и сцепленный с геном Vf.
Выводы
В результате наших исследований на основании ДНК-маркирования выявлены:
- гибриды, имеющие ДНК-маркеры гена Vf,
- гибриды, имеющие ДНК-маркеры гена Vm,
- гибриды, имеющие как маркеры гена Vf, так и маркеры гена Vm.
- взрослые плодоносящие гибриды гомозиготные по гену Vf с приемлемым вкусом плодов. Проделанная работа способствовала быстрому выявлению как диплоидных генотипов с геном Vf, так и
триплоидных генотипов с геном Vf, а так же триплоидных и диплоидных колонновидных генотипов с геном Vf (детекция плоидности осуществлялась в лаборатории цитоэмбриологии ВНИИСПК, детекция колонновидности осуществлялась путем визуальных наблюдений работниками лаборатории селекции яблони).
Литература
1. Afunian, M.R., Goodwin P.H., Hunter D.M. Linkage Vfa4 in Malus domestica and Malus floribunda with Vf resistance to the apple scab pathogen Venturia inaequalis // Plant Pathology. - 2004. - Р. 467.
2. Broggini, G. A., Galli, P., Parravicini, G., Gianfranceschi, L., Gessler, C., & Patocchi, A. . HcrVf paralogs are present on linkage groups 1 and 6 of Malus // Genome. - 2009. - 52(2). - Р.129-138.
3. Jansch, M., Broggini, G. A., Weger, J., Bus, V. G., Gardiner, S. E., Bassett, H., & Patocchi, A.. Identification of SNPs linked to eight apple disease resistance loci // Molecular Breeding. - 2015.- 35 (1). - Р.1-21.
4. Kellerhals, M., Spuhler, M., Duffy, B., Patocchi, A., & Frey, J. E.. Selection efficiency in apple breeding. In XII EUCARPIA Symposium on Fruit Breeding and Genetics 814. - 2007, September. - Р. 177-184.
5. Tartarini, S. Development of reliable PCR markers for the selection of the Vf gene conferring scab resistance in apple / S. Tartarini, L. Gianfranceschi, S. Sansavini, C. Gessler // Plant Breeding. -1999 - V. 118.- p. 183-186.
6. Vinatzer, B. A. et al. Apple contains receptor-like genes homologous to the Cladosporium fulvum resistance gene family of tomato with a cluster of genes cosegregating with Vf apple scab resistance // Molecular Plant-Microbe Interactions.— 2001.- Т. 14. - №. 4 - p. 508-515.
7. Пикунова, А.В., Седов Е.Н., Серова З.М. Результаты генотипирования 19 сортообразцов яблони селекции ВНИИСПК по микросателлитным локусам // Селекция, генетика и сортовая агротехника плодовых культур: сб. науч. статей №4 ВОГиС. - Орел: ВНИИСПК, 2013. - С.16-27.
8. Савельев, Н. И., Савельева, Н. Н. Селекционное использование генетической коллекции плодовых культур для повышения адаптивного потенциала и качества плодов // Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции. Т. 175. Вып. 4. - СПб.: ВИР, 2014. - С. 117.
9. Савельев, Н. И., Лыжин, А. С., & Савельева, Н. Н. Отбор перспективных генотипов яблони на колонновидность и устойчивость к парше с помощью диагностических ДНК-маркеров // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2016; 20 (3): 329-332. DOI 10.18699/VJ16. 122.
10. Савельев, Н., Лыжин А., Кудрявцев А., Борис К., Шамшин, И. Использование молекулярных маркеров для идентификации колонновидных генотипов яблони // Доклады российской академии сельскохозяйственных наук. - 2015. - 4. - С.8-9
11. Седов, Е. Н. Селекция и новые сорта яблони. Орел: ВНИИСПК.Ульяновская Е. В. и др. Ускоренное создание иммунных к парше сортов яблони с использованием молекулярно-генетических методов исследования // Е.В. Ульяновская, И.И. Супрун, Е.Н. Седов, Г.А. Седышева, 3.M. Серова. - Краснодар, 2011.
12. Шамшин, И., Савельев, Н., Кудрявцев, А. Применение молекулярных маркеров для идентификации генотипов яблони с геном устойчивости к парше // Плодоводство и ягодоводство России. - 2011. - 26. - С. 126-129.
