Прямой индуцированный андрогенез в культуре in vitro сахарной свеклы (Beta vulgaris L. ) Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

БютЕХнолопя

ТЛ БЮБЕЗПЕКЛ

УДК 633.63:631. 52:58.085 https://doi.Org/10.21498/2518-1017.14.4.2018.151900

Прямий 1*ндукований андрогенез у культур! in vitro буряк'в цукрових (Beta vulgaris L.)

С. M. Гонтаренко*, Г. M. Герасименко

1нститут б^оенергетичних культур i цукрових буряюв НААН Укртни, вул. Клттчна, 25, м. Kuïe, 03110, Украта, *e-mail: [email protected]

Мета. Розробити метод прямого 1ндукованого андрогенезу в культур1 in vitro буряк'в цукрових. Методи. Б10технолоп'чн1, цитолопчт, селекц1Йн1, статистичт. Результати. Розроблено специф1'чн1 для буряк'в цукрових складники методу прямого 1ндукованого андрогенезу в культур1 in vitro, зокрема, визначено фазу розвитку мжроспор, оптимальну для тнтцпацт'! андрогенезу, температурний режим передоброблення експланлв, умови культивування пиляк'в. За результатами цитолоп'чного анал1зу мжроспор та пилку буряк'в цукрових визначено, що одноядерна фаза вакуол1'зовано'1 мжроспори е оптимальною для 1'нокуляц1'1 пиляк'в на живильне середовище, а передоброблення експланлв 1з використанням низькотемпературного стресу (4-8 °С) протягом 3-15 дтб е потр1бним чинником, що 1н1ц1юе перех1д мжроспор з гаметофггного на спорофлний шлях розвитку. Розроблено склад живильних середовищ, р1зних за вмктом макроелеменлв, ам1нокислот, в1'там1'н1'в та регулятор1в росту, для культивування пиляк'в, тництацп!' процес'в прямого андрогенезу та утворення ембрюуф'в. За основу брали модифжоване живильне середовище Мурас1'ге-Скуга -0,5 дози макроелеменлв з додаванням вггам1'тв: Bj- 10,0 мг/л; В6 - 1,0 мг/л; РР - 1,0 мг/л; С - 1,0 мг/л та ам1нокислот: глютам1'ново'1 - 250,0-500,0 мг/л, аспарапново! - 1,0-10,0 мг/л, арпт'ну - 2,0-10,0 мг/л, лрозину - 1,0-10,0 мг/л, п'дроксипрол1'ну - 2,0-4,0 мг/л. За результатами достджень визначено три найефективнш1 живильт середовища з р1зним умктом регулятор1в росту: пол1стимул1н А-6 - 1,0-3,0 мг/л за дшчою речовиною + 6-БАП - 0,3-0,8 мг/л; 2,4-Д -1,0-2,5 мг/л + 6-БАП - 0,3-0,8 мг/л + АБК - 0,3-1,0 мг/л або 6-БАП - 0,1-0,6 мг/л. Культивування пиляк'в бурям'в цукрових на розроблених живильних середовищах дало змогу отримати 0,15-1,32% андрогенних ембрюуф'в р1зних титв та мжроклони андрогенного походження. Висновки. Розроблено метод прямого 1ндукованого андрогенезу буряк'в цукрових: визначена оптимальна стад1я розвитку мжроспор для 1'нокуляц1'1 пиляк'в, режим температурного передоброблення експланлв, склад живильних середовищ для тництацп!' прямого андрогенезу in vitro та отримання р1зних титв андрогенних ембрюуф'в. Результати проведено! роботи мають важливе значення для створення гаплоУд'в та гомозигот-них подвоених гаплоУдних лп'нтй, що сприятиме прискоренню селекц'йного процесу отримання нових сорлв та п'брид1'в буряк'в цукрових.

Ключов! слова: андрогенн ембрiоïдu; живильт середовища; мiкроклонu; пиляки; регулятори росту; буряки цукровi.

Вступ

Експериментальний андрогенез - це cnociö отримання гапло'1дних рослин на живильних середовищах in vitro з iзoльoваних пиляк1в або мiкрocпoр. В умовах in vitro шдукщя утворення ембрю']дав може вiдбуватиcя дво-ма шляхами: прямим - безпосередньо в культурi пиля^в i мiкрocпoр та непрямим -за рахунок утворення калуcу та шдукци co-матичних зарoдкiв [1]. Ембрю'1д - це зародко-пoдiбна бiпoлярна cтруктура, що утворюеть-

Svitlana Gontarenko

http://orcid.org/0000-0003-0472-720X Ganna Gerasymenko

http:// orcid.org/ 0000-0003-4338-7295

cя а^^уально [2]. Цей термiн було запропо-новано Вез^ом та Xiльдебрантoм [3] для позначення зарoдкoпoдiбних cтруктур, якi виникають як в умовах in vivo («нуцеллярш.» i «фoлiарнi» зародки), так i in vitro [2].

3 погляду ^лекци найприваблившим е прямий андрогенез, ocкiльки калуc може утворюватжя як з мiкрocпoр, так i з тома-тичних клiтин пиляшв, а oтриманi регене-ранти можуть мати рiзну площшоть.

Вiдoмo, що прoцеc переходу мiкрocпoр iз гаметофггного на cпoрoфiтний шлях розвитку визначает^я на генетичному рiвнi, але реалiзуeтьcя залежно вiд конкретних фiзio-лoгiчних умов та iндукуючих фактoрiв рiз-но'1 ди, температурного режиму передоброблення, фази розвитку мшростор, на якш

були !зольоваш пиляки, а також складу жи-вильного середовища та умов культивуван-ня, як прискшливо вивчалися на багатьох культурах [4]. Метод прямого андрогенезу набув значного поширення. Його використо-вують бшьш н1ж на 250 видах рослин госпо-дарсько-цшних культур для отримання га-пло'1'д1в. Зокрема, це отримання гапло'1'д1в моркви [5-7], капусти [8], кукурудзи [9], ячменю [10], картопл! [11], пшенищ [12, 13], соняшнику [14]. Використання гапло'1'д1в у селекци дае змогу розв'язати там задач!: швидко отримати константний, гомозигот-ний за вс!ма алельними генами, селекцш-ний матер!ал та шцухт лши для гетерозис-но'1 селекци, найбшьш ефективно проводити доб1р мутант!в, оскшьки експрес!я рецесив-них гешв у них мае фенотиповий прояв, а також завдяки ел1мшаци рослин, що несуть летальш та нашвлетальш гени та загалом скоротити селекцшний процес на 3-4 роки [9, 11, 15]. Але сьогодш за даними лиератур-них джерел спроби розробити метод прямого шдукованого андрогенезу у буряк!в цукро-вих у культур! in vitro та отримати гаплощи не були результативними [15-17].

Мета досл1джень - розробити метод прямого шдукованого андрогенезу в культур! in vitro буряю.в цукрових.

Материали та методика досл1*джень

Дослвди проводили в 1нститут1 бюенерге-тичних культур i цукрових буряшв упро-довж 2012-2017 рр. У дослвдженнях вико-ристовували селекцшний матер!ал Бшоцер-к!всько'1 досл!дно-селекцшно'1 станцй - гено-типи тетраплощних запилювач!в цукрових буряк!в селекц!йних номер!в 1475К22, 1475К26, 1475К29, диплощних запилювач!в 1309К4, 1309К5, 1309К7 та сорту популяци 'Б!лоцерк!вський однонас!нний 45' селекцш-них номер!в БЦ45К4, БЦ45К6, БЦ45К8.

Стерил!зац!ю, передоброблення експлан-т!в, !нокуляц!ю та культивування пиляшв проводили за ввдомими схемами та методами [4, 6, 8, 11], як! були модифшоваш для роботи з пиляками та пилком буряшв цукрових у культур! in vitro. Для передоброб-лення рослинного матер!алу використовува-ли низькотемпературний стрес - пагони з бутонами нас!нник!в буряк!в цукрових вит-римували в холодильн!й камер! за темпера-тури 4-8 °С. Передоброблення також проводили в культуральн!й к!мнат! за температу-ри 30-32 °С та 16-годинному освггленш 1,02,0 клк протягом 7-30 д!б.

Для дослвджень фаз розвитку мшроспор буряк!в цукрових щодо здатност! до !н!ц!а-

ци ембрющогенезу: фаза тетрад, невакуол!-зовано'1 м!кроспори, вакуол!зовано'1 м!кро-спори, трьохкл!тинного пилку та в!дбору пиляшв у фаз!, що найб!льш придатна для стимуляци андрогенезу (вакуол!зовано'1 мш-роспори або двокл!тинного пилкового зерна), проводили визначення фази розвитку мшро-спор та ¿х цитолог!чний анал!з з використан-ням св!тлово'1 мшроскопи. Для досл!джень застосовували тимчасов! препарати пиляк!в та пилку, як! було забарвлено 2%-м розчи-ном кармшу у 45%-й оцтов!й кислот! [18].

Для стерил!заци рослинного матер!алу ви-користовували розчини: 70%-го етилового спирту протягом 1-2 хв, 1-2%-го гшохлори-ду натр!ю протягом 30-35 хв, 3% пероксиду водню протягом 10-15 хв. П!сля холодового передоброблення простерил!зован! бутони розтинали, пиляки вилучали з бутошв та шокулювали на живильн! середовища. Шль-к!сть !нокульованих пиляк!в на одну колбу становила в!д 10 до 30 шт. Культивування пиляшв шсля висаджування на живильн! середовища зд!йснювали за температури 2632 °С, осв!тлення 1,0-2,0 клк протягом 18 годин та в темряв! до шщ!ацй ембр!огенезу. П!сля появи первинних новоутворень, колби з темряви переносили в умови культураль-но'1 к!мнати з освиленням протягом 18 годин за температури 24-32 °С. У досл!дах визна-чали: загальну к!льк!сть пиляк!в, що були висаджеш на кожному середовищ!, к!ль-к!сть пиляк!в, що виявили морфогенну ак-тивн!сть, загальну к!льк!сть новоутворень та ембрюлдав.

Для шшДаци утворення ембрюлдав було розроблено прописи живильних середовищ, як! р!знилися за вм!стом макроелемент!в, ам!нокислот, в!там!н!в, регулятор!в росту.

За базове обрали середовище Мурас!ге-Скуга [19] з повною та зменшеною вдв!ч! к!льк!стю макроелемент!в, з в!там!нами за Гамборгом [20], !з додаванням аскорбшово'1 кислоти (в!там!ну С) - 1,0 мг/л, та амшокис-лоти глутамшу - 500 мг/л, сахарози - 40 г/л. Середовища модиф!кували, додаючи до складу базового середовища так! компоненти: амшокислоти - аспарагшову - 30,0-50,0 мг/л, аргшш - 2,0-250,0 мг/л, пролш - 1,05,0 мг/л, идроксипролш - 2,0-4,0 мг/л, тирозин - 1,0-10,0 мг/л, глщин - 2,0-5,0 мг/л, регулятори росту: полгстимулш А-6 - 1,03,0 мг/л за д!ючою речовиною, 2,4-Д - 1,02,5 мг/л, 6-БАП - 0,6-4,0 мг/л, АБК - 0,031,0 мг/л, НОК - 0,1-0,5 мг/л. Як еталон було обране живильне середовище Гамборга (В5) з додаванням ауксишв - 2,4-Д - 0,5 мг/л та НОК - 0,2 мг/л, яке було застосоване для

OTpHMaHHa eMÖpioi'äiB MopKBH y npon;eci iHo-Kyëaôiï nH-aêiB Ha œHBHëtHe cepe^OBH^e b yMOBax in vitro [7].

YTBopeHi eMÖpioi'äH nepecaflœyBaëH Ha ce-peflOBHùa iHmoro cKëa^y - MoäHÖiKoBaHi ce-pe^oBHm;a Mypacire-Cêyra, ùo MicTHëH BiTa-MiHH: HiêoTHHoBy KHc-oTy (PP) - 1,0 mi/ji, ni-ph^okchh (B0) - 1,0 Mr/ë, TiaMiH (B1 ) - 10,0 mi/j Ta 6-BAn - 0,1-0,5 mi/ji. nacHByBaHHa oTpH-MaHHx eMÖpio'ifliB npofloBœyBaëH Ha cepeäoBH-ùax, npH3Ha^eHHx ä-a noäa-tmoro pocTy, po3-BHTKy Ta cTHMyëaôiï opraHoreHeçy.

y flocëiflax BH3Ha^aëè: KiëtêicTt nHëaêiâ, ùo BHaBHëH aHäporeHHy aKTHBHicTü Ta "acTo-Ty yTBopeHHa eMÖpioi^iB, aê BiäcoToK Biä KiëtKocTi BHcaflœeHHx nHëaêiâ ä-a KoœHoro reHoTHny Ta œHBHëtHoro cepe^oBHùa [21].

Pe3yëbTaTè flocëiflœeHb

3flaTHicTt äo aHâporeHeçy 3Ha"Horo Miporo çaëeœHTt Biä ôa3H poçBHTKy Miêpocnop y mo-MeHT ïx BBeäeHHa b KyjiKrypy in vitro. ToMy BaœëHBo BH3Ha"HTH onTHMaëtHy ôa3y po3BH-TKy Miêpocnop, HancnpHaTëHBimy ä-a iHoêy--an;ïï Ha œHBHëtHi cepeâoBHùa. Bè3Ha"eHo n'aTü ochobhhx ôa3 po3BHTKy Miêpocnop [1]: TeTpaäa, HeBaêyoëi3oBaHa Miêpocnopa, c-aö-KoBaêyoëi3oBaHa Miêpocnopa, cHëtHoBaêyoëi-3oBaHa Miêpocnopa, tphkjthhhhh ïhjok. OnTHMaëtHoro ôa3oro po3BHTKy Miêpocnop ä-a iHoêyëaôiï Moœe 6yTH aê HeBaêyoëi3oBaHa Miê-pocnopa, HanpHKëaâ, ä-a KanycTH ôiëoêa^aH-hoï [8], TaK i Baêyoëi3oBaHa Miêpocnopa - ä-a nmeHHöi [1], MopKBH [5-7], KyKypyä3H [9].

ycTaHoBëeHo, ùo ä-a ôypaêiB öyKpoBHx Ôa3a Baêyoëi3oBaHoï MiêpocnopH e onTHMaët-Horo ä-a iHoKyëaôiï nHëaêiâ Ha œHBHëtHe cepeäoвнùe. CaMe Ha ôié ôa3i cnocTepira-H eMÖpioreHe3 i ôopMyBaHHa MiêpoK-oHiB. Toäi aê iHoêyëaôia nHëaêiâ 3 ïhjkom Ha iHmèx Ôa3ax po3BHTKy He Öy-a pe3yëKraTHBHoK>.

Bè3Ha"eHo, ùo ôa3a oäHoaäepHoi' Baêyoëi3o-BaHoï MiêpocnopH e onTHMa-üHoro ä-a iHoêy-ëaôiï nèëaêiB Ha œHBHëtHe cepeäoвнùe, b no-piBHaHHi i3 ôa3aMH HeBaKyoëi3oBaHoï oäHoaäepHoi MiêpocnopH aöo TpHKëiTHHHHM ïhjkom.

ycTaHoBëeHo, ùo nepeäoöpoö-eHHa eêcn-aH-TiB i3 BHKopHcTaHHaM HH3tKoTeMnepaTypHoro cTpecy (4-8 °C) npoTaroM 3-15 äiö ° ôaKTopoM, ùo min;iroe nepexiä Miêpocnop 3 raMeToôiTHo-ro Ha cnopoôiTHHH mjiax po3BHTKy, Toäi aê 3acTocyBaHHa BHcoêoTeMnepaTypHoro cTpecy (30-32 °C) äJa nepeäoöpoöaeHHa eêcnjiaHTiB

He äajo no3HTHBHHx pe3y-üTaTiB.

Ä-a oTpHMaHHa eMSpio^iB 3 nHëaêiâ Öypa-êiâ ôyêpoBHx npoTecToBaHo noHaä 30 pi3HHx nponèciâ œHBHëtHHx cepeäoвнù, aêi Biäpi3-Ha-Hca 3a HaaBHicTro Ta cK-aäoM BiTaMiiiâ, aMiHoêHc-oT Ta, HacaMnepeä, pery-aTopiâ pocTy. nponècH HaHÔiëtm eôeKTHBHHx cepeäoвнù nopiBHaHo 3 eTa-oHoM - ^hbhjlhhm cepeäoBH-ùeM TaMÖopra (B5) 3 äoäaBaHHaM 2,4-Ä -0,5 mi/j, HOK - 0,2 mi/j, aêe BHêopHcToBy-roTü ä-a oTpHMaHHa eMÖpiox^iB mopkbh [7], HaBeäeHo b Taö-Höi 1.

ÎTpHMaHi äaHi cBiä"aTü, ùo 3acTocyBaHHa eTa-oHHoro cepeäoвнùa B5 3 äoäaBaHHaM pe-ry-aTopiB pocTy - 2,4-Ä - 0,5 mi/j, HOK -

Ta6nuu,n 1

BnëMB œMBMëbHoro cepeflOBM^a Ha nacTOTy iiiöiaöii yTBopeHHa eMÔpioïfliB Ha nuëflKax öyKpoBMX öypnKiß

№ WMBMëbHe cepefloBM^e HacToTa im'öiaöfi yTBopeHHA eMÔpioïfliB y piçHMX reHoTMniB 6ypflKÏB öyKpoBMX, %

1* 2* 3* 4 5 6 7 8 9

1 KMBMëbHe cepefloBM^e - B5 (TaMÖop-ra) 3 floflaBaHHAM 2,4-Ä - 0,5 Mr/ë, HOK - 0,2 Mr/ë - eTaëoH - - - - - - - - -

KMBMëbHe cepefloBM^e - MC 0,5 flo3M

MaêpoeëeMeHTiB + BiTaMiHM: Bj -10,0 Mr/ë; B6- 1,0 Mr/ë; PP - 1,0 Mr/ë;

C - 1,0 Mr/ë + aMiHoKMCëoTM: rëiTaMiHo-

2 Ba - 250,0-500,0 Mr/ë, acnapariHoBa -1,0-10,0 Mr/ë, TipoçMH - 1,0-10,0 Mr/ë, aprim'H - 2,0-10,0 Mr/ë, riflpoKcnnpo-ëiH - 2,0-4,0 Mr/ë + peryëflTopn pocTy: noëicTMMyëiH A-6 - 1,0-3,0 Mr/ë ça fl.p., 6-BAÏ - 0,3-0,8 Mr/ë (1) 0,92 0,61 0,45 0,28 0,15 0,52 0,79

3 Te caMe + peryëflTopn pocTy: 2,4-Ä -1,0-2,0 Mr/ë, 6-BAÏ - 0,3-0,8 Mr/ë, ABK - 0,3-1,0 Mr/ë (11) - - - - - - 1,38 - -

4 Te caMe + peryëflTopn pocTy: 6-BAÏ -0,1-0,6 Mr/ë (111) - - 1,94 - - - - - -

npMMiTKa. 1*, 2*, 3* - reHOTHnH TeTpanëoïflHMX 3anMëioBaHiB öyKpoBMX öypaKiB 1475Ê29, 1475Ê26, 1475Ê22; 4, 5, 6, 7, 9 - reHOTMnn flMnëoïflHMX çanMëiBaniB 1309Ê4, 1309Ê5, 1309Ê7 Ta copTy öypaKiB öyKpoBMX BÖ45K8, BÖ45K6, BÖ45K4.

2 мг/л, не стрияе прoцеcам утворення ембрю-¿дав та мiкрoклoнiв з пилякiв цукрових буря-кiв в умовах in vitro. 1шщащя андрогенезу та утворення ембрю1д1в вiдбувалиcь т1льки на розроблених нами тередовищах: № 1 - тередо-вище Mураciге-Cкуга мoдифiкoване за вмктом макроелеменпв - 0,5 дози, що мгстить вiтамiни: В1 - 10,0 мг/л, В0 - 1,0 мг/л, РР -1,0 мг/л за Гамборгом та виамш C - 1,0 мг/л,

3 додаванням амшокжлот: глютамшово1 -250,0-500,0 мг/л, а^ара^тово]! киcлoти -30,0-50,0 мг/л, прозину - 1,0-10,0 мг/л, ар-гшшу - 2,0-10,0 мг/л, гiдрoкcипрoлiну -2,0-4,0 мг/л, регулятора росту пoлicтимулiну А-6 - 1,0-3,0 мг/л за дтчою речовиною, 6-БАП - 0,3-0,8; тередовище № 2, яке вщ-рiзняeтьcя вщ попереднього вмгстом регуля-тор:в рocту: 2,4-Д - 1,0-2,5 мг/л, 6-БАП -0,3-0,8 мг/л, АБК - 0,3-1,0 мг/л; тередовище № 3, яке мютить - 6-БАП - 0,1-0,6 мг/л. Ви-кoриcтання cаме таких пропиив живильних cередoвищ cприяe утворенню ембрю1дав бу-ряшв цукрових in vitro.

Найрезультатившшим за кiлькicтю генотишв, у яких вiдбувалаcя iнiцiацiя утворен-

Ч .

ня ембрю'1дав, виявилocя cередoвище № 1 з додаванням регулятора росту пoлiмернoгo аукстну пoлicтимулiну А-6 - 1,0-3,0 мг/л, за дтчою речовиною, 6-БАП - 0,3-0,8, яке стрияло :шщаци андрогенезу in vitro у 7 з 9 обраних генотишв. Частота утворення емб-рЫдав змiнювалаcя у межах 0,15-0,92%. У тетраплощних генoтипiв чаcтoта утворення ембрю1дав становила 0,61-0,92%, у диплощ-них генотишв - 0,15-0,79%. На тередовищах № 2 та № 3 шльшсть генотишв, що ш1щю-вали ембрющи, cтанoвила 11,1%, але чаcтoта iнiцiацïï ембрю1дав на цих cередoвищах була значно вище - 1,38% (№ 2) - диплощ та 1,94% (№ 3) - тетраплощ.

Використання декiлькoх прoпиciв живильних тередовищ, що рiзнятьcя за вмicтoм та cпiввiднoшенням регулятoрiв рocту, дае змогу отримувати ембрющи р:зних тишв (рж. 1), та мшроклони (риc. 2) ширшого д:а-пазону генoтипiв буряшв цукрових.

Низьку чаcтoту виходу ембрю1дав та га-площних рocлин, а також cпoнтаннicть емб-рioгенезу вщзначали в культур: пиляшв in vitro р:зних coртiв моркви (0,75-0,78%) [4],

à,

а) б)

в) г)

Рис. 1. Р1'зновиди ембр1*о1Д1*в: а) шаропод1*бний ембрЫд; б) формування булавопод1*бного ембрЫду; в) торпедопод!*бний ембрЫд; г) розвиток с'м'ядолей

Рис. 2. Мжроклони, отриман за методом прямого андрогенезу

капусти (1-4%) [8]. Початок розвитку ембр:-о1дав в:зуально фiкcували на 7-21 добу пиля 1'хньо1 шокуляци, як: за жовтувато-зеленим або зеленим забарвленням вщ^зняют^я ввд inmoï чаcтини пиляка. Через 30-35 д:б сто-стер^али формування мшроклошв.

В екcпериментах виявлено вдентичнють фаз морфогенезу ембрю1дав in vitro та морфогенезу зиготичного зародка буряшв цукро-вих in vivo.

Ввдомо, що в цукрових буряшв подш зиго-ти вiдбуваeтьcя наприкшщ першо!" доби mc-ля заплвднення [22]. Уна^вдок цього подшу утвoрюeтьcя ашкальна та базальна клиини. Пicля другого подшу утвoрюeтьcя чотири-, а поим во^миклиинний проембрю з лшш-ним розташуванням клиин. На третю добу зародки дипло1дав та на 5-7 добу тетрапло"-д:в набувають булавопод:бно1' форми. Форми кул: зародки дипло1дав набувають на п'яту добу, тетрапло1дав - на 8-10 добу. Серцепо-дйшй форми зародки дипло1дав дocягають на вocьму добу, у тетрапло1дав - на дванад-цяту. На дванадцяту добу в дипло1дав та на шютнадцяту в тетрапло1дав витягуютьcя им'ядол: На шicтнадцяту добу в дипло1дав та на двадцяту добу в тетрапло1дав рicт зародка зупиняет^я, але ф:зюлоична зрiлicть у дипло1дав наcтаe пльки на 26-30 добу, а у тетрапло1дав дещо тзшше - пicля накопи-чення зародком б^кових та жиропод:бних речовин, а перистермом - крохмалю.

Специфша морфогенезу андрогенного емб-рющу in vitro полягае у тривалших cтрoках формування та проходження ocнoвних ета-шв: вocьмиклiтиннoгo проембрю з лшшним розташуванням клиин, булавопод:бного ембрюща у форм: кул:, cерцепoдiбнoгo, формування та витягування им'ядолей.

Отже, ембрюнальш структури генератив-них оргашв буряшв цукрових, як i шших рослинних органiзмiв, е найбiльш консерва-тивними, в1дносно постiйними та менш мш-ливими порiвняно з вегетативними органами i тому бiльшою мiрою е ввдображенням за-гального напряму прогресивно! еволюци [2].

Висновки

Розроблено метод прямого шдукованого андрогенезу бурякiв цукрових. Визначено, що стадiя одноядерно!, вакуолiзованоi м^ кроспори е оптимальною для шдукци андрогенезу в культурi in vitro пиляшв буря-кiв цукрових, а тригером цього процесу е стресовий фактор - вплив низьких позитив-них температур (4-8 °С) протягом 7-20 дiб. Установлено, що найб^ьш результативними для шдукци прямого андрогенезу е середо-вища, що мютять 2,4-Д та його ш^мерну форму - полiстимулiн А-6, а також 6-БАП, АБК з додаванням амшокислот - глютам^ ново!, аспарагшово!, аргiнiну, тирозину, гвд-роксипролшу та вiтамiнiв - В1, В0, РР, С. Виявлено подiбнiсть фаз морфогенезу ембр^ о'1дав in vitro та морфогенезу зиготичного зародка буряшв цукрових in vivo. Шлькють утворених ембрю'1дав змiнювалась в межах ввд 0,15 до 1,32%.

Використана литература

1. Батыгина Т. Б., Круглова Н. Н., Горбунова В. Ю. Андрогенез in vitro у злаков: анализ с эмбриологических позиций. Цитология. 1994. Т. 36, № 9-10. С. 993-1005.

2. Круглова Н. Н. Микроспора злаков как модельная система для изучения путей морфогенеза : дис. ... д-ра биол. наук : спец. 03.00.05 «Ботаника» / Ин-т биологии Уфимского научн. центра РАН. Уфа, 2002. 460 с.

3. VasiL I. K., Hildebrandt A. C. Variations of morphogenetic behavior in plant tissue cultures. I. Cichorium endivia. Am. J. Bot. 1966. Vol. 53, Iss. 9. P. 860-869. doi: 10.1002/j.1537-2197.1966. tb06843.x

4. Plant Biotechnology. Vol. 1. Principles, Techniques, and Applications / B. D. Prasad, S. Sahni, P. Kumar, M. W. Siddiqui (eds). New York : Apple Academic Press., 2017. 586 p.

5. Поляков А. В., Демидкина М. А., Зонтиков Д. Н. Эмбриогенез моркови столовой (Daucus carota L.) в культуре микроспор. Вестник КГУ им. Н. А. Некрасова. 2013. № 4. C. 24-26.

6. Тюкавин Г. Б. Основы биотехнологии моркови. Москва : ВНИ-ИСС0К, 2007. 480 c.

7. Zhuang F. Y., Pei H. X., Ou C. G. et al. Induction of microspores-derived embryos and calli from anther culture in carrot. Acta Hortic. Sin. 2010. Vol. 37, Iss. 10. P. 1613-1620.

8. Cilingir A., Dogru S. M., Kurtar E. S., Balkaya A. Anther ^ture in red сabbage (Brassica oleraceae L. var. capitata subvar. rubra): embryogenesis and plantlet initiation. Ekin J. 2017. Vol. 3, Iss. 2. P. 82-87.

9. Сатарова Т. Н. Андрогенез та ембрИокультура у кукурудзи in vitro : дис. ... д-ра бИол. наук : спец. 03.00.20 «БИотехнолопя» / 1н-т клггинноТ бИолоп'Т та генетичноТ ИнженерИТ НААН УкраТни. КиТв, 2002. 537 с.

10. Белинская Е. В. Эффективность получения андрогенных гаплоидов ячменя в зависимости от способа регенерации рас-

тений, состава питательной среды и плотности инокуляции пыльников. Известия Самарского научного центра РАН. 2013. Т. 15, № 3. C. 1571-1574.

11. Генетические основы селекции растений. В 4 т. Т. 3. Биотехнология в селекции растений. Клеточная инженерия / науч. ред. А. В. Кильчевский, Л. В. Хотылева. Минск : Беларус. на-вука, 2012. 489 с.

12. Горбунова В. Ю. Андрогенез in vitro у яровой мягкой пшеницы : дис. ... д-ра биол. наук : спец. 03.00.15 «Генетика» / Башкирский гос. пед. ин-т. Уфа, 2000. 290 с.

13. Круглова Н. Н., Батыгина Т. Б., Горбунова, В. Ю., Титова Г. Е., Сельдимирова 0. А. Эмбриологические основы андроклинии пшеницы: атлас. Москва : Наука, 2005. 99 с.

14. Костина Е. Е., Лобачев Ю. В., Ткаченко 0. В. Андрогенез в культуре пыльников in vitro генетически маркированных линий подсолнечника. Современные проблемы науки и образования. 2015. № 3. URL: http://www.science-education.ru/ru/ article/view?id=19996

15. Plant Tissue Culture, Development, and Biotechnology / R. N. Tri-giano, D. J. Gray (eds). London : CRS Press, 2016. 608 p.

16. Ranabhatt H., Kapor R. Plant Biotechnology. New Delhi : WPI Publishing, 2017. 526 p.

17. Pazuki A., AflakiF., Gurel S. et al. Production of doubled haploids in sugar beet (Beta vulgaris): an efficient method by a multivariate experiment. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 2018. Vol. 132, Iss. 1. P. 85-97. doi: 10.1007/s11240-017-1313-5

18. Паушева 3. П. Практикум по цитологии растений. 4-е изд., перераб. и доп. Москва : Агропромиздат, 1988. 271 с.

19. Murashige Т., Skoog A. F. Revised Medium for Rapid Growth and Bioassays with Tobacco Tissue Cultures. Physiol. Plant. 1962. Vol. 15, Iss. 3. P. 473-497. doi: 10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.x

20. Gamborg 0. L., Constable F., Shiluk J. P. Organogenesis in callus form shoot apices of Pisum sativum. Physiol. Plant. 1974. Vol. 30, Iss. 2. P. 125-128. doi: 10.1111/j.1399-3054.1974.tb05003.x

21. Шеламова М. А., Инсарова Н. И., Лещенко В. Г. Статистический анализ медико-биологических данных с использованием программы Excel. Минск : БГМУ, 2010. 96 с.

22. Зайковская Н. Э. Биология цветения, цитология и эмбриология сахарной свеклы. Биология и селекция сахарной свеклы / под ред. И. Ф. Бузанова. Москва : Колос, 1968. С. 137-207.

References

1. Batygina, T. B., Kruglova, N. N., & Gorbunova, V. Yu. (1994). Androgenesis in vitro in cereals: analysis from embryological positions. Tsitologiya [Cytology], 36(9-10), 993-1005. [in Russian]

2. Kruglova, N. N. (2002). Mikrospora zlakov kak model'naya sistema dlya izucheniya putey morfogeneza [Microspores of cereals as a model system for studying the pathways of morphogenesis] (Dr. Biol. Sci. Diss.). Institute of Biology, Ufa Scientific Center of RAS, Ufa, Russia. [in Russian]

3. Vasil, I. K., & Hildebrandt, A. C. (1966). Variations of morpho-genetic behavior in plant tissue cultures. I. Cichorium endivia. Am. J. Bot.,53(9), 860-869. doi: 10.1002/j.1537-2197.1966.tb06843.x

4. Prasad, B. D., Sahni, S., Kumar, P., & Siddiqui, M. W. (Eds.). Plant Biotechnology. Vol. 1. Principles, Techniques, and Applications. New York: Apple Academic Press., 2017. 586 p.

5. Polyakov, A. V., Demidkina, M. A., & Zontikov, D. N. (2013). Embryogenesis of carrot (Daucuscarota L.) in microspor culture. Vestnik KGU im. N. A. Nekrasova [Vestnik of Kostroma State University named after N.A. Nekrasov], 4, 24-26. [in Russian]

6. Tyukavin, G. B. (2007). Osnovy biotekhnologiimorkovi [Basics of carrot biotechnology]. Moscow: VNIISS0K. [in Russian]

7. Zhuang, F. Y., Pei, H. X., Ou, C. G., Hu, H., Zhao, Z. W., & Li, J. R. (2010). Induction of microspores-derived embryos and caLLi from anther culture in carrot. Acta Hortic. Sin., 37(10), 1613-1620.

8. Cilingir, A., Dogru, S. M., Kurtar, E. S., & Balkaya, A. (2017). Anther culture in red cabbage (Brassicaoleraceae L. var. capitata subvar. rubra): embryogenesis and plantlet initiation. Ekin J., 3(2), 82-87.

9. Satarova, T. N. (2002). Androhenez ta embriokultura u kukurudzy in vitro [Androgenesis and embryonic culture of corn in vitro] (Dr. Biol. Sci. Diss.). Institute of Cells Biology and Genetic Engineering, NAS of Ukraine, Kyiv, Ukraine. [in Ukrainian]

10. Belinskaya, E. V. (2013). Efficiency of obtaining androgenic barley haploids depending on the method of plant regeneration, the composition of the nutrient medium and the density of inoculation of anthers. Izvestiya Samarskogo nauchnogo tsentra RAN [Izvestia RAS SamSC], 15(3), 1571-1574. [in Russian]

11. Kil'chevskiy, A. V., & Khotyleva, L. V. (Eds.) (2012). Genetiches-kie osnovy selektsii rasteniy. T. 3. Biotekhnologiya v selektsii rasteniy. Kletochnaya inzheneriya [Genetic basis of plant breeding. Vol. 3. Biotechnology in plant breeding. Cell Engineering]. Minsk: Belarus. navuka. [in Russian]

12. Gorbunova, V. Yu. (2010). Androgenez in vitro u yarovoy myag-koy pshenitsy [Androgenesis in vitro in spring soft wheat] (Dr. Biol. Sci. Diss.). Bashkir State Pedagogical Institute, Ufa, Russia. [in Russian]

13. Kruglova, N. N., Batygina, T. B., Gorbunova, V. Yu., Titova, G. E., & Sel'dimirova, 0. A. (2005). Embriologicheskie osnovy androklinii pshenitsy: atlas [Embryological bases of wheat androclinia: atlas]. Moscow: Nauka. [in Russian]

14. Kostina, E. E., Lobachev, Yu. V., & Tkachenko, 0. V. (2015). Androgenesis in anther culture in vitro genetically marked lines of sunflower. Sovremennye problemy nauki i obrazovaniya [Modern Problems of Science and Education], 3. Retrieved from http://www.science-education.ru/nj/article/view?id=19996

15. Trigiano, R. N., & Gray, D. J. (Eds.). Plant Tissue Culture, Development, and Biotechnology. London: CRS Press, 2016. 608 p.

16. Ranabhatt, H., & Kapor, R. (2017). Plant Biotechnology. New Delhi: WPI Publishing.

17. Pazuki, A., Aflaki, F., Gurel, S., Ergul, A., & Gurel, E. (2018). Production of doubled haploids in sugar beet (Beta vulgaris): an efficient method by a multivariate experiment. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 2018. Vol. 132, Iss. 1. P. 85-97. doi: 10.1007/ s11240-017-1313-5

18. Pausheva, Z. P. (1988). Praktikum po tsitologii rasteniy [Workshop on plant cytology]. (4rd ed., rev.). Moscow: Agropromizdat. [in Russian]

19. Murashige, T., & Skoog, A. F. (1962). Revised Medium for Rapid Growth and Bioassays with Tobacco Tissue Cultures. Physiol. Plant., 15(3), 473-497. doi: 10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.x

20. Gamborg, 0. L., Constable, F., & Shiluk, J. P. (1974). Organogenesis in callus form shoot apices of Pisum sativum. Physiol. Plant., 30(2), 125-128. doi: 10.1111/j.1399-3054.1974.tb05003.x

21. Shelamova, M. A., Insarova, N. I., & Leshchenko, V. G. (2010). Statisticheskiy analiz mediko-biologicheskikh dannykh s ispol'zo-vaniem programmy Excel [Statistic analyses of medical and biological data with using Excel program]. Minsk: BGMU. [in Russian]

22. Zaykovskaya, N. E. (1968). Flowering biology, cytology and embryology of sugar beet. In I. F. Buzanov (Ed.), Biologiya i selektsiya sakharnoy svekly [Biology and selection of sugar beet] (pp. 137-207). Moscow: Kolos. [in Russian]

УДК 633.63:631. 52:58.085

Гонтаренко С. H.*, Герасименко А. Н. Прямой индуцированный андрогенез в культуре in vitro сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) // Plant Varieties Studying and Protection. 2018. T. 14, № 4. C. 375-381. https://doi.Org/10.21498/2518-1017.14.4.2018.151900

Институт биоэнергетических культур и сахарной свеклы НААН Украины, ул. Клиническая, 25, г. Киев, 03110, Украина, *e-mail: [email protected]

Цель. Разработать метод прямого индуцированного андрогенеза в культуре in vitro сахарной свеклы. Методы. Биотехнологические, цитологические, селекционные, статистические. Результаты. Разработаны специфические для сахарной свеклы составляющие метода прямого индуцированного андрогенеза в культуре in vitro - определена фаза развития микроспор, оптимальная для инициации андрогенеза, температурный режим предобработки эксплантов, условия культивирования пыльников. По результатам цитологического анализа микроспор и пыльцы сахарной свеклы определено, что одноядерная фаза вакуолизированной микроспоры является оптимальной для инокуляции пыльников на питательную среду; а предобработка эксплантов с использованием низкотемпературного стресса - 4-8 °C в течение 3-15 суток является необходимым фактором, инициирующим переход микроспор с гаметофитного на спорофитный путь развития. Разработан состав питательных сред для культивирования пыльников, инициации процессов прямого андроге-неза и образования эмбриоидов, которые отличались по содержанию макроэлементов, аминокислот, витаминов, регуляторов роста. За основу использовали модифицированную среду Мурасиге-Скуга - 0,5 дози макроэлементов с добавлением витаминов: - 10,0 мг/л; В6 - 1,0 мг/л; РР - 1,0 мг/л; С - 1,0 мг/л и аминокислот: глютаминовой -

250,0-500,0 мг/л, аспарагиновой - 1,0-10,0 мг/л, аргинина - 2,0-10,0 мг/л, тирозина - 1,0-10,0 мг/л, гидрокси-пролина - 2,0-4,0 мг/л. Определены три наиболее эффективные питательные среды, которые отличались содержанием регуляторов роста: полистимулин А-6 - 1,0-3,0 мг/л по действующему веществу + б-БАП - 0,3-0,8 мг/л; 2,4-Д -1,0 - 2,5 мг/л + б-БАП - 0,3-0,8 мг/л + АБК - 0,3-1,0 мг/л или б-БАП - 0,1-0,6 мг/л. Культивирование пыльников сахарной свеклы на разработанных питательных средах позволило получить 0,15-1,32% андрогенных эмбриои-дов различных типов и микроклоны андрогенного происхождения. Выводы. Разработан метод прямого индуцированного андрогенеза сахарной свеклы: определена оптимальная стадия развития микроспор для инокуляции пыльников, режим предобработки эксплантов, состав питательных сред для инициации прямого андрогенеза in vitro и получения различных типов андрогенных эм-бриоидов. Результаты проведенной работы имеют большое значение для создания гаплоидов и гомозиготны удвоенных линий, что будет способствовать ускорению селекционного процеса создания новых сортов и гибридов сахарной свеклы.

Ключевые слова: андрогенные эмбриоиды; питательная среда; микроклоны; пыльники; регуляторы роста; сахарная свекла.

UDC 633.63:631. 52:58.085

Hontarenko, S. M.*, & Herasymenko, H. M. (2018). Direct induced androgenesis in culture in vitro in sugar beet (Beta vulgaris L.). Plant Varieties Studying and Protection, 14(4), 375-381. https://doi.Org/10.21498/2518-1017.14.4.2018.151900

Institute of Bioenergy Crops and Sugar Beet, NAAS of Ukraine, 25 Klinichna St., Kyiv, 03110, Ukraine, *e-mail: [email protected] Purpose. To develop the method of direct induced andro- asparagine - 1.0-10.0 mg/l, arginine - 2.0-10.0 mg/l,

genesis of sugar beet in culture in vitro. Methods. Biotech-nological, cytological, breeding, statistical. Results. Specific for sugar beet components of the method of direct induced androgenesis in culture in vitro was developed, in particular, the phase of development of microspores, optimal for initiation of androgenesis, the temperature mode of explants pretreatment, conditions of anthers cultivation were determined. According to the results of cytological analysis of microspores and sugar beet pollen, it was determined that the single-nucleus stage of the vacuolized microspores is optimal for inoculation of anthers on the nutrient medium, and pre-treatment of explants using low-temperature stress (4-8 °C) for 3-15 days is a necessary factor that initiates the transition of microspores from gametophytic to sporophytic pathway of development. The composition of nutrient media, different in content of macroelements, amino acids, vitamins and growth regulators, for the cultivation of anthers, the initiation of processes of direct androgenesis and the formation of embryos have been developed. The modified Murazig-Skoog medium - 0.5 doses of macroelements with the addition of vitamins: B1 - 10.0 mg/l; B6 - 1.0 mg/l; PP - 1.0 mg/l; C - 1.0 mg/l and amino acids: glutamine - 250.0-500.0 mg/l,

tyrosine - 1.0-10.0 mg/l, hydroxyproline - 2.0-4.0 mg/liter was used as a basis. According to the results of research, three most effective nutrient media with different content of growth regulators have been determined: polystimulin A-6 - 1.0-3.0 mg/l for the active substance + 6-BAP - 0.30.8 mg/liter; 2.4-D - 1.0-2.5 mg/l + 6-BAP - 0.3-0.8 mg/l + ABK - 0.3-1.0 mg/l or 6-BAP - 0.1-0.6 mg/l. Cultivation of sugar beet anthers on the developed nutrient media allowed to obtain 0.15-1.32% of various types of androgen embryos and microclones of androgenic origin. Conclusions. The method of direct induced androgenesis of sugar beet is developed: the optimal stage of development of microspores for inoculation of anthers, the mode of temperature pretreatment of explants, the composition of nutrient media for the initiation of direct in vitro androgens and the obtaining of various types of androgenic embryoids have been determined. The results of this work are important for the creation of haploids and homozygous double-haploid lines, which will accelerate the breeding process for obtaining new varieties and hybrids of sugar beet.

Keywords: androgenic embryoids; nutrient media; microclones; anthers; growth regulators; sugar beet.

Hadiuwna/ Received 04.10.2018 nozodxeHQ do dpyKy/ Accepted 13.11.2018