CC BY
57
BIOTECHNOLOGIA ACTA, V. 8, No 3, 2015
УДК 615.222: 582.594.2
doi: 10.15407/biotech8.03.116
БІОТЕХНОЛОГІЯ ЗБЕРЕЖЕННЯ ДИКОРОСЛОЇ ОРХІДЕЇ ФЛОРИ УКРАЇНИ Ophrys sphegodes subsp. mammosa (Desf.) Soo ex E. Nelson
0. А. Шейко Інститут ботаніки імені М. Г. Холодного
1. В. Косаківська НАН України, Київ
E-mail: [email protected]
Отримано 14.05.2015
Метою роботи було визначення оптимальних умов калюсоутворення в культурі in vitro із насіннєвих зачатків, зав’язей і пиляків дикорослої зникаючої орхідеї Ophrys subsp. mammosa (Desf.) Soo ex E. Nelson з наступним використанням отриманих калюсних тканин для розроблення технології клонального мікророзмноження і збереження ex situ. У дослідженнях використовували біотехнологічні (культивування експлантів в умовах in vitro) і мікроскопічні (виготовлення тимчасових препаратів, світлова мікроскопія, цитоморфологічний аналіз калюсних тканин) методи. Підібрано живильні середовища з оптимальними концентраціями регуляторів росту й одержано калюсні культури з генеративних органів (для зав’язей — середовище Мурасіге-Скуга з додаванням
2.5 мг/л 6-БАП і 1,5 мг/л 2,4-Д; насіннєвих зачатків — середовище Ніча і Ніч з 2,0 мг/л 6-БАП і
2.5 мг/л 2,4-Д; експлантів пиляків — середовище Ніча і Ніч з 3 мг/л 6-БАП та 2,5 мг/л ІОлК). Цитоморфологічним аналізом виявлено в калюсах меристематичні осередки, поява яких свідчить про початок процесів вторинної диференціації в калюсних тканинах. Одержані результати використовуватимуть у подальших дослідженнях для одержання з калюсів рослин-регенерантів
O. sphegodes.
Ключові слова: Ophrys sphegodes, культура in vitro, калюсогенез, фітогормони.
В останні роки поряд із застосуванням традиційних методів збереження й відновлення рідкісних і зникаючих видів рослин активно розробляють і впроваджують нові біотехнологічні підходи, серед яких чільне місце посідає метод мікроклонального розмноження. Однак через відсутність даних щодо морфогенезу в культурі in vitro та умов культивування, які б враховували індивідуальні реакції окремого виду, цей метод використовують обмежено [1, 2].
Дикорослі види родини Orchidaceae Juss., чисельність яких катастрофічно зменшується, занесено до Червоної книги України [3, 4]. Орхідея O. sphegodes належить до багаторічних трав’янистих рослин, які розмножуються насінням. Характеризується незадовільним ступенем природного відновлення, занесена до Бернської конвенції (додатки) та Конвенції про міжнародну торгівлю видами дикої фауни і флори, що перебувають під загрозою зникнення (CITES) [3, 4]. Потребує додержання режиму абсолютної заповідності, на території України трапляється в Гірському Криму. Охороняється в Кримському «Мис Мартьян» і Ялтинському гірсько-лісовому природних
заповідниках. Популяції ізольовані, мало-чисельні, складаються з поодиноких рослин або невеликих груп. Чисельність популяцій швидко скорочується [3-5].
Мета роботи полягала у визначені оптимальних умов для калюсоутворення в культурі in vitro із насіннєвих зачатків, зав’язей і пиляків дикорослої зникаючої орхідеї O. sphegodes з наступним використанням отриманих калюсних тканин для розроблення технології клонального мікророзмноження і збереження ex situ.
Матеріали і методи
Визначення морфогенетичного потенціалу природного рослинного матеріалу в умовах in vitro проводили на насіннєвих зачатках, зав’язі та пиляках O. sphegodes (рис. 1). Експланти відбирали на початку цвітіння (пиляки) та 25-й день після запилення (зав’язі й насіннєві зачатки).
Морфогенетичні потенції відібраних екс-плантів досліджували на живильних середовищах Мурасіге-Скуга для зав’язей та Ніча і Ніч (рН 5,6-5,8) для насіннєвих зачатків і пиляків [1, 6].
116
Experimental articles
Рис. 1. Загальний вигляд Ophrys sphegodes і розповсюдження в Україні (позначено червоним)
Для приготування твердих живильних середовищ використовували 7-8 г/л агар-агару фірми «МЗХР» (РФ, Барнаул). Агар розчиняли безпосередньо перед використанням у половинному об’ємі дистильованої води, після чого додавали до середовища. Оскільки морфогенез регулюється певними співвідношеннями екзогенних фітогормонів цитокіні-нів та ауксинів [7-9], як основні фактори дедиференціації застосовували індолілмасля-ну кислоту (ІМК), 2,4-дихлорфеноксіоцто-ву кислоту (2,4-Д) та 6-бензиламінопурин (6-БАП) у концентраціях від 0,5 мг/л до 3,0 мг/л (таблиця).
Розчини регуляторів росту готували з розрахунку 1 мг на 1 мл. Спочатку 6-БАП розчиняли в невеликій кількості 1 н NaOH, ауксини (ІМК, 2,4-Д) — в 0,1 мл етанолу і доводили до необхідного об’єму дистильованою водою. Розчини регуляторів росту зберігали за температури -10 °С не більше 7 діб.
Усі маніпуляції з ізольованими тканинами (введення в культуру, пересадження на свіже живильне середовище) виконували стерильними інструментами в асептичному приміщенні — ламінарному боксі GELAIRE TC 48 (ФРН). Чистий посуд, попередньо загорнутий у папір або фольгу, інструменти,
Варіанти співвідношень екзогенних регуляторів росту в живильних середовищах культивування
надземних органів Ophrys sphegodes in vitro
Варіант живильного середовища Вміст екзогенних регуляторів росту, мг/л
6-бензиламінопурин 2,4-дихлорфеноксіоцтова кислота індолілмасляна кислота
контроль - - -
II 0,5 - -
III 1,5 1,5 1,5
IV 2,0 1,5 -
V - 2,0
VI 2,5 -
VII 3,0 -
VIII 2,5 1,5 -
IX - 3,0
X 3,0 - 2,0
XI - 2,5
117
BIOTECHNOLOGIA ACTA, V. 8, No 3, 2015
папір, вату стерилізували в сушильній шафі LP-301 (Угорщина) за температури 160 °С упродовж 1,5-2 год. Живильні середовища стерилізували в автоклаві за температури від 120 °С до 135 °С під тиском 0,75-1 атм протягом 30 хв.
Стерилізацію пиляків проводили у 70% С2Н5ОН упродовж 1 хв, для зав’язей застосовували подвійну стерилізацію у 80% С2Н5ОН (1,5 хв) із додаванням 15% Н2О2 (2 хв). Насіннєві зачатки стерилізували у 70% С2Н5ОН (2 хв) разом із 15% Н2О2 (3 хв). Для одержання асептичної культури частину рослини, з якої брали експлант, промивали водою з милом, змивали чистою водою, після чого стерилізували в розчинах дезінфікувальних речовин. До стерилізуючого розчину додавали емульгатор Твін-20. Після витримування експлантів у дезінфікувальних речовинах їх багаторазово промивали в дистильованій воді. Поверхневі шари клітин на зрізах, які могли зазнати пошкоджень під час стерилізації, видаляли.
Експланти вирощували в культуральній кімнаті, де підтримували постійну температуру в межах 20-25 °С, 16-годинний фотоперіод з освітленням 1 000-3 000 лк і відносну вологість повітря 70%. Культивування отриманих з експлантів калюсних тканин проводили у фотолюміностаті ФСЛ-В (РФ) за таких самих умов, як і для експлантів.
Мікроскопічні дослідження здійснювали на мікроскопах МББ-1 (РФ) (збільшення х8; х20; х90), використовуючи бінокуляр БМ-51-2 (РФ). Мікрофотографії зроблено за допомогою фотонасадки МФН-11 (РФ) на фотоплівку Kodak-200.
Усі одержані результати обробляли статистично за допомогою комп’ютерної статистичної програми Excel ліцензійного пакета Microsoft Office 2007. У таблиці і на рисунках подано середні арифметичні та їхні статистичні похибки. Достовірність різниці оцінювали за критерієм Стьюдента, використовуючи 5%-й рівень значущості (Р < 0,05).
Результати та обговорення
Сучасні біотехнології дають змогу використовувати як експланти будь-який орган інтактної рослини, однак при цьому слід враховувати генотип, фізіологічний стан та фазу онтогенезу інтактної рослини, а також походження тканини експланта, її розмір і локалізацію [1, 8, 9]. У наших дослідженнях експлантами слугували генеративні органи O. sphegodes: пиляки, насіннєві зачатки та зав’язі, яким притаманна певна автономність (рис. 2).
Важливу роль в індукції поділу клітин експланта, утворенні калюсу та морфогенезі відіграють регулятори росту. Оптимальний вміст екзогенних регуляторів росту є необхідною умовою одержання калюсу, органів рослин, ембріоїдів та регенерації рослин загалом. Індивідуальний характер синтезу ендогенних фітогормонів рослинними тканинами зумовлює широку варіабельність реакцій на зовнішні гормональні фактори. Тому успішне культивування рослинних експлантів різного походження потребує ретельного підбору концентрацій і співвідношень фітогормонів у живильному середовищі [10-13].
Нашими дослідженнями було встановлено, що максимальна частота проліферації зав’язей O. sphegodes спостерігається за культивування на середовищах з додаванням 2,5 мг/л 6-БАП і 1,5 мг/л 2,4-Д (частота проліферації становила 19,1 ± 0,4%) і 3 мг/л 6-БАП та 2,0 мг/л ІОлК (19,9 ± 0,5%) (рис. 3). Під час культивування насіннєвих зачатків найбільший відсоток калюсоутво-рення спостерігали у разі додавання в живильне середовище 2,0 мг/л 6-БАП і 2,5 мг/л 2,4-Д (37,2 ± 0,4%). Максимальне калю-соутворення з експлантів пиляків фіксували за додавання 3 мг/л 6-БАП та 2,5 мг/л ІОлК (40,4 ± 0,5%).
Рис. 2. Культура in vitro експлантів із зав’язей (А), насіннєвих зачатків (Б) і пиляків (В) Ophrys sphegodes
118
Experimental articles
А
Б
Варіанти живильних середовищ
Варіанти живильних середовиш
В
Варіанти живильних сереловнщ
Рис. 3. Калюсогенез експлантів зав’язей (А), насіннєвих зачатків (Б), пиляків (В)
Ophrys sphegodes на живильних середовищах з різними кількісними співвідношеннями екзогенних
цитокініну (6-БАП) і ауксинів (ІМК, 2,4-Д)
Вміст регуляторів росту в живильних середовищах:
I — контроль (живильне середовище без регуляторів росту);
II — 0,5 мг/л 6-БАП;
III — 1,5 мг/л 6-БАП, 1,5 мг/л 2,4-Д, 1,5 мг/л ІМК;
W — 2,0 мг/л 6-БАП, 1,5 мг/л 2,4-Д;
V — 2,0 мг/л 6-БАП, 2,0 мг/л ІМК;
V! — 2,0 мг/л 6-БАП, 2,5 мг/л 2,4-Д;
VH — 2,0 мг/л 6-БАП, 3,0 мг/л 2,4-Д;
Vm — 2,5 мг/л 6-БАП, 1,5 мг/л 2,4-Д;
IX — 2,5 мг/л 6-БАП, 3,0 мг/л ІМК;
X — 3,0 мг/л 6-БАП, 2,0 мг/л ІМК;
XI — 3,0 мг/л 6-БАП, 2,5 мг/л ІМК;
* — Р < 0,05
У результаті проведених досліджень було одержано калюсну культуру із зав’язей, насіннєвих зачатків та пиляків O. sphegodes (рис. 4).
З’ясовано, що аналіз морфогенетичних потенцій клітин експлантів сприяє вирішенню проблеми відновлення і розмноження квіткових рослин та створенню високоефективних біотехнологій масового вирощування рідкісних і ендемічних видів [14]. Із експлантів насіннєвих зачатків та пиляків
O. sphegodes нами було отримано калюси переважно морфогенного типу — компактні, вузлуваті, щільні. Натомість калюси з експлантів зав’язей були переважно неморфогенного типу — м’які, пухкі, водянисті, зазнавали некрозу, тому в подальших дослідженнях їх не використовували. Цитологічний аналіз калюсних культур насіннєвих зачатків і пиляків виявив специфічні риси, зокрема значну структурну гетерогенність, наявність різних за морфологією типів утворень.
119
BIOTECHNOLOGIA ACTA, V. 8, No 3, 2015
А ти? ■
т W \
. . . Ч ■ L. .
Рис. 4. Калюси з експлантів пиляків (А), насіннєвих зачатків (Б) і зав’язей (В) Ophrys sphegodes
В
Г
Рис. 5. Меристематичні осередки (А), початок гістогенезу (Б), чотириклітинний (В) і багатоклітинний (Г) ембріоїди в калюсній культурі Ophrys sphegodes
Прослідковувався певний зв’язок між морфологічними ознаками окремих утворень та їхніми морфогенетичними потенціями.
У калюсах насіннєвих зачатків та пиляків виявлено дрібні клітини з великими ядрами, які локалізувалися групами, утворюючи меристематичні осередки, поява яких свідчить про початок процесів вторинної диференціації в калюсних тканинах [14, 15]. Поділ клітин меристематичних осередків призводив до утворення лігніфікованих елементів судин та трахеїд (рис. 5).
Відомо, що одним із шляхів морфогенезу в меристематичних осередках є спонтанний ембріогенез [15-17]. Нами було встановлено, що калюсна клітина покривалася щільною оболонкою і відокремлювалась від прилеглих клітин, збільшувалась у розмірі та змінювала забарвлення. У такій клітині відбувався симетричний поділ. Унаслідок закладання
клітинних перегородок утворювались емб-ріоїди (рис. 5).
Отже, у результаті проведених досліджень одержано калюсні культури in vitro пиляків, зав’язей і насіннєвих зачатків O. sphegodes. Цитоморфологічним аналізом встановлено значний морфогенетичний потенціал калюсних культур насіннєвих зачатків та пиляків, про що свідчила поява меристематичних осередків та соматичних ембріоїдів. Цитологічні дослідження процесу утворення мікроструктур із підрахунком кількості хромосом або за фактом утворення стерильного (у галоїдів) чи фертильного (у диплоїдів) пилку, габітусом рослин, наявністю насіння тощо [18-19] сприятимуть у подальшому визначенню природи походження отриманих нами новоутворень. Вивчено вплив екзогенних фітогормонів на частоту
120
Experimental articles
калюсогенезу експлантів із генеративних органів і визначено оптимальні співвідношення цитокінінів та ауксинів для культивування тканин O. sphegodes in vitro. Розроблено біо-технологічні підходи мікроклонального роз-
REFERENCES
1. Cherevchenko T. M., Lavrentieva A. N., Ivannikov R. V. Biotechnology of tropical and subtropical plants in vitro. Kyiv: Nauk. Dumka. 2008, 560 p. (In Ukrainian).
2. Moyo M. Plant biotechnology in South Africa: Micropropagation research endeavours, prospects and challenges. South African Journal of Botany. 2011, V. 77, P. 996-1000.
3. Diduh Ya. P. Red Book of Ukraine. Flora. Eyiv: Globalkonsalting. 2009, 900 p. (In Ukrainian).
4. Popovich S. Yu. List of rare biodiversity of reserves and national parks of Ukraine. Fitogenetic fund mikogenetic fund, phytocoenotic fund. Eyiv: Fitosociocenter. 2002, 276 p. (In Ukrainian).
5. Vahrusheva L. P., Svolinskiy M. D., Kucher E. N. The new location of Ophrys taurica (Agg.) Nevski in Crimea. Crimea ecosystems, their optimization and security. 2002, V. 12,
P. 164-169. (In Russian).
6. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiology Plant. 1962, V. 15,
P. 473-497.
7. Teng W. L., Nicholson L., Teng M. C. Micropropagation of Spathoglottis plicata. Plant Cell Rep. 1997, V. 16, P. 831-835.
8. Kruglova N. N., Seldimirova O. A., Zaycev D. Y., Katasonova A. A. Biotechnological evaluation of explants to obtain regenerated plants of spring wheat in an in vitro culture in order to adaptive selection in the conditions of the Southern Urals. Izv. Chelyab. NC UrO RAN. 2006, 2 (32), 94-98. (In Russian).
9. Teixeira da Silva J.A. Floriculture, Ornamental and Plant Biotechnology: Advances and Topical Issues. Global Science Books. London: UK. 2006, 2506 p.
10. Huan L. V. T., Tanaka M. Callus induction from protocorm-like body segments and plant regeneration in Cymbidium (Orchidaceae). J. Hortic. Sci. Biotechnol. 2004, V. 79, P. 406-410.
множення зникаючої орхідеї флори України Ophrys sphegodes subsp. mammosa (Desf.) Soo ex E. Nelson, що відкриває шляхи для одержання рослин-регенерантів.
11. Teixeira da Silva J. A., Singh N., Tanaka M. Priming biotic factors for optimal protocorm-like body and callus induction in hybrid Cymbidium (Orchidaceae), and assessment of cytogenetics stability in regenerated plantlets. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 2006, 84 (2), 119-128.
12. Teixeira da Silva J. A., Yam T., Fukai S., Nayak N., Tanaka M. Establishment of optimum nutrient media for in vitro propagation of Cymbidium Sw. (Orchidaceae) using protocorm-like body segments. Prop. Ornamental Plants. 2005, 5 (3), 129-136.
13. Morini S., D’Onofrio C., Bellocchi G., Fisichel-la M. Effect of 2,4-D and light quality on callus production and differentiation from in vitro quince leaves. Plant Cell Organ Culture Tissue. 2000, V. 63, P. 47-55.
14. Tiago S. B., Claudete S. C., Vanildo S., Mas-suo J. K., Eny I. S. In vitro morphogenesis and cell suspension culture establishment in Piper solmsianum C. DC. (Piperaceae). Acta Botanica Brasilica. 2009, 23 (2), 274-281.
15. Chen J., Chang W. Efficient plant regeneration through somatic embryogenesis from callus cultures of Oncidium (Orchidaceae). Plant Sci. 2000, 160 (1), 87-93.
16. Huan L. V. T., Takamura T., Tanaka M. Callus formation and plant regeneration from callus through somatic embryo structures in Cymbidium orchid. Plant Sci. 2004, V. 166, P. 1443-1449.
17. Yusuf A., Thyagi R. K., Malik S. K. Somatic embryogenesis and plant regeneration from leaf segments of Piper colubrinum. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 2001, V. 65, P.255-258.
18. Gorbunova V. Yu. Androgenesis in vitro in spring wheat. M. S. thesis, Dept. Ecology. Rus. Saint Petersburg. 2000. (In Russian).
19. Barnabas B. In vitro androgenesis of wheat: from fundamentals to practical application. Euphytica. 2001, V. 119, P. 211-216.
121
BIOTECHNOLOGIA ACTA, V. 8, No 3, 2015
БИОТЕХНОЛОГИЯ СОХРАНЕНИЯ ДИКОРАСТУЩЕЙ ОРХИДЕИ ФЛОРЫ УКРАИНЫ
Ophrys sphegodes subsp. mammosa (Desf.) Soo ex E. Nelson
Е. А. Шейко И. В. Косаковская
Институт ботаники имени Н. Г. Холодного НАН Украины, Киев
E-mail: [email protected]
Целью работы было определение оптимальных условий каллусообразования в культуре in vitro из семязачатков, завязей и пыльников дикорастущей исчезающей орхидеи Ophrys sphegodes subsp. mammosa (Desf.) Soo ex E. Nelson с последующим использованием полученных каллусных тканей для разработки технологии клонального микроразмножения и сохранения ex situ. В исследованиях использовали биотехнологические (культивирование эксплантов в условиях in vitro) и микроскопические (изготовление временных препаратов, световая микроскопия, цитоморфологический анализ каллусных тканей) методы. Подобраны питательные среды с оптимальными концентрациями регуляторов роста и получены каллусы из генеративных органов (для завязей — среда Мурасиге-Скуга с добавлением 2,5 мг/л 6-БАП и 1,5 мг/л 2,4-Д; семязачатков — среда Нича и Нич с 2,0 мг/л 6-БАП и 2,5 мг/л 2,4-Д; для эксплантов из пыльников — среда Нича и Нич с 3 мг/л 6-БАП и 2,5 мг/л ИМК). Цитоморфологический анализ выявил в каллусах меристематические очаги, появление которых свидетельствует о начале процессов вторичной дифференциации в каллусных тканях. Полученные результаты будут использоваться в дальнейших исследованиях для получения из каллусов растений-регенерантов O. sphegodes.
Ключевые слова: Ophrys sphegodes, культура in vitro, калюсогенез, фитогормоны.
BIOTECHNOLOGY OF PRESERVATION OF THE RARE WILD ORCHID OF UKRAINIAN FLORA Ophrys sphegodes subsp. mammosa (Desf.) Soo ex E. Nelson
E. A. Sheiko I. V. Kosakivska
Institute of Botany of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv
E-mail: [email protected]
The aim of the work was to determine the optimal conditions for callusogenesis in (in vitro) cultures of ovules, ovaries and anthers from vanishing wild orchid Ophrys sphegodes subsp. mammosa (Desf.) Soo ex E. Nelson followed by using of the obtained callus tissue to develop micropropagation techniques and conservation ex situ. In this study we used biotechnological (cultivation of explants in vitro) and microscopic (making temporary preparations, light microscopy, cytomorphological callus tissue analysis) methods. Nutrient media with optimal concentrations of growth regulators were selected and calluses derived from the generative organs were obtained (we used for ovaries Murashige-Skoog medium that contains 2.5 mg/l 6 of BAP and 1.5 mg/l of 2,4-D; for ovules — nutrient medium Nitsch and Nitsch containing 2.0 mg/l of 6-benzyladenine and 2.5 mg/l of 2,4-D, for the explants from anther — nutrient medium Nitsch and Nitsch containing 3 mg/l 6 of 6- benzyladenine and 2.5 mg/l of IBA). Cytomorphological analysis reveals the presence of meristematic foci in calluses. It indicates the beginning of the secondary processes of differentiation in the callus tissue. The results may be used in further investigations to obtain O. sphegodes regenerated plants from callus.
Key words: Ophrys sphegodes, in vitro culture, callus, phytohormones.
122
