CC BY
49
4. Жуков М.С., Грабовський Н.П. Изменение основных свойств почвы под влиянием тридцатилетнего применения удобрений на плодородие почвы и продуктивность севооборотов. - М.: 1968. - С. 140-164.
5. Носко Б.С., Дуда Г.Г., Непочатов О.П. Вплив добрив на зміну основних показників родючості чорноземних ґрунтів Лівобережного Лісостепу в умовах локального агроекологічного моніторингу // Агрохімія і ґрунтознавство. Міжвідомчий темат. наук. зб. - Харків, вид-во "Аграрна наука", 1998. - С. 41-43.
6. Сапожников П.М., Уткаева В.Ф., Абрукова В.В. Структурно-механические и гидрофизические свойства чернозема типичного при применении удобрений // Почвоведение. - 1988. - № 10. -С. 67-74.
7. Лебедь Є.М., Андрусенко І.І., Пабат І.А. Сівозміни при інтенсивному землеробстві. - К.: Урожай, 1992. - 224 с.
8. Недвига М.В., Галасун Ю.П. Динаміка структурно-агрегатного стану чорнозему опідзоленого за тривалого застосування добрив у сівозміні // Зб. наук. праць Уманського ДАУ.- Умань. -2003. Вип. 57. - С. 11-620.
9. Королев В.А., Стахурлова Л.Д. Изменение основных показателей плодородия выщелоченных черноземов под влиянием удобрений // Почвоведение. - 2004. - № 5.
10. Галасун Ю.П. Вплив тривалого застосування різних систем удобрення в польовій сівозміні на водостійкість структурних агрегатів// Матеріали конференції молодих вчених. -Умань, 2004. -С. 41-43.
11. Николаева И.Н. Изменение физических свойств дерново-подзолистой почвы при внесении высоких доз удобрений // Почвоведение. 1987. - № 2. - С. 52-59.
УДК 631.52:581.143.5:633:78
СТВОРЕННЯ ВИХІДНОГО ГАПЛОЇДНОГО ТА ГОМОДИПЛОЇДНОГО МАТЕРІАЛУ БУРЯКА ЦУКРОВОГО З ВИКОРИСТАННЯМ ГІНОГЕНЕТИЧНОЇ
СТИМУЛЯЦІЇ
Л.О. РЯБОВОЛ, доктор сільськогосподарських наук Я.С. РЯБОВОЛ, аспірант
Наведено результати досліджень з вивчення гіногенетичної стимуляції рослин буряка цукрового. Встановлено, що опилення рослини-донора екстланта пилком виду Beta webbiana L. стимулює процеси формування вихідних гаплоїдних і гомодиплоїдних форм буряка у культурі in vitro.
Г аплоїдія є одним із перспективних методів отримання вихідних гомозиготних ліній для гетерозисної селекції буряка. Найефективнішим способом отримання гаплоїдних і гомодиплоїдпих форм є використання біотехнологічних методів.
Гаплоїдний матеріал у культурі in vitro можна отримати при культивуванні на живильному середовищі пилку, пиляків і незапліднених насіннєвих зачатків [1-5].
У наших дослідженнях для отримання гаплоїдних і гомодиплоїдних матеріалів буряка цукрового використовували культуру незапліднених насіннєвих зачатків.
Низький вихід гаплоїдних матеріалів буряка цукрового, а саме 2,6 % за використання генетичних і біотехнологічних методів їх отримання, потребує розробки
нових ефективних прийомів підвищення виходу гаплоїдних структур [б]. Окрім того, вихід гаплоїдного матеріалу є генетично обумовленим фактором [7].
Одним із дієвих способів підвищення виходу гаплоїдів є гіногенетична стимуляція. Гіногенез — одна із форм апоміксису, що забезпечує розвиток зародка з незаплідненої яйцеклітини при стимуляції спермія. Метод індукції гіногенезу в культурі насіннєвих зачатків і зав’язей є ефективним методом одержання гаплоїдних і гомодиплоїдних рослин. Успішні дослідження з одержання гаплоїдних матеріалів ячменю, пшениці, проса, буряка цукрового, тютюну дозволяють рекомендувати дану технологію для отримання гомозиготних форм у селекційних схемах [8-11]. На сьогодні метод одержання гіпогенних гаплоїдів застосовується в практиці вирощування рису, соняшнику, цибулі, гербери [12].
У попередніх дослідах нами відпрацьовані перспективні технологічні схеми отримання гаплоїдів шляхом поєднання культури ізольованих незапліднених насіннєвих зачатків та прийомів стимулювання: 1 - затримання з опиленням; 2 -опилення рослини-донора експлантів опроміненим пилком [13, 14].
Проведені дослідження показали, що виділення насіннєвих зачатків на 7-9-тий день цвітіння квітки підвищує вихід гаплоїдних матеріалів до 1б,2 %, диплоїдних — 4,4% [14]. За використання генетичних маркерів і розроблених способів візуальної ідентифікації гаплоїдних та гомодиплоїдних матеріалів у дослідах, із загальної кількості отриманих диплоїдів, виділяли до 1,8% спонтанно диплоїдизованих гаплоїдів
[15-17].
При опиленні рослини-донора насіннєвих зачатків опроміненим пилком (доза опромінення летальна) частка гаплоїдних проростків підвищувався з 0,9% (контрольний варіант — донорні рослини не опилювали) до 9,2%, диплоїдних — до 2,3 %, з яких спонтанно диплоїдизованих було 1,0 % [14].
Відомі прийоми стимулювання гаплоїдії шляхом запилення рослин буряка цукрового пилком виду B. weЪЪiana L., B. ртситЪет L. Із загальної кількості отриманих матеріалів виділяли від 0,03 % до 0,4 % форм з гаплоїдним набором хромосом [18].
Методика досліджень. Для підвищення виходу гаплоїдних та гомодиплоїдних матеріалів буряка цукрового у своїх дослідах ми поєднали культуру in vitro ізольованих насіннєвих зачатків та прийому стимулювання — опилення донорного матеріалу пилком виду B. weЪЪiana L.
Пилок даного виду не здатний запліднювати рослини виду B. vulgaris L., проте, гормонально впливає на яйцеклітину та центральне ядро зародкового мішка, пробуджуючи їх до розвитку [19].
Пилком дикого типу запилювали дослідні рослини буряка цукрового у період цвітіння. Попередньо відмічали час відкриття квіток. Опилення проводили вручну тричі. Інтервал обробки — дві доби.
Підготовлені таким чином рослини були донорами насіннєвих зачатків для введення в культуру in vitro. У контрольному варіанті насіннєбруньки виділяли з бутонів.
Щоб спростити відбір гаплоїдних та монодиплоїдних форм використовували гетерозиготний за маркерною ознакою донорний матеріал.
Результати досліджень. У результаті проведених досліджень доведено, що ген забарвлення гіпокотиля R може бути ефективним маркером для відбору отриманих з насіннєвих зачатків в ізольованій культурі гаплоїдних і спонтанно диплоїдизованих матеріалів, так як його дія проявляється на ранній стадії розвитку насіннєвого зачатку
[15-17]. Окрім того встановлено, що під час регенерації рослин з калюсу, отриманого із насіннєбруньок, спостерігається ідентичний ефект.
Спрощення відбору досягається тим, що серед сформованих структур за маркерною (рецесивною) ознакою виділяють гаплоїдні та гомодиплоїдні рослини, що в своєму генотипі відповідно мають гени (г, гг).
Плоїдність сформованих структур визначали за допомогою цитологічного аналізу.
У процесі досліджень було отримано наступні результати (табл. 1):
1. Кількість сформованих структур з насіннєвих зачатків при запиленні донорних рослин буряка цукрового пилком В. 'гееЬЬіапа Ь.
Варіант досліду (фактор А) Г енотип (фактор В) Кількість висаджених насіннєвих зачатків, шт. Сформовані структури
всього калюс проростки
гаплоїди диплоїди
шт. % шт. % шт. % шт. %
Рослина-донор без запилення (контроль) 105/4 200 12 6,0 8 4,0 3 1,5 1 0,5
105/9 280 22 7,9 17 6,1 4 1,4 1 0,4
105/19 322 16 4,9 13 4,0 2 0,6 1 0,3
230/9 235 20 8,5 16 6,8 2 0,8 2 0,8
230/14 279 19 6,8 15 5,4 3 1,0 1 0,4
Запилення донорного матеріалу пилком В. weЪЪiana Ь. 105/4 200 66 33,0 36 18,0 18 9,0 12 6,0
105/9 746 263 35,2 172 23,1 61 8,2 30 4,0
105/19 831 246 29,6 157 18,9 50 6,0 39 4,7
230/9 706 228 32,3 146 20,7 52 7,4 34 4,8
230/14 540 179 33,1 108 20,0 44 8,1 33 6,1
5 5з Й фактору А 1,2 0,7 0,3 0,2
фактору В 1,1 1,3 0,4 0,3
взаємодії АВ 2,2 1,7 0,7 0,5
- у контрольному варіанті кількість сформованих структур з насіннєвих зачатків у середньому склала 6,9%, з яких 5,5% — калюс, 1,0% — гаплоїдні та 0,5% диплоїдні проростки;
- у дослідному варіанті отримали достовірно вищу частку формувань: 20,7% висаджених насіннєбруньок регенерували калюсну тканину, 7,4% — гаплоїдні та 4,8% — диплоїдні проростки буряка цукрового.
Проростки в ізольованій культурі формувалися через три-чотири тижні культивування насіннєвих зачатків на живильному середовищі.
Калюсна тканина, яка мала розпушену консистенція та світло-зелений або жовтувато-коричневий колір, утворювалась через чотири-п’ять тижнів культивування. Після пересаджування на регенераційні середовища спостерігали морфогенез калюсної біомаси, який характеризувався активною проліферацією клітин та формуванням мікропагонів у зоні інтенсивного наростання калюсу.
Використання прийомів стимулювання при культивуванні насіннєбруньок у
культурі in vitro не впливало на зміну морфологічних ознак сформованих структур.
У процесі культивування насіннєвих зачатків в ізольованій культурі отримали рослинні матеріали, які відрізнялись за маркерними ознаками. Отримані проростки різнились фенотипово і мали червоне або біле забарвлення гіпокотиля. Окрім того, частина проростків мала гаплоїдну, а частина — диплоїдну природу (табл. 2).
2. Забарвлення гіпокотиля проростків у досліді при запиленні рослини-донора
експланта пилком B. webbiana L.
Варіант Плоїдність Г енотип (фактор С) Кількість Забарвлення гіпокотиля проростків
досліду (фактор А) проростків (фактор В) о триманих проростків, біле червоне
шт.
шт. % шт. %
105/4 3 2 бб,7 1 33,3
З гаплоїдним 105/9 4 2 50,0 2 50,0
набором 105/19 2 0 0,0 2 100
Рослина- хромосом 230/9 2 1 50,0 1 50,0
донор без 230/14 3 1 33,3 2 бб,7
запилення 105/4 1 0 0,0 1 100
(контроль) Проростки з 105/9 1 0 0,0 1 100
диплоїдним набором хромосом 105/19 1 1 100 0 0,0
230/9 2 0 0,0 2 100
230/14 1 1 100 0 0,0
105/4 18 9 50,0 9 50,0
Проростки з 105/9 б1 28 45,9 33 54,1
гаплоїдним набором хромосом 105/19 50 29 58,0 21 42,0
Запилення 230/9 52 25 48,1 27 51,9
донорного 230/14 44 18 40,9 2б 59,1
матеріалу пилком В. 105/4 12 5 41,7 7 58,3
weЪЪiana Ь. Проростки з 105/9 30 14 4б,7 1б 53,3
диплоїдним набором хромосом 105/19 39 1б 41,0 23 59,0
230/9 34 15 44,1 19 55,9
230/14 33 15 45,5 18 54,5
фактору А 1,5 1,8
фактору В 1,5 1,8
фактору С 1,4 2,2
НІР 05 взаємодії АВ взаємодії АС взаємодії ВС взаємодії АВС 2,2 2.4 2.4 3,б 3,5 3.7 3.7 4,1
Рослини з домінантними ознаками можуть бути гаплоїдними або диплоїдними, отриманими з диплоїдних клітин материнської рослини-донора. їх можна розділити за допомогою цитологічного аналізу. Рецесивні ознаки успадковують рослини з гаплоїдним набором хромосом, які формувались з гаплоїдних клітин насіннєвого зачатку. Тому отримавши проростки, можна відразу візуально виділити частину гаплоїдних рослин, не звертаючись до цитологічного методу дослідження [16]. Використання даного способу спрощує і прискорює процес відбору гаплоїдних матеріалів.
Разом з тим наші дослідження були направлені на отримання та відбір спонтанно диплоїдизованих гомодиплоїдних тканин при використанні донорних гетерозиготних матеріалів за геном забарвлення гіпокотиля Я.
На основі цитологічного аналізу матеріалів та аналізу забарвлення гіпокотиля отриманих проростків встановлено, що частка виходу гаплоїдних рослин з рецесивною ознакою приблизно дорівнює виходу рослин з домінантною ознакою за забарвленням гіпокотиля незалежно від варіанту. Проте частка диплоїдних рослин з червоним забарвленням гіпокотиля вищий, аніж з диплоїдним набором хромосом та білим гіпокотилем (рис. 1).
НІР01=2,0
30
25
20
15
10
28,9
17,4
0,15
14,4
■\\\\\\\\\\
2,2
і;
,\\\\\\\\\\
Рис.
Насіннєві зачатки з бутонів (контроль)
1. Вихід гомодиплоїдів від загальної кількості
Насіннєві зачатки з рослин обпилених В. webbiani Ь.
■ — висаджених насіннєвих зачатків;
□ — отриманих проростків;
□ — отриманих гаплоїдів.
Згідно закону про розщеплення гетерозигот та успадкування генів у потомстві можна зробити висновок, що проростки з диплоїдним набором хромосом і домінантною ознакою (червоне забарвлення гіпокотиля) можуть бути спонтанно диплоїдизованими гаплоїдами або проростками, що сформувались випадково з клітин материнської гетерозиготної тканини. Ці проростки не можна розділити між собою, тому їх бракують. Рослини з диплоїдним набором хромосом і рецесивною ознакою (біле забарвлення гіпокотиля) — це спонтанно диплоїдизовані гаплоїди [17].
5
У контрольному варіанті досліду вихід проростків з білим гіпокотилем і диплоїдним набором хромосом у середньому за генотипами склав 0,15 % від загальної кількості висаджених насіннєвих зачатків та 10,0 % — від загальної кількості отриманих проростків.
У дослідному варіанті при запиленні донорних рослин пилком В. ч>еЬЬіапа Ь. вихід гомодиплоїдів був достовірно вищим і склав 2,2 % від загальної кількості висаджених насіннєвих зачатків та 17,3 % — від загальної кількості отриманих проростків.
У контрольному варіанті досліду вихід спонтанно диплоїдизованих гаплоїдів від кількості отриманих гаплоїдів у середньому за генотипами склав 14,3 %, а в дослідному варіанті — 28,9 %. Проте не виключено, що така ж кількість гомодиплоїдів з домінантним забарвленням гіпокотиля бракується, що пов’язано з неможливістю фенотипової ідентифікації їх щодо рослин, отриманих із клітин материнської тканини донора експлантів.
Аналізуючи серію дослідів зі стимуляції гаплоїдії, можна зробити висновок, що гіногенез у поєднанні з культурою ізольованих насіннєвих зачатків є ефективним прийомом стимуляції гаплоїдії.
При використанні прийомів стимулювання — опилення донорного матеріалу опроміненим пилком та пилком В. ч>еЬЬіапа Ь. вихід гаплоїдів склав 9,1 % та 7,4 % відповідно від загальної кількості висаджених насіннєбруньок, що є достовірно вищим, аніж у контрольному варіанті (1,1%) (табл. 3, 4).
3. Вихід проростків від загальної кількості висаджених насіннєвих зачатків
Варіант досліду Кількість висаджених насіннєвих зачатків, шт. Г аплоїди, % Г омодиплоїди, %
Рослина-донор без запилення (контроль) 1316 1,1±0,4 0,1±0,1
Запилення донорного матеріалу пилком В. weЬЬiana Ь. 3023 7,7±1,3 2,2±0,4
Запилення донорного матеріалу опроміненим пилком 2670 9,1±0,5 1,0±0,2
Окрім того, даний прийом впливає і на спонтанну диплоїдизацію галоїдного матеріалу, в результаті чого вихід гомодиплоїдів (тобто їх частини, що мають рецесивну маркерну ознаку) склав 1,0% при опиленні рослини донору експланта опроміненим пилком та 2,2% при опиленні пилком дикого типу, що є вищим, аніж у контрольному варіанті.
Необхідно зауважити і те, що при опиленні рослини-донору експлантів пилком В. ч>еЬЬіапа Ь. частка гомодиплоїдних форм була достовірно вищою, порівняно з варіантом опилення рослин опроміненим пилком, і склав у середньому за генотипами 2,2 % від загальної кількості висаджених насіннєвих зачатків та 17,4 % від загальної кількості отриманих проростків.
Даний факт ми пов’язуємо з вищою біологічною активністю пилкового зерна без опромінення, що стимулює спонтанну диплоїдизацію, індукуючи переведення гаплоїдного матеріалу на природний диплоїдний збалансований рівень. Окрім того для опромінення матеріалу необхідно спеціальне обладнання.
4. Вихід гомодиплоїдів від загальної кількості отриманих проростків
Варіант Досліду (фактор А) Г енотип (фактор В) Кількість отриманих проростків, шт. Г омодиплоїди
шт. %
Рослина-донор без запилення (контроль) 105/4 4 0 0,0
105/9 5 0 0,0
105/19 3 1 33,3
230/9 4 0 0,0
230/14 4 1 25,0
I 20 2 10,0
Запилення донорного матеріалу пилком В. weЪЪiana Ь. 105/4 30 5 1б^
105/9 91 14 15,4
105/19 89 1б 1l,9
230/9 8б 15 1l,4
230/14 ll 15 19,5
I 3l3 б5 1l,4
Запилення донорного матеріалу опроміненим пилком 105/4 5l 5 8,8
105/9 53 5 9,4
105/19 48 4 8,3
230/9 l0 б 8,5
230/14 l4 l 9,5
I 302 2l 8,9
фактору А 1,4 НІР01 фактору В 1,1 взаємодії АВ 2,0
Отримані таким методом гомодиплоїдні рослини можуть використовуватись у селекції буряка цукрового, як вихідний гомозиготний матеріал. Такі прийоми стимулювання скорочують затрати праці, часу та коштів на диплоїдизацію.
Висновок. Гіногенез у поєднанні з культурою ізольованих насіннєвих зачатків є ефективним прийомом створення вихідних гаплоїдних та гомозиготних форм буряку. Розроблено спосіб стимуляції гаплоїдії буряку цукрового, що дає змогу підвищити вихід гаплоїдних та гомодиплоїдних матеріалів за рахунок поєднання культури ізольованих насіннєвих зачатків з прийомом гіногенетичного стимулювання — запилення рослини-донора експлантів пилком рослин виду Beta webbiana L. Застосування даного способу дозволяє підвищити вихід гаплоїдів до l,4%, а спонтанно диплоїдизованого матеріалу — до 2,2 %.
Список використаних джерел
1. Мельничук М.Д. Біотехнологія рослин / М.Д. Мельничук, Т.В. Новак, В.А. Кунах. - К.: ПоліграфКонсалтинг, 2003. - С. 223-240.
2. Подвигина O.A. Путь морфогенеза при индукции гаплоидии in vitro у сахарной свеклы / O.A. Подвигина // Генетические основы эволюции и селекции: Материалы межригион. конф. -Воронеж, 1 б-18 октября 2002 г. - С. 48-50.
3. Славова Й.В. Разработка методов вегетативного размножения и получения гаплоидов в культуре in virto у сахарной свеклы: Aвтореф. дисс.... канд. с.-х. наук. - Пловдив, 1983. - 28 с.
4. Тивари Ш. Морфогенез в культуре пыльников и изолированных микроспор ячменя: Aвтореф. дис.... канд. биол. наук: 03.00.12 / ТСХ. Aкад. - М., 1980. - 24 с.
5. Anonymous A. Primary study on induction of pollen plants of Zea mays. / A.Anonymous // Acta. Genet. Sinica, 19l5. - V. 1. - Р. 138-143.
6. Рябовол Л^. Вплив генотипу на вихід гаплоїдних матеріалів цукрових буряків / Л^. Рябовол,
A.O. Манько, O.A. Сливченко // Зб. наук. пр. УСГА. - Умань, 2000. - С. 207-210.
7. Рябовол Л^. Вплив рівня плоїдності донорного матеріалу цукрових буряків на вихід, ріст і розвиток макроструктур з насіннєвих зачатків / Л^. Рябовол, Ф.М. Парій // Зб. наук. пр. «Вісник Причорномор’я». - Oдеса, 2002. - С. 28-31.
8. Кашин А.С. Гаметофитный апомиксис и проблема хромосомной нестабильности геномов у покритосеменних / A.С. Кашин // Генетика. - 1999. - Т. 35.- № 8. - С. 1041-1053.
9. Кашин А.С. Aктивация мегагамет и регуляция ембриогенеза у неоплодотворенних завъязей проса in vitro / A.С. Кашин, E.A. Блюднева, М.А. Силкин // Физиология растений - 2000. -Т. 47, - № 2. - С. 291-301.
10. Ницше В. Гаплоиды в селекции растений / В. Ницше, Г. Вензель. - М.: Колос, 1980. - 128 с.
11. Rode A. Gametoclomal variation detected in the nuclear ribosomal DMA from doubled haploid lines of a spring wheat (Iriticum aestivum L., cv. Cesar) / A. Rode, C. Hartmann, A. Bens1imane, E. Picard, F. Quetier // Theor. Appl. Genet. - 1987. - V. 74, № 1. - P. 31-37.
12. Кунах В. A. Біотехнологія лікарських рослин. Генетичні та фізіолого-біохімічні основи / В. А.
Кунах - К.: Логос, 2005. - 730 с.
13. Рябовол ЛЮ. Повышение выхода гаплоидов у сахарной свеклы / ЛЮ. Рябовол, Ф.Н. Парий // Селекция и семеноводство. - 1992. - № б. - С. 30.
14. Рябовол ЛЮ. Разработка способов получения гаплоидов и дигаплоидов сахарной свеклы, как исходного материала для селекционного процесса: Aвтореф. дисс.. канд. с.-х. наук. -Киев, 1994. - 24 с.
15. Парій Ф.М. Патент на винахід 20959A (Україна). Спосіб одержання гаплоїдів рослин / Ф.Н. Парий, ЛЮ. Рябовол. - 199l.
16. Парій Ф.М. Патент на винахід 21237a (Україна). Спосіб відбору гаплоїдних рослин / Ф.Н. Парий, ЛЮ. Рябовол, Т.А. Небикова. - 199lа.
17. Парій Ф.М. Патент на винахід 21403А (Україна). Спосіб одержання гомозиготних рослин / Ф.Н. Парий, ЛЮ. Рябовол, Т.А. Небикова. - 1 9916.
18. Melzer R. Nutzung vor Inzuehtlinien in der. Zuckerrubenzuchlung / R. Melzer, H.O. Behrens // Fortschriftsberichte fur die Landwirtschaft und Nahrungsguterwirtschaff. - 1980. - Bd. 18, N 4. -
S. 1-24
19. Красочкин В.Т. Корнеплодные растения / В.Т. Красочкин, Б.И. Сечкарёв, Л.В. Сазонова, Л.И. Левандовская // Культурная флора СССР. - Ленинград: Колос, 1971. - С. 184.
Изучено процессы гиногенетической стимуляции для получения исходного гаплоидного и гомодиплоидного материала свёклы сахарной в изолированной культуре. Установлено, что опыление растерия-донора экспланта пыльцой вида Beta webbiana L. позволяет увеличить выход гаплоидов до 7,4 %, а гомодиплоидов до 2,2%.
The processes of gynogenetic stimulation for preparation of haploid and homodiploid material of sugar beets in the isolated culture are studied. It is established that fertilization of the plant-donor explant with pollen of the variety Beta webbiana L. makes it possible to increase the haploidy yield to 7,4% and homodiploidy yield to 2,2%.
