CC BY
29УДК 631.681.16 http://dx.doi.Org/10.21498/2518-1017.13.1.2017.97219
Отримання рослин Miscanthus sacchariflorus (Maxim.) Hack та Miscanthus sinensis Andersson у культур! in vitro шляхом непрямого морфогенезу
С. М. Гонтаренко, С. О. Лашук*
1нститут б^оенергетичних культур i цукрових буряктв НААНУкра1ни, вул. Клттчна, 25, м. Kuib, 03141, Украина, *e-mail: [email protected]
Мета. Отримати рослини Miscanthus sacchariflorus (Maxim.) Hack та Miscanthus sinensis Andersson у культур1" in vitro шляхом непрямого морфогенезу. Методи. Бютехнолопчт, математико-статистичт. Результати. Розроблено склад живильного середовища для 1ндукцп1 калусогенезу з нас'ння м1'скантусу з низькою схожктю та життездатн1'стю проростк1'в - модифковано середовище Мурас1'ге-Скуга (MC) за вм1'стом макроелемент1'в (1/2 дози), до якого включено ам1'нокислоти (глютам1'нова - 300 мг/л, аспарапнова - 50 мг/л, лрозин - 5 мг/л, арпт'н - 3 мг/л, п'дроксипрол1'н - 2 мг/л) та регулятори росту (6-БАП - 0,6 мг/л, 2,4-Д - 2,5 мг/л та АБК - 0,3 мг/л). Розроблено склад живильного середовища для регенерацй мжророслин з калусу - модифковано агаризоване середовище MC за вмктом макроелеменлв (1/2 дози) з додаванням в1'там1'тв: лам1'ну (10,0 мг/л), тридоксину (1,0 мг/л), нкотиново!' кислоти (1,0 мг/л) (за Уайтом), аскорб1'ново'1 кислоти (1,0 мг/л), глютамково!' ам1'нокислоти (250 мг/л), 6-БАП (2,0 мг/л), НОК (0,3 мг/л), на якому отримано стов1'дсоткову регенерацш M. sacchariflorus (Maxim.) Hack та п'ятдесятив1'дсоткову - M. sinensis Andersson. Завдяки модифкацл середовищ для 1н1ц1ац11 калусогенезу та регенерацй м1'кророслин коеф1'ц1'ент розмно-ження M. sinensis тдвищено в середньому в 20 раз1"в, M. sacchariflorus - в 35-40 раз1"в. Висновки. Отримано рослини M. sacchariflorus (Maxim.) Hack та M. sinensis Andersson у культур1" in vitro шляхом 1н1цпац11 калусогенезу та регенерацш мжророслин з нас'ння мккантусу з низькою схожктю та життездатн1'стю на живильних середовищах певного складу. Ключов! слова: мккантус, калус, бiотехнологiчнi методи, наання, живильне середовище.
Вступ
Рослини роду Miscanthus належать до в1д-д1лу покритонасшних (Angispermal), класу однодольш (Monocatyledoneae), ряду (Glumi-floreae), родини злаков! (Poaceae) [1]. Вони е типовими багатор1чними злаками, що по-ширеш на теренах Япони, Швденних Курил, Маньчжури, Коре'1, Ташанду, Полшези та Сходного узбережжя США [2]. Анал1з свь тового досввду вирощування бкенергетич-них культур св^дчить, що саме мккантус е пркритетним серед трав'янистих культур з погляду бкенергетики завдяки свош висо-кш фотосинтетичнш активности значнш к!лькост! бкмаси та невибагливост! до умов вирощування. Ведомо понад 20 вид!в мк-кантусу [3] серед яких перше мкце в бк-енергетичному аспект! займае мккантус ri-гантський (Miscanthus х giganteus J.M.Greef, Deuter ex Hodk., Renvoize) - природний алло-трипловд, ибрид м!ж мккантусом цукрокви-ковим (Miscanthus sacchariflorus (Maxim.) Hack) (тетрапло'1'д) та мккантусом китайським (Miscanthus sinensis Andersson) (дипло'1'д) [4].
Svitlana Gontarenko
http://orcid.org/0000-0003-0472-720X Snizhana Lashuk
http://orcid.org/0000-0002-9588-7761
Мккантус - гелюфгг, належить до групи рослин !з С4-типом фотосинтезу. Загальна ефективнкть трасформаци сонячно'1 енерги в бюмасу у С4-рослин е значно вищою, н!ж у СЗ-рослин - 4,0 та 3,6% ввдповвдно [5]. Мккантус вважають одним з рекордсмешв серед найефектившше синтезуючих оргашз-м!в [6]. Завдяки цьому, так! рослини мають змогу рости навгть за високо'1 температури та !нтенсивного осв!тлення за закритих про-дих!в, мають своервдну адаптащю до склад-них погодно-кл!матичних умов. Ефективнкть фотосинтезу у таких рослин е дуже високою, а орган!чна речовина значною м!-рою витрачаеться не пльки на утворення нових пагошв, а й шдземно!" частини - ко-решв (ризом). Але в зв'язку з тим, що для бкенергетичних потреб набув поширення лише один японський клон - мккантус Ti-гантський, кнуе ризик неконтрольованих ешфгтотш. Пошуки нових клошв або три-пло'1'дного насшня в симпатричних популя-щях на остров! Хокайдо (Япошя) не були результативними, так само як ! селекцшш роботи з в!дтворення високопродуктивного триплощу в умовах теплиць, де як компо-ненти для тбридизаци використовували м!скантус цукрокв!тковий та м!скантус ки-тайський [2, 7]. Тому останшми роками знову повернулися до селекци та бктехно-
логи м1скантусу китайського та цукроквм-кового.
Млскантус - рослина короткого дня. В кл1-матичних умовах Сх1дно1 бвропи рослини мккантусу цвмуть у вересш-листопад:ь Суц-вмтя - волоть, або колосовидна волоть, слаб-ко розвинута. Велика к^ьмсть представни-к1в роду Miscanthus не утворюе насшня, що перешкоджае генеративному розмноженню культури та проведенню селекцшних робм [8]. Генотипи, що цвмуть рано - наприкшщ лма, використовують як газонн декоративш трави i мають невеликий урожайний потен-щал. Утворене насшня мае низьку схожкть (6-60%), життездаттсть його збер^аеться близько 6 мсящв [9]. Маса 1000 насшин мк-кантусу китайського коливаеться в:д 505 до 655 мг, мккантусу цукроквмкового - в1д 444 до 467 мг. Таке насшня мае невелику шль-ксть резервних поживних речовин для про-ростання та збер^ання. Розмноження мк-кантусу шляхом вииву кондицшного насш-ня в ^рунт не забезпечуе високого коеф:щен-та розмноження, тому що з одше! проросло! насшини можна отримати лише одну росли-ну. До того ж, рослини мккантусу, отриман таким шляхом, е дуже вразливими i майже ви гинуть протягом зимового перюду [10]. Тому кнуе проблема насшневого розмножен-ня рослин цього роду.
Таким чином, актуальним питанням сьо-годення е розроблення нових бютехнолопч-них метод:в розмноження мккантусу та створення нових вихвдних форм для зб^ь-шення генетичного р:зноманггтя наявних вид:в з погляду використання 1х як сирови-ни для бюенергетики.
В1домо, що вперше дослвдження сорив M. sinensis в умовах in vitro проводили N. J. Gawel та ш. [11] у 1987 р., як: показали, що недостигл: суцвгття мккантусу е кращими експлантами для калусогенезу, н:ж молод: листки, вузлов: сегменти, мерис-тематичн: тканини чи ж:ноч: статев: кл:ти-ни. Було встановлено, що морфогенш калу-си утворюються усшшшше на середовищ^ з вмятом 2,4-Д, шж на середовищ^ з вмктом Шклораму, який було запропоновано рань ше. За даними автор:в, регенеращя ввдбу-валася шляхом органогенезу. Перша до-кладна :нформац:я про культуру in vitro щодо утворення калусних тканин з екс-плант:в м:скантусу г:гантського була опу-блшована I. Lewandowski та ш. [2]. Holme I. B., Petersen K. K. [12] пор:вняли жи-вильн: середовища N6 та Мурас:ге-Скуга (МС) на 1хню здатшсть утворювати швид-коросл: та регенерацшт клиинш суспензп
MicKaHTycy riraHTCbKoro з калус1в, вироще-них з недостиглих суцвгть.
У сучасних дослвдженнях для отримання калусних культур використовують рiзнi експланти рослин - бруньки, пагони, квгт-ки та достигле нaciння ммкантусу [13, 14].
Aнaлiз лiтeрaтyрниx джерел та узагаль-нення вимог до складу живильних середо-вищ, призначених для шдукци калусогенезу рiзниx частин рослин [15-17], св1дчать, що найб^ьшу кiлькicть кaлyciв отримували, використовуючи середовища Гамборга-В5 або Чу, мoдифiкoвaнi за вмicтoм рeгyлятoрiв росту, зокрема з додаванням 2 мг/л 2,4-Д. Мо-дифшоване середовище МС використовували як регенерацшне: сахароза (20 г/л) + гельрм (3 г/л) + БАП (5 мг/л) + НУК (0,24 мг/л) або 2,4-Д (1 мг/л). Щодо середовищ для отримання калусних лшш та регенерацп з них повно-цiнниx рослин iз нас1ння з низькою cxoжicтю та життездатшстю, тaкi дaнi вiдcyтнi.
Мета дослгджепь - отримати рослини Miscanthus sacchariflorus (Maxim.) Hack та Miscanthus sinensis Andersson в кyльтyрi in vitro шляхом непрямого морфогенезу.
Материали та методика досл1*джень
Дослвдження проводили в 1нститут1 бю-енергетичних культур i цукрових буряк1в НААН Украши протягом 2012-2015 рр. У досл1дах використовували нaciння M. sinensis юмецько'1 фiрми «Jelitto» та нaciння M. sacchariflorus росшського походження 2008 року репродукцш. Лабораторна cxoжicть насшня M. sinensis та M. sacchariflorus -6-8%, проростки е нежиттездатними. В умовах поля схожють нaciння M. sinensis та M. sacchariflorus дoрiвнювaлa нулю. Кль-шсть cxoдiв in vitro - 6-10%, ю.лью.сть життездатних прoрocткiв - 0,5-1%. Най-iмoвiрнiшe, низька cxoжicть та життездат-нicть зyмoвлeнi вiкoвими змшами зародка, що не дае змоги насшню прорости та розви-ватись дaлi. Стeрилiзyвaли та пророщували насшня з використанням загальних схем та мeтoдiв, розроблених для шших культур, як адаптували для роботи з насшням рослин мicкaнтycy в кyльтyрi in vitro [18-20].
Основою усшшного культивування та розмноження рослин ммкантусу in vitro е пра-вильний дoбiр живильних середовищ. У дос-л1дженнях було прoaнaлiзoвaнo та розробле-но прописи трьох тишв середовищ:
1) середовища для шшДацп та утворення кaлюciв з насшня з низькою схожмтю та життездаттстю;
2) середовища для стимуляци морфогенезу та регенераци мшроклошв;
ISSN 2518-1017 PlaNT VtfRIETIEs StuDYING AND Protection, 2017, vol. 13, No 1
13
3) середовище для розмноження мшро-клошв.
Для введення мккантусу в культуру на-сшня стерил1зували розчином 1-2% гшо-хлорида натр1ю протягом 15-25 хв. Стериль-не насшня висаджували на сер1ю середовищ першого типу - модифшоване середовище МС, що мктило 1/2 дози макроелеменпв та повну дозу мшроелеменпв, вмамши: т1амш (0,1-1,0 мг/л), шридоксин (0,1-1,0 мг/л), ншотинову кислоту - (0,5-1,0 мг/л) та ас-корбшову кислоту (1,0 мг/л), з додаванням амшокислот: глютамшово! (200-500 мг/л), аспарагшово! (30-50 мг/л), прозину (1-
10 мг/л), аргшшу (2-10 мг/л), идроксипро-лшу (2-4 мг/л), регулятор1в росту: 6-БАП (0,3-0,8 мг/л) та АБК (0,1-0,4 мг/л), 2,4-Д (1,0-2,5 мг/л) або 2,4-Д (1,0-2,5 мг/л) + ЮК (0,5-1,0 мг/л), або 2,4-Д (1,0-2,5 мг/л) + НОК (0,5-1,0 мг/л), сахарози (40 г/л). Як еталон використовували середовища Гам-борга-В5 або Чу, модифшоваш за вмятом регулятор1в росту (табл. 1). Культивували насшня шсля висаджування на живильне середовище за температури 22-30 °С та в1д-носно'1 вологосп повмря 50-80%. Шсля прол1фераци калусу його переносили на другу сер1ю середовищ, яка в1др1знялася ввд
Таблиця 1
Склад живильних середовищ для 1'ндукц11 калусогенезу з нас'ння мккантусу з низькою схожктю та життездатнктю
Компоненти середовища Середовища
Гамборга - В5 модифшоване за вмктом регулятортв росту Чу - N6 модифшоване за вмктом регулятортв росту МС МС модифшоване
Макроелементи, г/л
NH.NO, - - 1650,0 825,0
134,0 463,0 - -
2500,0 2830,0 1900,0 950,0
СаС1/2Н„0 - 166,0 440,0 220,0
СаС12 б/в2 113,24 - - -
МрБ0,^7Н20 - 185,0 370,0 185,0
мябо; б/в2 122,0 - - -
КНоРО, - 400,0 170,0 85,0
NaH2P0/ б/в 130,5 - - -
Мкроелементи, г/л
НзВОз 3,0 1,6 6,2 6,2
МпБ0,^4Н,0 10,0 4,4 22,3 22,3
СоС12 -6Н20 0,025 0,025 0,0025 0,0025
^0/5Н„0 0,025 0,025 0,0025 0,0025
ZnS0/ •7Н20 2,0 1,5 8,6 8,6
Na2Mo0,•22H20 0,25 0,025 0,25 0,25
К1 0,75 0,8 0,83 0,83
Fe S0,•7H20 27,85 27,8 27,8 27,8
МаЕС>ТА^2>Н0 37,25 - 37,4 37,4
В1там1ни, мг/л
Т1ам1н 10,0 3,0 0,1 1,0
П1'ридоксин 1,0 2,0 0,5 1,0
Н'котинова кислота 1,0 2,0 0,5 1,0
Аскорб1'нова кислота - - - 1,0
Б1'отин - 2,0 - -
Ам1нокислоти, мг/л
Глщин - - 2,0 2,0
Глутам1'нова - - - 300
Аспарпнова - - - 50,0
Т1'розин - - - 5,0
Арг1н1н - - - 3,0
Г1дроксипрол1н - - - 2,0
Регулятори росту, мг/л
6-БАП - - - 0,6
К'нетин 0,1 0,5 0,2 -
2,4-Д 2,0 2,0 - 2,5
10К - - 2,0 -
Н0К - 0,5 - -
АБК - - - 0,3
3aKiHHeHHa ma6nuu,i 1
CepeflOBMùa
KoMnoHeHTM TaMÔOpra - B5 Hy - N6
cepeflOBM^a MOflMÔiKOBaHe 3a bmîctom MOflMÔiKOBaHe 3a bmîctom MC MC MOflMÔiKOBaHe
peryëflTOpiB pocTy peryëflTopiB pocTy
iHwi opraHiHHi aomIwkm, r/ë
Me3Oi'HO3MT - 0,08 0,1 0,1
Me3Oi'HO3MTOë 0,1 - - -
Caxapo3a 30,0 30,0 30,0 40,0
MaëbTO3a - 9,0 - -
Arap - - 8,0 8,0
TeëbpiT 3,0 3,0 - -
nepmoï bmîctom Bi.TaMi.HiB Ta peryaaTopiB poc-Ty: TiaMiH (0,1-0,5 Mr/a), nipHfloKCHH (0,10,5 Mr/a), HiKoTHHoBa KHcaoTa - (0,5 Mr/a), acKopôiHoBa KHcaoTa (1,0 Mr/a), raroTaMiHoBa aMiHoKHcaoTa (250-300 Mr/a), 6-BAn (1,03,0 Mr/a), HOK (0,3-1,0 Mr/a), caxapo3a (40 r/a) i BHTpHMyBaaH flo noaBH nepBHHHHx кopiнцiв, ôpyHtoK Ta naroHiB. Ïicaa Toro, aK naroHH flocaraH çsbbhœkh 2-3 cm, ïx BifloK-peMaroBaaH Bifl KaaycHoï MacH i nepecaflœyBa-aH Ha TpeTro cepiro cepefloBHù flaa po3MHo-œeHHa a6o flenoHyBaHHa (MoflHÔiêoBaHe ara-pH3oBaHe cepefloBHùe MC, ùo MicTHao 1/2 flo3H MaKpoeaeMeHTiB Ta MiêpoeaeMeHTH y noB-Hié floçi, flo CKaafly aKoro floflaTKoBo BBoflHaH: TiaMiH (10,0 Mr/a), nipHfloKCHH, HiKoTHHoBy KHcaoTy, acKopôiHoBy KHcaoTy (no 1,0 Mr/a), raroTaMiHoBy aMiHoKHcaoTy (250-300 Mr/a), 6-BAn (0,3-0,5 Mr/a), HOK (0,3-1,0 Mr/a) Ta TK (0,2 Mr/a).
y flocaiflax niflpaxoByBaaH KiatKicTt oTpH-MaHHx KaayciB y BiflcoTKax Bifl HaciHHa, ùo
npopocao, BH3Ha^aaH ^acToTy pereHepa^ï (%), niflpaxoByBaaH KiatKicTt MiKpopocaHH (mT.), oTpHMaHHx ^epe3 4 THœHi KyatTHByBaHHa Ka-aycy Ha pereHepa^HHoMy cepefloBHùi.
PeçyëbTaTM flocëiflœeHb
BHacaifloK onTHMi3a^ï Ta floôopy CKaafly œHBHatHoro cepefloBHùa MC 6yaH po3po6ae-Hi nponHCH œHBHatHHx cepefloBHù, flaa iH-fly^iï KaaycoreHe3y (nepma cepia) 3 HaciHHa MicKaHTycy 3 HH3tKoro cxoœicTro Ta khttg-3flaTHicTro, MopôoreHe3y KaayciB (flpyra ce-pia) Ta po3MHoœeHHa (TpeTa cepia) MiKpo-KaoHiB MicKaHTycy b yMoBax in vitro. B Ta6-aH^x 1 i 2 HaBefleHo CKaafl цнx cepefloBHù nopiBHaHo 3 ÎH0HMH BifloMHMH œHBHatHHMH cepefloBHùaMH.
Pe3yatTaTH flocaiflœeHt CBifl^aTt, ùo Haé-Kpaùi pe3yatTaTH 3 npoaiôepa^ï KaayciB 6yaH oTpHMaHi nifl ^ac 3acTocyBaHHa MoflHÔi-KoBaHoro arapH3oBaHoro cepefloBHùa MC 3 flo-flaBaHHaM BiTaMiHiB (TiaMiHy, nipHfloKCHHy,
Taônuun 2
CKëafl MopôoreHHMX œMBMëbHMX cepefloBHù (flpyra cepia) Ta cepefloBHù flëfl poçMHoœeHHa MiKpoKëOHiB MicKaHTycy b yMoBax in vitro (TpeTa cepia)
KoMnoHeHTM cepeflOBMùa MopôoreHHi cepeflOBMùa CepeflOBMùe flëfl po3MHoœeHHA MlKpOKëOHlB
MC MOflMÔiKOBaHe (eTaëOH) MC MOflMÔiKOBaHe
MaêpoeëeMeHTM MC noBHa flO3a 1/2 flO3M 1/2 flO3M
MiêpoeëeMeHTM MC noBHa flO3a noBHa flO3a noBHa flO3a
BiTaMiHM, Mr/ë
TiaMiH 0,1 10,0 10,0
ÏipMflOKcMH 0,5 1,0 1,0
HiêOTMHOBa KMcëOTa 0,5 1,0 1,0
AcêopôiHOBa KMcëOTa - 1,0 1,0
AMiHOKMcëOTM, Mr/ë
TëiuMH 2,0 2,0 2,0
TëyTaMiHOBa KMcëOTa - 250,0 250,0
PeryëATopM pocTy, Mr/ë
6-BAn 5,0 2,0 0,5
HOK 0,24 0,3 0,5
a6o 2,4-fl 1,0 - -
TK - - 0,2
iHwi opraHiHHi aomIwkm, r/ë
Me3oiHO3MT 0,1 0,1 0,1
Caxapo3a 20,0 40,0 40,0
Arap 8,0 8,0 8,0
TeëbpiT 3,0 - -
HiKOTHHOBOi та аскорбшово! кислот), амшо-кислот (глютамшово!, аспарагшово!, трози-ну, аргiнiнy, гiдроксипролiнy) та регулято-piB росту (6-БАП, 2,4-Д, АБК) у кiлькостяx, що наведен в таблицi 1, пiд час використан-ня б1льшо'1 кiлькостi сахарози (40 г/л), по-piвняно з еталонними середовищами (30 г/л), без мальтози та гельриту.
Зидно зi спостереженнями, пpолiфеpацiя калyсiв в1дбувалася через 13-15 дiб пiсля введення насшня мiскантyсiв у культуру in vitro (рис. 1).
Отримаш калуси (щ1льш та середньо! щiльностi) мали неоднор1дне забарвлення -
Рис. 1. Калусна тканина М1*скантусу
вiд жовто-зеленого до зеленого з антощано-вими вкрапленнями. Через 60 дiб отpиманi калуси були пересаджеш на нове морфоген-не живильне середовище (табл. 2), яке вГд-piзнялося в1д попереднього б1льшою к1ль-кiстю вiтамiнy В1 (тiамiнy) - 10 мг/л за-мiсть 1 мг/л, вiдсyтнiстю 2,4-Д та АБК, за-стосуванням 6-БАП у б1льшш кiлькостi (2,0 мг/л) та НОК - 0,3 мг/л.
Внасл1док модифшаци живильного сере-довища вихГд калyсiв становив 100% ыль-костi висадженого насiння in vitro.
За спостереженнями, морфогенез калусно! тканини починався з ризогенезу - утворення первинних коршщв (рис. 2), а через 5-7 дiб на повеpxнi морфогенного калусу утворюва-лися пеpвиннi бруньки та листки (рис. 3) i формувалися первинш мiкpоклони (рис. 4).
Новоутвореш мiкpоклони мiскантyсy роз-мipом 0,5-0,7 см пересаджували на середо-вища для розмноження мiкpоpослин в умо-вах in vitro (третьо! серГ!) з меншою кiлькiс-тю 6-БАП (0,5 мг/л) та додаванням ГК (0,21,0 мг/л), де згодом сформувались повноцш-нГ рослини (рис. 5).
П1драхунки св1дчать, що, завдяки стимуля-ц1! калусогенезу у насшня з низькою схожГс-тю й життездатнГстю та морфогенезу калусГв, найвищий коеф1цГент розмноження (60-70 з
Рис. 2. Морфогенез калусу - утворення первинних кор!*нц1*в
Рис. 3. Калусна тканина. Ркт i розвиток первинних листк!*в
Рис. 4. Мжророслини мiскантусу in vitro
Рис. 5. Рослини мккантусу, сформован внаст'док морфогенезу калусiв
Taônuun 3
BnëMB cKëafly œMBMëbHoro cepefloBHùa Ha KaëycoreHeç, nacroTy pereHepauiï Ta KiëbKicTb oTpMMaHMX MiêpopocëMH MicKaHTycy KMTaécbKoro Ta uyêpoKBiTKoBoro
BMfl CKëafl œMBMëbHMX cepeflOBMù flëfl oTpMMaHHA KaëyciB Ta pereHepa^i'i pocëMH KlëbKicTb oTpMMaHMX KaëyciB y % Bifl HacÏHHfl, ùo npopocëo HacTOTa pereHepa^ï, % KlëbKicTb MiKpopocëMH, oTpMMaHMX Hepe3 4 TMœHi KyëbTMByBaHHA Kaëycy Ha pereHepa^éHOMy cepeflOBMùi, 0T.
M. sinensis Hy (TaM6opra) MOflMÔiKOBaHe - eTaëOH 13,3±0,1-31,2±0,2 20±0,3 1,3-3,1
M. sinensis MC MOflMÔiKOBaHe 100,0 50,0±0,7 30-35
M. sacchariflorus MC MOflM^iKOBaHe 100,0 100,0 60-70
oflHieï HaciHHHH) 6yB oTpHMaHHé flaa MicKaHTy-cy ^KpoKBÏTKoBoro, Tofli aK flaa MicKaHTycy KHTaéctKoro ^é noKa3HHK 6yB TpoxH hhsîhm - 30-35 BHacaifloK HHœ^oro noKa3HHKa pereHe-pa^ï (50%). Ha cepefloBHùax eTaaoHy, fle êiat-KicTt oTpHMaHHx KaayciB y BiflcoTKax Bifl Ha-ciHHa, ùo npopocao, CTaHoBHaa 13,3-31,2%, a noKa3HHK pereHepa^ï - 20%, KoeôiE;ieHT po3-MHoœeHHa CTaHoBHB 1,3-3,1 (Ta6a. 3).
TaKHM îzhom, 3aBflaKH MoflHÔiKa^ï cepeflo-bhù flaa irn^ia^ï KaaycoreHe3y Ta Mopôore-He3y KaayciB Koeô^ieHT po3MHoœeHHa poc-aHH MicKaHTycy цyкpoквiткoвoro MoœHa nifl-bhùhth b cepeflHtoMy b 40 pa3iB, MicKaHTycy KHTaéctKoro - b 20 pa3iB.
PocaHHH MicKaHTycy KHTaéctKoro Ta ^k-poKBiTKoBoro 6yaH BHcaflœeHi b yMoBH Bifl-KpHToro tpyHTy 6e3 nonepeflHtoro BHpoùy-BaHHa b тenaнцi (pHC. 6).
flaa nocTynoBoï aflanTa^ï pocaHH flo yMoB in vivo 6yaH CTBopeHi TenaH^Hi yMoBH (bhko-pHCToByBaaH ^acTHHH naacTMacoBHx naamoK, aêi ùoflHa 3HiMaaH 3 pocaHH), ùo flaao Moœ-aHBicTt pocaHHaM noBHicTro aflanTyBaTHca flo yMoB floBêiaaa (pHC. 7).
Bmchobkm
ÂHacaifloK MoflHÔiKa^ï cepefloBHùa Mypa-cire-Cêyra 3a BMicToM MaKpoeaeMeHTiB, Bira-MiiiB, aMiHoKHcaoT Ta peryaaTopiB pocTy po3-poôaeHo CKaafl œHBHatHoro cepefloBHùa flaa iHflyK^ï KaaycoreHe3y 3 HaciHHa MicKaHTycy 3 HH3tKoro cxoœicTro Ta œHTTe3flaTHicTro npo-pocTêiB. Haéêpaùi pe3yatTaTH 6yaH oTpH-MaHHi y pa3i BHKopHCTaHHa cepefloBHùa 3 1/2 flo3H MaKpoeaeMeHTiB, flo aêoro BBefleHo aMi-HoKHcaoTH: raroTaMiHoBa (300 Mr/a), acnapa-riHoBa (50 Mr/a), Tipo3HH (5 Mr/a), apriiiH (3 Mr/a), riflpoKCHnpoaiH (2 Mr/a) Ta peryaaTo-pH pocTy: 6-BAÏ (0,6 Mr/a), 2,4-fl (2,5 Mr/a) Ta ABK (0,3 Mr/a).
Po3po6aeHo CKaafl MopôoreHHoro œHBHatHo-ro cepefloBHùa flaa pereHepa^ï MiêpopocaHH 3 Kaaycy - MoflHÔiêoBaHo arapH3oBaHe cepefloBH-ùe Mypacire-Cêyra 3a BMicToM MaKpoeaeMeHTiB (1/2 flo3è) Ta BiTaMiiiB (3a yaéToM): TiaMiH
Phc. 6. AflanTauin pocëMH MicKaHTycy flo yMoB in vivo
Pmc. 7. PocëHHa M. sacchariflorus b yMoBax in vivo
(10,0 Mr/a), nipHfloKCHH (1,0 Mr/a), HiêoTHHo-Ba KHcaoTa (1,0 Mr/a), acKopôiHoBa KHcaoTa (1,0 Mr/a), 3 floflaBaHHaM raroTaMiHoBoï aMi-HoKHcaoTH (250,0 Mr/a), 6-BAÏ (2,0 Mr/a), HOK (0,3 Mr/a), Ha aêoMy oTpHMaHo CToBifl-coTKoBy pereHepa^ro MicKaHTycy ^KpoKBÏr-KoBoro i n'aTflecaTHBiflcoTKoBy - MicKaHTycy KHTaéctKoro.
Po3po6aeHo CKaafl œHBHatHoro cepefloBHùa flaa po3MHoœeHHa MiêpoKaoHiB MicKaHTycy b yMoBax in vitro, aêe Biflpi3Haaoca Bifl nonepeflHtoro 3a BMicToM peryaaTopiB pocTy: 6-BAÏ (0,5 Mr/a) Ta TK (0,5-1,0 Mr/a).
Завдяки модифшаци середовищ для шща-ци калусогенезу та непрямого морфогенезу коефщ1ент розмноження шдвищено: Mic-кантусу цукроквiткового бiльше шж у 40 pa3iB, мicкaнтуcу китайського - в 20 рaзiв.
Використана литература
1. Griffiths M. Index of Garden Plant / M. Griffiths. - Portland, OR : Timber Press, 1994. - P. 867-874.
2. Lewandowski I. Potential of Miscanthus genotypes in Europe: overwintering and yields / I. Lewandowsk', J. C. Clifton-Brown, M. Deuter // Alternative crops for sustainable agriculture : Proc. of Workshop / T. Mela, J. Christiansen, M. Kontturi [et al.] (eds). (BioCity, Turku, Finland, 13-15 June 1999). - Luxembourg : Office for Official Publications of the European Communities, 1999. - P. 46-52.
3. Systematics of Miscanthus / T. R. Hodkinson, S. A. Renvoize, M. W. Chase // Aspects Appl Biol. - 1997. - Vol. 49. - P. 189-197.
4. Cytogenetic analysis of Miscanthus x giganteus and its parent forms / A. Chramiec-Gt^bik, A. Grabowska-Joachimiak, E. Sli-winska [et al.] // Caryologia. - 2012. - Vol. 3. - P. 234-242. doi: 10.1080/00087114.2012.740192
5. Сиваш 0. Акумуляц'я сонячноТ енерп'Т: фотосинтез чи штучт системи / 0. 0. Сиваш // Бтотехнолоп'я. - 2012. - № 6. - C. 27-38.
6. Quantifying and mapping the human appropriation of net primary production in Earth's terrestrial ecosystems /
H. Haberl, K. Erb, F. Krausmann [et al.] // Proc Natl Acad Sci USA. - 2007. - No. 104. - P. 12942-12947.
doi: 10.1073/pnas.0704243104.
7. Discovery of natural Miscanthus (Poaceae) triploid plants in sympatric populations of Miscanthus sacchariflorus and Miscanthus sinensis in southern Japan / А. Nishiwaki, А. Mi-zuguti, S. Kawabata [et al.] // Am. J. Bot. - 2011. - Vol. 98, No. 1. - P. 154-159. doi: 10.3732/ajb.1000258
8. Sterility of Miscanthus x giganteus results from hybrid icompatibility / A. Stomka, E. Kuta, A. Ptazek [et al.] // Acta Biol Cracov Ser Bot. - 2012. - Vol. 54, Iss. 1. - P. 113-120. doi: 10.2478/v10182-012-0011-1
9. Deuter M. Genetic resources of Miscanthus and their use in breeding / M. Deuter, J. Abraham // Biomass for energy and industry : proceedings of the 10th European conference and technology exhibition (8-11 June 1998, Wurzburg, Germany).
- Wurzburg, 1998. - P. 775-777.
10. Beale C. V. Can perennial C4 grasses attain high efficiencies of radiant energy conversion in cool climates? / C. V. Beale, S. P. Long // Plant Cell Environ. - 1995. - Vol. 18, Iss. 6.
- P. 641-650. doi: 10.1111/j.1365-3040.1995.tb00565.x
11. Gawel N. J. Propagation of Miscanthus sinensis through tissue culture / N. J. Gawel, C. D. Robaker, W. L. Corley // Hortscience.
- 1987. - Vol. 22. - P. 1137.
12. Holme I. B. Callus induction and plant regeneration from different explant types of Miscanthus x ogiformis Honda 'Giganteus'/ I. B. Holme, K. K. Petersen // Plant Cell Tiss Organ Cult.
- 1996. - Vol. 45, Iss. 1. - P. 43-52. doi: 10.1007/BF00043427.
13. Miscanthus: European experience with a novel energy crop /
I. Lewandowski, J. C. Clifton-Brown, J. M. 0. Scurlock, W. Huisman // Biomass Bioenerg. - 2000. - Vol. 19, Iss. 4.
- P. 209-227. doi: 10.1016/S0961-9534(00)00032-5.
14. Petersen K. K. Callus induction and plant regeneration in Miscanthus x ogiformis Honda 'Giganteus' as influenced by benzyladenine / K. K. Petersen // Plant Cell Tiss Organ Cult.
- 1997. - Vol. 49, Iss. 2. - P. 137-140. doi: 10.1023/A:1005808329685
15. Ptazek A. Improvement of medium for Miscanthus giganteus callus induction and plant regeneration / A. Ptazek, F. Dubert // Acta Biol Cracov Ser Bot. - 2010. - Vol. 52, Iss. 1. - P. 105110. doi: 10.2478/v10182- 010- 0013-9
16. Establishment of a Regeneration System by Callus Induction from Explants of Miscanthus sinensis / E. S. Seong, J. H. Yoo,
H. Y. Kil [et al.] // J Korean Soc Appl Biol Chem. - 2010. -Vol. 53, Iss. 6. - P. 661-667. doi: 10.3839/jksabc.2010.101
17. Plant cell and tissue culture: a laboratory manual / J. Reinert, M. M. Yeoman. - Berlin : Springer-Verlag, 1982. - 83 p.
18. Бутенко P. Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнология на их основе / P. Г. Бутенко. - М. : ФБК-ПРЕСС, 1999. - 152 с.
19. Калинин Ф. Л. Технология микроклонального размножения растений / Ф. Л. Калинин, Г. П. Кушнир, В. В. Сарнацкая - К. : Наук. думка, 1992. - 232 с.
20. Кушт'р Г. П. Мшроклональне розмноження рослин / Г. П. Кушт'р, В. В. Сарнацька. - К. : Наук. думка, 2005. - 271 с.
References
1. Griffiths, M. (1994). Index of Garden Plant. Portland, OR: Timber Press.
2. Lewandowski, I., Clifton-Brown, J. C., & Deuter, M. (1999). Potential of Miscanthus genotypes in Europe: over-wintering and yields. In T. Mela, J. Christiansen, M. Kontturi, K. Pahkala, A. Partala, M. Sahramaa, ... K. Pithan (Eds.), Alternative crops for sustainable agriculture: Proc. of Workshop (рр. 46-52). June 1315, 1999, BioCity, Turku, Finland.
3. Hodkinson, T. R., Renvoize, S. A, & Chase, M. W. (1997). Systematics in Miscanthus. Aspects Appl Biol., 49, 189-198.
4. Chramiec-Gt^bik, A, Grabowska-Joachimiak, A. A., Sliwinska, E., Legutko, J., & Kula, A. (2012). Cytogenetic analysis of Miscanthus x giganteus and its parent forms. Caryologia, 3, 234-242. doi: 10.1080/00087114.2012.740192
5. Syvash, O. O (2012). Accumulation of solar energy: photosynthesis or artificial systems. Biotekhnolohiia [Biotechnology], 6, 27-38. [in Ukrainian].
6. Haberl, H., Erb, K., Krausmann, F., Gaube, V., Bondeau, A., Plutzar, C., ... Fischer-Kowalski, M. (2007). Quantifying and mapping the human appropriation of net primary production in Earth's terrestrial ecosystems. Proc Natl Acad Sci USA., 104, 1294212947. doi: 10.1073/pnas.0704243104.
7. Nishiwaki, А., Mizuguti, A., Kawabata, S., Toma, Y., Ishigaki, G., Miyashita, T., ... Stewart, J. R. (2011). Discovery of natural Miscanthus (Poaceae) triploid plants in sympatric populations of Miscanthus sacchariflorus and Miscanthus sinensis in southern Japan. Am. J. Bot., 98(1), 154-159.
doi: 10.3732/ajb.1000258
8. Stomka, A., Kuta, E., Ptazek, A., Dubert, F., Zur, I., Dubas, E., ... Zurek, G. (2012). Sterility of Miscanthus x giganteus results from hybrid incompatibility. Acta Biol Cracov Ser Bot, 54(1), 113-120. doi: 10.2478/v10182-012-0011-1
9. Deuter, M., & Abraham, J. (1998) Genetic resources of Miscanthus and their use in breeding. Biomass for energy and industry: Proc. of the 10th European conference and technology exhibition (pp. 775-777). June 8-11, 1998, Wurzburg, Germany.
10. Beale, C. V., & Long, S. P. (1995). Can perennial C4 grasses attain high efficiencies of radiant energy conversion in cool climates? Plant Cell Environ, 18(6), 641-650.
doi: 10.1111/j.1365-3040.1995.tb00565.x
11. Gawel, N. J., Robaker, C. D., & Corley, W. L. (1987). Propagation of Miscanthus sinensis through tissue culture. Hortscience, 22, 1137.
12. Holme, I. B., & Petersen, K. K. (1996). Callus induction and plant regeneration from different explant types of Miscanthus x ogiformis Honda 'Giganteus'. Plant Cell Tiss Organ Cult, 45(1), 43-52. doi: 10.1007/BF00043427
13. Lewandowski, I., Clifton-Brown, J. C., Scurlock, G. M., & Huisman, W. (2000). Miscanthus: European experience with a novel energy crop. Biomass Bioenerg, 19(4), 209-227.
doi: 10.1016/S0961-9534(00)00032-5
14. Petersen, K. K. (1997). Callus induction and plant regeneration in Miscanthus x ogiformis Honda 'Giganteus' as influenced by benzyladenine. Plant Cell Tiss Organ Cult, 49(2), 137-140. doi: 10.1023/A:1005808329685
15. Ptazek, A., & Dubert, F. (2010). Improvement of medium for Miscanthus x giganteus callus induction and plant regeneration. Acta Biol Cracov Ser Bot, 52(1), 105-110. doi: 10.2478/ V10182-010-0013-9
16. Seong, E. S., Yoo, J. H., Kil, H. Y., Lee, J. G., & Yu, C. Y. (2010). Establishment of a Regeneration System by Callus Induction from Explants of Miscanthus sinensis. J Korean Soc Appl Biol Chem, 53(6), 661-667. doi: 10.3839/jksabc.2010.101
17. Reinert, J., & Yeoman, M. M. (1982). Plant cell and tissue culture: a laboratory manual. Berlin: Springer-Verlag.
18. Butenko, R. G. (1999). Biologiya kletok vysshikh rasteniy in vitro i biotekhnologiya na ikh osnove [Biology of higher plant cells in vitro and biotechnology based on them]. Moscow: FBK-PRESS. [in Russian]
19. Kalinin, F. L., Kushnir, G. P., & Sarnatskaya, V. V. (1992). Tekhnolo-giya mikroklonal'nogo razmnozheniya rasteniy [Microclonal plant propagation technology]. Kiev: Naukova dumka. [in Russian]
20. Kushnir, H. P., & Sarnatska, V. V. (2005). Mikroklonalne rozmnozhennia roslyn [Microclonal plant propagation]. Kyiv: Naukova dumka. [in Ukrainian]
УДК 631.681.16
Гонтаренко С. H., Лашук С. А.* Получение растений Miscanthus sacchariflorus (Maxim.) Hack и Miscanthus sinensis Andersson в культуре in vitro путем непрямого морфогенеза // Сортовивчення та охорона прав на сорти рослин. - 2017. - Т. 13, № 1. - С. 12-19. http://dx.doi.org/10.21498/2518-1017.13.1.2017.97219
Институт биоэнергетических культур и сахарной свеклы НААН Украины, ул. Клиничная, 25, г. Киев, 03141, Украина, *e-mail: [email protected]
Цель. Получить растения Miscanthus sacchariflorus (Maxim.) Hack и Miscanthus sinensis Andersson в культуре in vitro путем непрямого морфогенеза. Методы. Биотехнологические, математико-статистические. Результаты. Разработан состав питательной среды для индукции ка-лусогенеза из семян мискантуса с низкой всхожестью и жизнеспособностью - модифицирована среда Мурасиге-Скуга (МС) по содержанию макроэлементов (1/2 дозы), в которую введены аминокислоты (глютаминовая - 300 мг/л, аспарагиновая - 50 мг/л, тирозин - 5 мг/л, аргинин - 3 мг/л, гидроксипролин - 2 мг/л) и регуляторы роста (6-БАП -0,6 мг/л, 2,4-Д - 2,5 мг/л и АБК - 0,3 мг/л). Разработан состав питательной среды для регенерации микрорастений из калуса - модифицирована агаризованная среда МС по содержанию макроэлементов (1/2 дозы) с добавлением витаминов: тиамина (10,0 мг/л), пиридоксина (1,0 мг/л), нико-
тиновой кислоты (1,0 мг/л) (по Уайту), аскорбиновой кислоты (1,0 мг/л), глютаминовой аминокислоты (250 мг/л), 6-БАП (2,0 мг/л), НОК (0,3 мг/л), на которой получена стопроцентная регенерация микрорастений M. sacchariflorus (Maxim.) Hack и пятидесятипроцентная - M. sinensis Andersson. Благодаря модификации сред для инициации калусогенеза и морфогенеза калусов коэффициент размножения M. sinensis повышен в среднем в 20 раз, M. sacchariflorus - в 35-40 раз. Выводы. Получены растения M. sacchariflorus (Maxim.) Hack и M. sinensis Andersson в культуре in vitro путем инициации калусогенеза и регенерации микрорастений из семян с низкой всхожестью и жизнеспособностью на питательных средах определенного состава.
Ключевые слова: мискантус, каллус, биотехнологические методы, семена, питательная среда.
UDC 631.681.16
Gontarenko, S. M., & Lashuk, S. O.* (2017). Obtaining plant Miscanthus sacchariflorus (Maxim.) Hack and Miscanthus sinensis Andersson in vitro culture by indirect morphogenesis. Plant Varieties Studying and Protection, 13(1), 12-19. http://dx.doi.org/10.21498/2518-1017.13.1.2017.97219
Institute of Bioenergy Crops and Sugar Beet of NAAS, 25 Klinichna Str., Kyiv, 03141, Ukraine, *e-mail: [email protected]
Purpose. To obtain Miscanthus sacchariflorus (Maxim.) Hack and Miscanthus sinensis Andersson in vitro culture by indirect morphogenesis. Methods. Biotechnological procedures, mathematical and statistical analyses. Results. Composition of nutrient medium was developed intended for induction of callusogenesis from Miscanthus seeds with a poor germination and viability of seedlings - Murashige and Skoog (MS) medium was modified for the amount of macroelements (half-dose) that was supplemented with amino acids (300 mg/l of glutamic acid, 50 mg/l of aspartic acid, 5 mg/l of tyrosine, 3 mg/l of arginine, 2 mg/l of hydroxy-proline) and plant growth regulators [2,5 mg/l of 2.4D (2.4-Dichlorophenoxyacetic acid), 0,6 mg/l of BAP (6-Ben-zyl-aminopurine) and 0,3 mg/l of ABA (Abscisic acid)]. Composition of nutrient medium was developed for regeneration of microplants from callus - agar MS medium was modified for the amount of macroelements (half-dose) supplement-
ed with vitamins: 10 mg/l of thiaminum, 1,0 mg/l of pyri-doxine, 1,0 mg/l of nicotinic acid (by White), 1,0 mg/l of ascorbic acid, 250 mg/l of glutamic acid, 2,0 mg/l of BAP, 0,3 mg/l of NAA (Naphthaleneacetic acid). On this medium, 100% regeneration of M. sacchariflorus (Maxim.) Hack and 50% regeneration of M. sinensis Andersson was obtained. Due to media modification aimed at initiating callusogenesis and microplants regeneration, reproduction factor of M. sinensis was increased 20 times at the average, M. sacchariflorus - 35-40 times. Conclusions. Plants of M. sacchariflorus (Maxim.) Hack and M. sinensis Andersson were obtained in vitro culture by initiation of callusogenes and microplants regeneration from the Miscanthus seeds with poor germination and viability on nutrient media of certain composition.
Keywords: Miscanthus, callus, biotechnological methods, seed, nutrient medium.
Надiйшла 15.12.2016 Погоджено до друку 14.03.2017
