CC BY
63УДК 631.681.16 http://dx.doi.Org/10.21498/2518-1017.13.3.2017.110703
Метод розмноження, стимуляцн росту ризом у культур1 in vitro та адаптаци у В1дкритому ^рунп представник1в роду Miscanthus
С. М. Гонтаренко, С. 0. Лашук*
1нститут б^оенергетичних культур i цукрових буряктв НААНУкра)'ни, вул. Клттчна, 25, м. Kuïe, 03110, Украта, *e-mail: [email protected]
Мета. Розробити метод розмноження, стимуляцИ" росту ризом у культур' in vitro представним'в роду Miscanthus та адаптаци ix у в1'дкритому ^рунт1 без використання тепличних комплекс'в для акл1'матизац1'1 та дорощування. Методи. Бютехнолопчт, математико-статистичт. Результати. Розроблено прописи живильних середовищ для 1'нокуляц1'1 експлант'в, розмноження папот'в, стимуляц11 росту ризом in vitro. Стерильн експланти - наа'ння, бруньки, видален з ризом, частини стебла з брунь-кою висаджували на модифковат середовища з моральною частиною за Мурас'пе-Скупа (МС), що мктили 0,5-1 дозу макро- та одну дозу мкроелеменлв, втгам1'ни (тлам1'н - 10,0 мп/л, п'ридоксин - 1,0, нкотинову кислоту - 1,0 та аскорб1нову кислоту - 1,0 мп/л) з додаванням ам1нокислот (плютам1'ново'1 - 250,0 мп/л, аспарапново'1 - 30,0, т'розину - 3,0, арп'т'ну - 2,0, пдроксипрол1'ну - 2,0 мп/л), репулятор1в росту (ГК - 0,5-1,0 мп/л, 6-БАП - 0,2, НОК - 0,1 мп/л) у р1зних вар1ац1ях. ГИсля проростання нас'ння, появи бруньок 1 утворення папот'в заввишки 1-2 см 1"х для розмноження пасирували на середовище 1'ншопо складу, яке в1'др1'зняеться в1д попередньопо вм1стом та ствв1'дношенням репулятор1в росту, зокрема п'двищеним вмктом циток1'н1'н1'в [6-БАП (0,4-0,5 мп/л), к'нетину (0,5 мп/л), адет'ну (0,5 мп/л)] у р1зних вар1ац1ях на фон' 0,2 мп/л ГК. Для стимуляц11 росту ризом мжроклони пересаджували на середовища з 1'ншим складом та ствв1'дношенням репулятор1в росту [6-БАП (0,2-0,3 мп/л) + ГК (0,5-1,0 мп/л) або 6-БАП (0,2-0,3 мп/л) + ГК (0,5-1,0 мп/л) + НОК (0,1 мп/л)], тобто з т'двищеним вмктом п'берел1'н1'в. Пкля утворення ризом завдовжки 10-15 см рослини мккантуа'в висаджували у в1'дкритий ^рунт. Стимуляц1'я утворення та росту в довжину ризом на вiдповiдниx живильних середовищах перед висаджуванням рослин Miscanthus giganteus, M. sacchariflorus та M. sinensis в умови in vivo сприяла 100% адаптаци та 100% виживанню рослин у зимовий перюд без застосування тепличних комплекс'в. Висновки. Розроблено метод розмноження мккантуа'в in vitro та адаптаци у в'дкритому ^рунп, який включае стимуляцш росту ризом та сприяе зб^льшенню ¿"хньо! довжини на живильних середовищах, до складу яких введено п'берел'н, що парантовано забезпечуе 100% збереження розмножених з культури in vitro мжророслин т'д час адаптаци у в'дкритому ^рунп та а^^тизацИ" в зимовий перюд.
Нлючов! слова: рослини мiскантусу, експланти, ризоми, аЫматиза^я, живильне середовище, in vitro, теnлuчнi комплекси.
Вступ
М1скантус пгантський (Miscanthus giganteus J.M.Greef & Deuter ex Hodkinson & Renvoize), аллотрипло'1дний габрид мгскантусу цукроквикового (M. sacchariflorus (Maxim) Benth) (тетрапло'1'д) та мскантусу китайського (M. sinensis Anderss) (дипло:д) [1, 2], розкрили перед ученими й практиками, як1 здiйснюють пошук бiоенергетичниx культур для виробниц-тва яксно':' й дешево: бiосировини, величезний бiоенергетичний потенщал, що дае змогу кон-курувати навггь з такими традицшними видами палива, як вугхлля та деревш рослини.
Оск1льки M. giganteus е трипловдом i не здатний утворювати насiння, а iншi види мс-кантусу в умовах ввдкритого грунту або фор-мують незначну шлькють насiннeвого матер^ алу, або вш е практично нежиттездатним,
Svitlana Gontarenko
http://orcid.org/0000-0003-0472-720X Snizhana Lashuk
http://orcid.org/0000-0002-9588-7761
мгскантус розмножують вегетативним шляхом - подшом кореневищ (ризомами), укор^ ненням мiжвузлiв. Посадковий матерiал - ризоми - отримують з дво-трирiчниx рослин мiскантусу - 50-150 ризом з одше: рослини за рш. Потенцiал мiкроклонального розмноження е на декiлька порядкiв вищим. Тому мшроклональне розмноження в культурi in vitro вважають найрезультативнiшим [3]. У крашах бвропи комерцiйно найцшшш види рослин розмножують переважно in vitro [4].
Метод розмноження ммкантусу в культурi in vitro вважають дуже продуктивним, але досить проблематичним. Одшею з проблем е висока варпсть, що робить вирощування рослин ммкантусу в культурi in vitro нерен-табельним. Hайзатратнiшою е адаптащя та дорощування регенерантiв у теплицях, тому цей споиб розмноження е занадто дорогим для вирощування ммкантусу в промислових масштабах. Розв'язання проблеми адаптаци рослин у полi без застосування тепличних комплекив сприятиме здешевленню рослин мiскантусу, тиражованих in vitro [5, 6].
Анал1з сучасних дослвджень та лгтератур-них джерел сввдчить, що процес розмножен-ня мiскантусу в культурi in vitro зазвичай включае iнокуляцiю експлантiв (ашкальш меристеми) для шдукци утворення пагошв на живильне середовище Mурасiге-Cкуга (MC), яке ммтить 1,0-5,0 мг/л 6-БАП у ком-бшаци з або без IOK - 0,2-0,45 мг/л iç суб-культивацieю кожнi 5 тижшв для розмно-ження пагошв, висаджування рослин для аклiматизацiï та дорощування в ^рунтовш сумiшi в умовах теплиць (температура день/ шч - 20/15 °C, освiтлення - 16 годин галоге-новими лампами). Для адаптаци рослин ви-користовують пластмасовi накривки, якi шс-ля експлантаци поступово видаляють [7, 8].
1стотним недолiком цього методу е вимер-зання рослин мiскантусу протягом зимового перюду в разi ïx висаджування у вiдкритий ^рунт на першому роцi вегетаци [9]. 3 метою запобиання пошкодженню та загибелi рослин у крашах бвропи для ïx адаптаци та дорощування використовують тепличнi комп-лекси, що збшьшуе вартiсть розсади та ускладнюе теxнологiю вирощування рослин [10, 11].
Мета досл1джень - розробити метод роз-множення, стимуляци росту ризом у куль-турi in vitro представнишв роду Miscanthus та адаптаци ïx у ввдкритому Грунта без ви-користання тепличних комплексiв для акль матизаци та дорощування, який дасть змогу зберегти рослини ммкантусу на першому рощ вирощування в зимовий перюд.
Материали та методика досл1*джень
Дослiдження проводили в 1нституп бю-енергетичних культур i цукрових буряшв НААН Украши протягом 2012-2014 рр. Сте-рилiзацiю та введення в культуру експлан-тiв та насшня здiйснювали з використанням загальних схем та методiв, розроблених для шших культур, якi адаптували для роботи з експлантами рослин м^кантусу в культурi in vitro [12-14].
Насшня стерилiзували 1-2% розчином гшо-хлориду натрiю протягом 15-25 хв, 3-4 рази промивали з штервалом 15 хв стерильною дистильованою водою.
Через проблему отримання асептично1' культури мiскантусу з насшня, частин стебла з бруньками та бруньок, видалених з ри-зом, внаслвдок контамшаци матерiалу (особливо ризом) та пошкодження насiння й бру-ньок у процесi стерилiзацiï, були розроблеш режими стерилiзацïï цих експлантв з ура-хуванням особливостей стерилiзуючиx аген-тiв i специфiки культури.
Для отримання стерильних бруньок, вида-лених з ризом М. giganteus та M. sacchariflo-rus, ix 30 хв промивали в мильному розчиш, пот1м витримували 10-15 хв у розчиш пер-манганату калгю та 30-45 хв - у 0,2% розчиш сулеми, трич1 промивали стерильною дисти-льованою водою. Стерильш експланти виса-джували на живильш середовища.
Доб1р та оптим1защю складу середовищ для шокуляци бруньок, пророщування насшня, культивування, розмноження мiкроклонiв, стимуляци росту ризом проводили за такими чинни-ками, як макро-, мшроелементи, гормони, вуглеводи, амшокислоти, вмамши та rnmi домишки. За основу використовували мiнеральну частину середовища МС [15].
Стерильне насшня та бруньки висаджували на модифшоваш середовища з мшеральною частиною за МС, що мктило 0,5-1 дозу мак-роелементгв та одну дозу мшроелеменпв, в1-тамши (т1амш - 10,0 мг/л, шридоксин - 1,0, шкотинову кислоту - 1,0 та аскорбшову кислоту - 1,0 мг/л) з додаванням амшокислот (глютамшово'1 - 250,0 мг/л, аспарагшово'1 -30,0, трозину - 3,0, аргшшу - 2,0, пдрокси-пролшу - 2,0 мг/л), регулятор1в росту (ГК -0,5-1,0 мг/л, 6-БАП - 0,2, НОК - 0,1 мг/л) у р1зних вар1ащях. Пророщували насшня та шщгювали р1ст бруньок на модифшованих живильних середовищах за температури 2225 °С та в1дносно'1 вологоста. повмря 50-80%.
Шсля того, як насшня та бруньки проросли, а пагони досягли заввишки 2-3 см, ¿х ввдокремлювали та пересаджували на моди-фшоваш живильш середовища для розмноження, як в1др1знялися ввд попередшх вмятом регулятор1в росту - пдвищеним вмятом цитошшшв (6-БАП, кшетину, аде-ншу) на фош 0,2 мг/л ГК.
Шсля розмноження пагошв ¿х ввдокрем-лювали та пересаджували на модифшоваш живильш середовища, призначеш для стимуляци утворення ризом. Ця сер1я середовищ в1др1знялась в1д попередньоi також за вмятом регулятор1в росту - пдвищеним вмшгом ГК (0,5-1,0 мг/л) на фош 6-БАП (0,2 мг/л) та НОК (0,1 мг/л) у р1зних вар1а-щях. Шсля утворення ризом завдовжки 10-15 см рослини обережно звшьняли ввд залишшв агару та висаджували у ввдкритий ^рунт, використовуючи для адаптаци пласт-масов! накривки, як видаляли поступово через 6-8 д1б шсля пересаджування рослин з колби in vitro в умови in vivo.
У дослвдах визначали кшькють насiння M. sac-chariflorus та М. sinensis, що проросло на кожному середовищ^ кiлькiсть пагонiв, що утворили-ся на кожному середовищ! з одного клону,
довжину ризом одше! рослини у М. sinensis, M. sacchariflorus, М. giganteus перед виса-джуванням у ^рунт, в1дсоток адаптованих рослин та рослин, що усшшно перезимували.
Результати досл1'джень
Результати досл1джень св1дчать, що най-ефективн1шим е режим стерил1заци нас1ння м1скантусу розчином 1-2% гшохлорида нат-р1ю протягом 15-25 хв, завдяки якому отри-мано 89-100% стерильного нас1ння. П1дви-щення концентраци г1похлориду натр1ю та зб1льшення терм1ну стерил1заци пошкоджуе проростки з нас1ння, зменшення - знижуе ефективн1сть стерил1заци.
Щодо стерил1заци бруньок, видалених з ризом М. giganteus та M. sacchariflorus внас-л1док 1х контам1наци, позитивн! результати були отриман! в раз1 застосування токсичн1-шо1 речовини - 0,2% сулеми, реагента, що м1стить ртуть. Найкращ1 результати було от-римано за такого режиму стерил1заци:
- промивання в розчин1 мила - 30 хв;
- обробка перманганатом кал1ю - 10-15 хв;
- застосування розчину сулеми - 0,2%;
- триразове промивання стерильною дис-тильованою водою.
Такий режим стерил1заци забезпечуе отримання 80-85% стерильного неушко-дженого матер1алу.
Основою усп1шного культивування та роз-множення рослин м1скантусу in vitro е пра-вильний доб1р живильних середовищ. У дос-л1дженнях було проанал1зовано та розроблено прописи трьох тип1в живильних середовищ:
- для шокуляци експлант1в;
- для розмноження пагон1в;
- для стимуляци росту ризом in vitro.
Результати omrcMi3a^i складу живильних середовищ для пророщування насшня м1скан-тусу за групами компонент1в (макроелемен-ти, амшокислоти, в1там1ни, регулятори росту, вуглеводи) наведено в таблиц! 1. Оск1ль-ки ключовими ф1тогормонами для пророс-тання нас1ння е г1берел1ни [13, 16], як1 1н-дукують синтез а-ам1лази п1д час проростан-ня нас1ння, г1берел1н був включений до складу живильних середовищ як основний гормон. Еталон - безгормональне середови-ще MC без амшокислот та в1там1н1в.
Результати досл1джень св1дчать, що най-б1льша к1льк1сть пророщених насшин була отримана на середовищах П3 та П4 з п1дви-щеним вм1стом ГК - вона зб1льшилася на 10-15% залежно в1д виду рослини та року репродукци нас1ння (рис. 1).
Було виготовлено та проанал1зовано по-над 40 живильних середовищ для м1кро-
Таблиця 1
Склад живильних середовищ для пророщування нас!*ння мккантусу
Компонента середовища Еталон П1 П2 П3 П4
Макроелементи MC Мжроелементи MC 1/2 1 1/2 1 1/2 1 1/2 1 1/2 1
В1там1ни, мг/л
TiaMiH - 10,0 10,0 10,0 10,0
П1'ридоксин - 1,0 1,0 1,0 1,0
Н'котинова кислота - 1,0 1,0 1,0 1,0
Аскорб1'нова кислота - 1,0 1,0 1,0 1,0
Амтнокислоти, мг/л
Глутам1'нова кислота - 250 250 250 250
Арп'н1'н - 30 30 30 30
Тр1'птофан Т'розин Пдроксипрол1'н Глщин - 3 3 2 2 3 3 2 2 3 3 2 2 3 3 2 2
Регулятори росту, мг/л
6-БАП - 0,2 0,2 0,2 0,2
HOK - - - - 0,1
ГК - - 0,5 1,0 0,51,0
1нш1 оргатчт домтшки, г/л
Мезо1'нозит 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
Сахароза Агар 40,0 8,0 40,0 8,0 40,0 8,0 40,0 8,0 40,0 8,0
клонального розмноження м1скантусу, р1з-них за складом, дозуванням та сп!вв!дно-шенням компонент!в з метою розроблення та оптим1зац11 складу живильних середо-вищ. Основними гормонами, що були вве-ден1 до складу живильних середовищ, були
Таблиця 2
Склад живильного середовища для мжроклонального розмноження м!*скантусу
Компоненти середовища Еталон Р1 Р2 Р3
Макроелементи MC 1/2 1/2 1/2 1/2
Мжроелементи MC 1 1 1 1
В1там1ни, мг/л
Т1ам1н 10,0 10,0 10,0 10,0
П'ридоксин 1,0 1,0 1,0 1,0
Н1'котинова кислота 1,0 1,0 1,0 1,0
Аскорб1нова кислота 1,0 1,0 1,0 1,0
Амтнокислоти, мг/л
Глутам1нова кислота 250,0 250,0 250,0 250,0
Арпт'н 30,0 30,0 30,0 30,0
Тр1птофан 3,0 3,0 3,0 3,0
Т'розин 3,0 3,0 3,0 3,0
Г1дроксипрол1н 2,0 2,0 2,0 2,0
Глщин 2,0 2,0 2,0 2,0
Регулятори росту, мг/л
6-БАП 0,4 0,4 0,4 0,4
К'нетин - 0,5 - 0,5
Аден1'н - - 0,5 0,5
ГК 0,2 0,2 0,2 0,2
1нш1 оргатчт домтшки, г/л
Мезо1'нозит 0,1 0,1 0,1 0,1
Сахароза 40,0 40,0 40,0 40,0
Агар 8,0 8,0 8,0 8,0
100 90 % 80 70
о
Ci о Ci
60
50 40
.id 30
5
80,7
18,2
20,5
87,5
24,124,9
90,7
28,3
30,8
92,4
31,1
33,4
91,7
35,1
Еталон П1 П2 ПЗ П4
□ M. sacchariflorus (2008) (2008) (2012)
Рис. 1. К'льккть пророслого нас'ння рослин M. sacchariflorus та M. sinensis 2008 та 2012 pp. репродукцн на р!*зних живильних середовищах (у В1'дсотках до висадженого)
■ M. giganteus ■ M. sacchariflorus □ Ai. sinensis
Рис. 2. К1*льк1*сть паготв, що утворилися з одного клону р1*зних вид1'в М1*скантусу, залежно в!*д складу живильного середовища
цитокшши - 6-БАП, кшетин, аденш. Ця група регулятор!в росту стимулюе под1л клггин та шдукуе утворення адвентивних пагошв [14].
Результати оптимiзацiï та ушфшацп складу живильних середовищ для розмноження м!скантусу в умовах in vitro за компонентами (макроелементи, амшокислоти, вггамши, регулятори росту, вуглеводи) наведено в таблиц! 2.
Даш, наведен! на рисунку 2, сввдчать, що ефектившше клонування м!скантус!в забез-
печують середовища з двома або трьома видами цитокшш!в, тобто ri, де, кр!м 6-БАП, до складу були введен! rnmi цитокшши - кь нетин та аден!н. Додавання до складу середовищ цих сполук сприяло зб!льшенню к!ль-кост! клон!в, утворених з одного, на 32-50% залежно в!д виду м!скантусу. Зб!льшення вм!сту циток!н!н!в сприяло п!двищенню швидкост! клонування та отримання б!ль-шо'1 к!лькост! клон!в, але мало негативний вплив на подальший розвиток рослин та акл!матизац!ю ¿х у ввдкритому ^рунт!.
Âëa äoöopy Ta onTHMi3an;iï CKëafly œzBHët-hhx cepeflOBHù, npH3Ha^eHHX âëa cTHMyëa-ôiï poçBHTKy pH3OM in vitro, 6yëH npoaHaëi-3OBaHi cepe^oBHùa 3a âoçyBaHHaM Ta cniBBiä-HomeHHaM ochobhhx KoMnoHeHTiB œHBHët-hhx cepe^oBHù. Ochobhhm topmohom, mp 6yB BBe^eHHH äo cKëa^y œHBHëtHHX cepeäoBHm, 6yB riôepeëiH (rK) - 0,5-1,0 Mr/ë, aK äono-MiœHi - 6-BAn (0,2 Mr/ë) Ta HOK (o,1 Mr/ë) (Ta6ë. 3).
Taônuufi 3
CKëafl œMBMëbHoro cepeflOBMùa flëfl cTMMyëfluiï po3BMTKy pM3OM MicKaHTycy in vitro
KoMnoHeHTM cepeflOBM^a ETaëOH Pp1 Pp2 Pp3
MaKpoeëeMeHTM MC 1/2 1/2 1/2
MiêpoeëeMeHTM MC 1 1 1
BÎTaMÎHM, Mr/ë
TiaMiH 10,0 10,0 10,0 10,0
ÏipMflOKCMH 1,0 1,0 1,0 1,0
HiêOTMHOBa KMCëOTa 1,0 1,0 1,0 1,0
AcK0p6iH0Ba KMCëOTa 1,0 1,0 1,0 1,0
AMlHOKMCëOTM, Mr/ë
HnyTaMiHOBa KMCëOTa 250 250 250 250
ApriHiH 30 30 30 30
TpinTO^aH 3 3 3 3
TipO3MH 3 3 3 3
TiflpOKCMnpOëiH 2 2 2 2
TëiôMH 2 2 2 2
PeryëATOpè pOCTy, Mr/ë
6-BAÏ 0,2 0,2 0,2 0,2
HOK 0,1 - - 0,1
TK - 0,5 1,0 1,0
iHwi OprarnHHi aomi'wkm, r/ë
Me3OiHO3MT 0,1 0,1 0,1 0,1
CaxapO3a 40,0 40,0 40,0 40,0
Arap 8,0 8,0 8,0 8,0
ÄaHi, HaBeäeHi Ha pècyHKy 3, äeMoHcTpyroTt pe3yëtTaTH cTHMyëan;iï yTBopeHHa Ta npoëoH-raôiï pH3oM Ha BiänoBiäHHX œHBHëtHHX cepeäo-
BHmax. 3riäHo 3 oTpHMaHHMH pe3yëtTaTaMH,
BBeäeHHa äo cKëaây œHBHëtHHX cepeäoBHm riôepeëiHy cTHMyëroe picT pH3oM Ta cnpèae 30iëtmeHHro ïxHtoï aobkhhh 3aëeœHo Biä BHäy MicKaHTycy b cepeäHtoMy b 5-7 pa3iâ.
PocëHHH MicKaHTycy 3 pH3oMaMH b KyëtTy-pi in vitro 3o6paœeHo Ha pècyHKax 4-6.
npoBeäeHi âocëiâœeHHa cBiä^aTt, mo 3a po3MHoœeHHa MicKaHTycy b KyëtTypi in vitro Ta aâanTaôiï b tpyHTi 3 BHKopHcTaHHaM Ten-ëHôt ^acTKa aäanToBaHHX Ta aKëiMaTH3oBa-hhx pocëHH Biä BHcaflœeHHX cTaHoBHëa 89%, KiëtKicTt pocëHH, mo BHœHëH nicëa nepe3H-Miâëi - 66%. HacTKa aäanToBaHHX Ta aKëiMa-TH3oBaHHX pocëHH, po3MHoœeHHX in vitro, 3a BHcaä^yBaHHa ïx 6e3nocepeäHto y BiäKpHTHH
tpyHT 3 eTaëoHHHX cepeäoBHm MC cTaHoBHëa
ëHme 67% 3araëtHoï KiëtKocTi BHcaä^eHHX,
Pmc. 4. ripopocTaHHfl pè3OM pocëMH M. sinensis y KyëbTypi in vitro
25
20
15
o
10
2,7 3'4 3,1
Pp
17,2
Ppl
22
15,8 16'2
Pp2
20,6
Pp3
I Ai. giganteus
I Ai. sacchariflorus
□ Ai. sinensis
Pmc. 3. floBWMHa pwçoM piçHèx bmai'b MicKaHTycy 3 KyëbTypè in vitro nepeA BMcaflœyBaHHAM y fpyHT çaëeœHo Biä cKëaây œMBMëbHoro cepefloBMùa
Pmc. 5. PicT pM30M pocëMH M. sacchariflorus y KyëbTypi in vitro
KiëtKicTt pocëHH, BsœEëE nicëa nepe3E-MiBëi - 41% (Ta6ë. 4). TaKi peçyëBTaTE 6yë° oTpEMâHo b yMOBax YKpaÏHE, To^i aK b yM°-
Pmc. 6. PicT pM30M pocëMH M. giganteus y KyëbTypi in vitro
XapaKTepMCTMKa cnoco6iâ poçMHoœeHHA Mi'cKaHTycy b KyëbTypi in vitro Ta aAanTauiï b fpyHTi
Ta6nuu,n 4
Cnoco6è po3MHoœeHHfl Mi'cKaHTycy b KyëbTypi in vitro Ta aflanTa^'i' y fpyHTi PoçMHoœeHHfl in vitro CTMMyëfl^fl pocTy pM3oM in vitro AflanTa^fl b yMoBax Tenëi^b AflanTa^fl Ta aKëÏMaTMça^ifl b yMoBax BiflKpèToro fpyHTy KiëbKÏcTb aflanToBaHMX Ta aKëiMaTMçoBaHMX pocëMH y BiflcoTKax Bifl BècaflœeHMX KiëbKicTb pocëMH, ùo BèœèëM nicëfl nepeçMMÏBëi, y BiflcoTKax Bifl BècaflœeHèx
KMBMëbHe cepeflOBM-
ùe, aflanTau'fl b TenëM-Uflx (eTaëOH) + + + 89 66
KMBMëbHe cepeflOBM-ùe (eTaëOH), aflanTa-
U'fl Ta aKë'MaTMçau'A + - - + 67 41
6eç BMKopMcTaHHA
TenëMUb
MoflMÔiêoBaHe œè-
BMëbHe cepefloBMùe Ta
aKë'MaTMçau'A i aflan- + + - + 100 100
Tauifl pocëMH 6eç bm-
KopMcTaHHA TenëMUb
Bax iHmEX GBpOneHCBKEX KpaÏH pOCëEHE 6e3 çacTOcyBaHHa TenëE^HEX KOMnëeKciB B3araëi He BEœEBaKTB [11].
Pmc. 7. M. sinensis, aAanToBaHMé ao yMoB in vivo 6eç BMKopucraHHfl TenëMHHMX KoMïëeKciB
CTEMyëa^a yTBOpeHHa Ta pOcTy b flOBKEHy pE3OM Ha MOflE^iKOBaHEX œEBEëBHEX cepe^O-
BEqax nepefl BEca^œyBaHHaM pOcëEH M. gi-
Pmc. 8. PocëMHM M. sinensis, ùo ycniwHo nepeçMMyBaëM
issn 2518-1017 Plant Varieties Studying and protection, 2017, vol. 13, No 3
235
ganteus, M. sacchariflorus та M. sinensis у ввдкритий ^рунт сприяла 100% адаптаци та 100% виживанню рослин у зимовий перюд без застосування тепличних комплекив як пром:1жно: ланки для адаптаци та дорощу-вання рослин, отриманих з культури in vitro (рис. 9).
Pmc. 9. Pocamhm M. sinensis Apyroro po«y Bereiauii, BMcafl^eHi b yMOBM BiäKpuioro fpyHiy 3 yMOB in vitro
Bmchobkm
P03p0ÖaeH0 MeTOä p03MH0^eHHa MicKaHTy-ciB in vitro Ta aäanTaöii' y BiäKpHT0My tpyHTi, aKHH BK^ro^ae cTHMyaan;iro p0CTy pH30M Ta cnpnae 3ÖiatmeHHro ixHt0i ^0b^hhh Ha ®h-BH^tHHX cepefl0BH^ax, ä0 CK^a^y akhx BBe-äeH0 riöepeaiH, m;0 3a6e3ne^ye rapaHT0BaHe 100% 3Öepe^eHHa p03MH0»eHHX 3 KyatTypH in vitro p0c^HH nifl ^ac aäanTaöii y BiflKpHTO-My tpyHTi Ta aK^iMaTH3an;ii b 3HM0BHH nepi0ä.
MeT0ä Mae 3Ha^Hi nepeBarH y pa3i p03MH0-meHHa MicKaHTycy y Be^HKHX KiatK0cTax, 0cKiatKH äae 3M0ry yHHKHyTH BHK0pHcTaHHa TeniHiHHX K0MnaeKciB, cTan;i0HapHHH xapaK-Tep, K0HcTpyKöiHHa cK^aßHicTt Ta ä0p0r0BH3-Ha skhx 0ÖMe^yroTt BHK0pHcTaHHa ix $epMe-paMH Ta MaiHMH ci^tctK0r0cn0flapctKHMH niflnpHGMcTBaMH.
BwKopwciaHa ^iiepaiypa
1. Griffiths M. Index of Garden Plant. Portland, OR : Timber Press, 1994. P. 867-874.
2. Chramiec-Glqbik A., Grabowska-Joachimiak A., Sliwinska E. Ta i'h. Cytogenetic analysis of Miscanthus xgiganteus and its parent forms. Caryologia. 2012. Vol. 65, Iss. 3. 234-242. doi: 10.1080/00087114.2012.740192
3. Slomka A., Kuta E., Ptazek A. et al. Sterility of Miscanthus xgiganteus results from hybrid incompatibility. Acta Biol Cracov Ser Bot. 2012. Vol. 54, Iss. 1. P. 113-120. doi: 10.2478/v10182-012-0011-1
4. Lewandowski I., Clifton-Brown J. C., Scurlock J. M. O., Huisman W. Miscanthus: European experience with a novel energy crop. Biomass and Bioenergy. 2000. Vol. 54, Iss. 4. P. 209-227. doi: 10.1016/S0961-9534(00)00032-5
5. Lewandowski I., Scurlock J. M. O., Lindvall E., Christou M. The development and current status of perennial rhizomatous grasses as energy crops in the US and Europe. Biomass and Bioenergy. 2003. Vol. 25, Iss. 4. P. 335-361. doi: 10.1016/S0961-9534(03)00030-8
6. Peng L., Gutterson N. Energy Crop and Biotechnology for Biofuel Production. J. Integr. Plant Biol. 2011. Vol. 53, Iss. 3. P. 253-256. doi: 10.1111/j.1744-7909.2010.01014.x
7. Lewandowski I. Micropropagation of Miscanthus x giganteus. Biotechnology in Agriculture and Forestry. Vol. 39. High-Tech and Micropropagation V / Y. P. S. Bajaj (ed.). Berlin : Springer Berlin Heidelberg, 1997. P. 239-255. doi: 10.1007/978-3-662-07774-0_16
8. Holme I. B., Petersen K. K. Callus induction and plant regeneration from different explant types of Miscanthus xogiformis Honda 'Giganteus'. Plant Cell Tiss Organ Cult. 1996. Vol. 45, Iss. 1. P. 43-52. doi: 10.1007/BF00043427
9. Anderson E., Arundale R., Maughan M. et al. Growth and agronomy of Miscanthus xgiganteus for biomass production. Biofuels. 2011. Vol. 2, Iss. 1. P. 71-87. doi: 10.4155/bfs.10.80
10. Schwarz K., Murphy D., Schnug E. Studies of the growth and yield of Miscanthus xgiganteus in Germany. Asp of Appl Biol. 1994. Vol. 40. P. 533-540.
11. Long S. P. C4 photosynthesis at low temperature. Plant Cell Environ. 1983. Vol. 6, Iss. 4. P. 345-363. doi: 10.1111/1365-3040.ep11612141
12. Бутенко P. Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнология на их основе. Москва : ФБК-ПРЕСС, 1999. 152 с.
13. Кушт'р Г. П., Сарнацька В. В. Мкроклональне розмноження рослин. Ки'1в : Наук. думка, 2005. 271 с.
14. Калинин Ф. Л., Кушнир Г. П., Сарнацкая В. В. Технология мик-роклонального размножения растений. Киев : Наук. думка, 1992. 232 с.
15. Murashige T., Skoog F. A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures. Physiol. Plant. 1962. Vol. 15, Iss. 3. P. 473-497. doi: 10.1111/j.1399-3054.1962. tb08052.x
16. Муромцев С., Чкаников Д., Кулаева 0., Гамбург К. Основы химической регуляции роста и продуктивности растений. Москва : Агропромиздат, 1987. 383 с.
References
1. Griffiths, M. (1994). Index of Garden Plant. Portland, OR: Timber Press.
2. Chramiec-Glqbik, A., Grabowska-Joachimiak, A., Sliwinska, E., Legutko, J., & Kula, A. (2012). Cytogenetic analysis of Miscanthus xgiganteus and its parent forms. Caryologia, 65(3), 234242. doi: 10.1080/00087114.2012.740192
3. Slomka, A. ,Kuta, E. ,Plazek, A., Dubert, F., Zur, I., Dubas, E., ... Zurek, G. (2012). Sterility of Miscanthus xgiganteus results from hybrid incompatibility. Acta Biol Cracov Ser Bot, 54(1), 113-120. doi: 10.2478/v10182-012-0011-1
4. Lewandowski, I., Clifton-Brown, J. C., Scurlock, J. M. O., Huisman, W. (2000). Miscanthus: European experience with a novel energy crop. Biomass and Bioenergy, 54(4), 209-221. doi: 10.1016/S0961-9534(00)00032-5
5. Lewandowski, I., Scurlock, J. M. O., Lindvall, E., & Christou, M. (2003). The development and current status of perennial rhizomatous grasses as energy crops in the US and Europe. Biomass and Bioenergy, 25(4), 335-361. doi: 10.1016/S0961-9534(03)00030-8
6. Peng, L., & Gutterson, N. (2011). Energy Crop and Biotechnology for Biofuel Production. J. Integr. Plant Biol., 53(3), 253-256. doi: 10.1111/j.1744-7909.2010.01014.x
7. Lewandowski, I. (1997). Micropropagation of Miscanthus xgiganteus. In Y. P. S. Bajaj (Ed.), Biotechnology in Agriculture and Forestry. Vol. 39. High-Tech and Micropropagation V (рр. 239255). Berlin: Springer. doi: 10.1007/978-3-662-07774-0_16
8. Holme, I. B., & Petersen, K. K. (1996). Callus induction and plant regeneration from different explant types of Miscanthus
x ogiformis Honda 'Giganteus'. Plant Cell Tiss Organ Cult., 45(1), 43-52. doi: 10.1007/BF00043427
9. Anderson, E., Arundale, R., Maughan, M., Oladeinde, A., Wycis-lo, A., & Voigt, T. (2011). Growth and agronomy of Miscan-thus xgiganteus for biomass production. Biofuels, 2(1), 71-87. doi: 10.4155/bfs.10.80
10. Schwarz, K., Murphy, D., & Schnug, E. (1994). Studies of the growth and yield of Miscanthus xgiganteus in Germany. Asp of Appl Biol., 40, 533-540.
11. Long, S. P. (1983). C4 photosynthesis at low temperature. Plant Cell Environ, 6(4), 345-363. doi: 10.1111/1365-3040. ep11612141
12. Butenko, R. G. (1999). Biologiya kletok vysshikh rasteniy in vitro i biotekhnologiya na ikh osnove [Biology of higher plant cells in vitro and biotechnology based on them]. Moscow: FBK-PRESS. [in Russian]
13. Kushnir, H. P., & Sarnatska, V. V. (2005). Mikroklonalne rozmnozhennia roslyn [Microclonal plant propagation]. Kyiv: Naukova dumka. [in Ukrainian]
14. Kalinin, F. L., Kushnir, G. P., & Sarnatskaya, V. V. (1992). Tekhnologiya mikroklonal'nogo razmnozheniya rasteniy [Microclonal plant propagation technology]. Kiev: Naukova dumka. [in Russian]
15. Murashige, T., & Skoog, F. (1962). A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures. Physiol. Plant., 15(3), 473-497. doi: 10.1111/j.1399-3054.1962. tb08052.x
16. Muromtsev, S., Chkanikov, D., Kulaeva, O., & Gamburg, K. (1987). Osnovy khimicheskoy regulyatsii rosta i produktivnosti rasteniy [Fundamentals of chemical regulation of growth and productivity of plants]. Moscow: Agropromizdat. [in Russian]
УДК 631.681.16
Гонтаренко С. H., Лашук С. А.* Метод размножения, стимуляции роста ризом в культуре in vitro и адаптации в открытой почве представителей рода Miscanthus // Сортовивчення та охорона прав на сорти рослин. 2017. Т. 13, № 3. С. 230-238. http://dx.doi.org/10.21498/2518-1017.13.3.2017.110703
Институт биоэнергетических культур и сахарной свеклы НААН Украины, г. Киев, ул. Клиническая, 25, 03110, Украина, "e-mail: [email protected]
Цель. Разработать метод размножения, стимуляции роста ризом в культуре in vitro представителей рода Miscanthus и адаптации их в открытом грунте без использования тепличных комплексов для акклиматизации и доращивания. Методы. Биотехнологические, математи-ко-статистические. Результаты. Разработаны прописи питательных сред для инокуляции эксплантов, размножения побегов, стимуляции роста ризом in vitro. Стерильные экспланты - семена, почки, которые удаляли с ризом, части стебля с почкой высаживали на модифицированные среды с минеральной частью по Мурасиге-Скуга (МС), в состав которых входило 0,5-1 доза макро- и одна доза микроэлементов, витамины (тиамин - 10,0 мг/л, пири-доксин - 1,0, никотиновая кислота - 1,0, аскорбиновая кислота - 1,0 мг/л), с добавлением аминокислот (глюта-миновая - 250,0 мг/л, аспарагиновая - 30,0, тирозин - 3,0, аргинин - 2,0, гидроксипролин - 2,0 мг/л), регуляторов роста (ГК - 0,5-1,0 мг/л, 6-БАП - 0,2, Н0К - 0,1 мг/л) в разных вариациях. После прорастания семян, появления почек и образования побегов высотой 1-2 см их для размножения пассировали на среду другого состава, которая отличалась от предыдущей соотношением регуляторов роста, в частности увеличенным количеством цитокини-нов [6-БАП (0,4-0,5 мг/л), кинетина (0,5 мг/л), аденина
(0,5 мг/л)] в разных вариациях на фоне 0,2 мг/л ГК. Для стимуляции роста ризом микроклоны пересаживали на среды с другим составом и соотношением регуляторов роста [6-БАП (0,2-0,3 мг/л) + ГК (0,5-1,0 мг/л) или 6-БАП (0,2-0,3 мг/л) + ГК (0,5-1,0 мг/л) + Н0К (0,1 мг/л)], то есть, с повышенным составом гиббереллинов. После образования ризом длиной 10-15 см растения мискантуса высаживали в открытую почву. Стимуляция образования и роста в длину ризом на соответствующих питательных средах перед посадкой растений Miscanthus giganteus, M. sacchariflorus и M. sinensis в условия in vivo способствовала 100% адаптации и 100% выживанию растений в зимний период без использования тепличных комплексов. Выводы. Разработан метод размножения мискантусов in vitro и адаптации в открытой почве, который включает стимуляцию роста ризом и способствует увеличению их длины на питательных средах, в состав которых входит гиббереллин, что гарантированно обеспечивает 100% сохранение размноженных в культуре in vitro микрорастений при адаптации в открытой почве и акклиматизации в зимний период.
Ключевые слова: растения мискантуса, экспланты, ризомы, акклиматизация, питательная среда, in vitro, тепличные комплексы.
UDC 631.681.16
Hontarenko, S. M., & Lashuk, S. O.* (2017). Method of propagation, stimulation of rhizomes growth in vitro culture and adaptation in the open ground for the genus Miscanthus representatives. Plant Varieties Studying and Protection, 13(3), 230-238. http://dx.doi.org/10.21498/2518-1017.13.3.2017.110703
Institute of Bioenergy Crops and Sugar Beet of NAAS of Ukraine, 25 Klinichna Str., Kyiv, 03110, Ukraine, *e-mail: [email protected] Purpose. To develop a method of propagation, stimula- moved from rhizomes, parts of stems with bud were placed
tion of rhizomes growth in vitro culture for the genus Miscanthus representatives and their adaptation in the open field without the use of greenhouse complexes for acclimatization and completion of growing. Methods. Biotechnological procedures, mathematical and statistical analyses. Results. Prescription of nutrient medium was developed for explants inoculation, sprouts propagation, rhizomes growth stimulation in vitro. Such sterile explants as seeds, buds to be re-
on modified media with mineral portion by Murashige and Skoog (MS) that contained 0,5-1 dose of macroelements and one dose of microelements, vitamins (10 mg/l of thia-minum, 1,0 mg/l of pyridoxine, 1,0 mg/l of nicotinic acid and 1,0 mg/l of ascorbic acid) supplemented with amino acids (250 mg/l of glutamic acid, 3 mg/l of tyrosine, 3 mg/l of ar-ginine, 2 mg/l of hydroxyproline), plant growth regulators [0,5-1,0 mg/l of GA (gibberelline acid), 0,2 mg/l of 6-BAP
ISSN 2518-1017 Plant Varieties Studying and protection, 2017, vol. 13, No 3
237
(6-Benzylaminopurine, 0,1 mg/l of NAA (a-naphtylacetic acid)] in different variations. After seed germination, buds emerging and sprouts formation 1-2 cm in height, for propagation purpose they were passivated on the medium of other composition that differed from previous one by the content and ratio of growth regulators, especially by a high concentration of cytokinins [6-BAP (0,4-0,5 mg/l), kinetin (0,5 mg/l), adenine (0,5 mg/k)] in different variations in presence of GA (0,2 mg/l). In order to stimulate rhizomes growth, microclones were transferred on media with other composition and ratio growth regulators (6-BAP (0,2-0,3 mg/l) + GA (0,5-1,0 mg/l) or 6-BAP (0,20,3 mg/l) + GA (0,5-1,0 mg/l) + NAA (0,1 mg/l), in other words, with a high content of gibberellins. After the formation of rhizomes 10-15 cm in length, miscanthus plants
were planted out in the open ground. Stimulation of rhizomes initiation and elongation on appropriate nutrient media before Miscanthus giganteus, M. sacchariflorus and M. sinensis planting in vivo resulted in 100% adaptation and 100% survival of plants in the winter period without the use of greenhouse complexes. Conclusions. The method of miscanthus propagation in vitro and adaptation in the open ground was developed that included stimulation of rhizomes growth and favoured the increase of their length on media supplemented with gibberelline that guaranteed 100% preservation of microplants to be propagated from in vitro culture during adaptation in the open ground and acclimatization in winter.
Keywords: miscanthus plants, explants, rhizomes, acclimatization, nutrient medium, in vitro, greenhouse complexes.
Надтйшла / Received 14.06.2017 Погоджено до друку/ Accepted 07.08.2017
238
сортовивчЕння ТА охоронл прав на сорти рослин, 2017, Т. 13, №3
