CC BY
28
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПОЛЕВЫХ ИЗОЛЯТОВ ВИРУСА БОЛЕЗНИ НЬЮКАСЛА, ВЫДЕЛЕННЫХ В ТАДЖИКИСТАНЕ
Шоназар ДЖ. М., Махмудов К.Б., Салимов Т.М., Мамадатохонова Г.Н., Рахимов А.А.,
Мираков А.З.
Резюме
Заболевания и гибель домашних птиц в Республике Таджикистан в последние годы были вызваны вирусом болезни Ньюкасла. Вспышки болезни Ньюкасла зарегистрированы в птицеводческих хозяйствах Согдийской области и районах республиканского подчинения в период с 2014 по 2017 гг. По результатам секвенирования проведено сравнение выделенного полевого штамма с другими штаммами вируса болезни Ньюкасла в интернет базе данных GeneBank с помощью пакета программ MEGA6. Результаты исследований показали, что выделенные от домашних птиц штаммы ВБН на территории Таджикистана в периоды с 2014 по 2017 гг. принадлежат к авулавирусу птиц серотипа -1, генотипа-7.
MOLECULAR-GENETIC ANALYSIS OF FIELD ISOLATED OF THE NEWCASTLE DISEASE VIRUS EXTRACTED IN TAJIKISTAN
Schonazar J.M., Mahmudov K.B., Salimov T.M., Mamadatokhonova G.N., Rahimov A.A.,
Mirakov A.Z.
Summary
The Newcastle disease virus has caused diseases and death of poultry in the Republic of Tajikistan in recent years. Outbreaks of Newcastle disease have reported in poultry farms in the Sughd region and areas of republican subordination in the period from 2014 to 2017. Based on the results of sequencing, the selected field strain has compared with other strains of the Newcastle disease virus in the GeneBank Internet database using the MEGA6 software package. The results of the study showed that strains of Newcastle disease virus isolated from poultry in Tajikistan during the period from 2014 to 2017 belong to Avulavirus of birds of serotype- 1, genotype- 7.
DOI 10.31588/2413-4201-1883-244-4-262-266 УДК 578.828.6:578.5.083.2
ПРОВИРУСНАЯ ДНК ВЛКРС В ПАТОГЕНЕЗЕ ЛЕЙКОЗА КОРОВ
Якупов Т.Р. - д.вет.н., доцент, Зиннатов Ф.Ф. - к.б.н., доцент, Гатина А.В. - студент,
Масленников Н.Н. - студент
ФГБОУ ВО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины
имени Н.Э.Баумана»
Ключевые слова: лейкоз крупного рогатого скота, провирус, полимеразная цепная реакция, иммуноферментный анализ, иммунный комплекс
Кeywords: bovine leukemia, polymerase chain reaction, immunosorbent assay, provirus, immune ^mplexes
Одним из основных факторов, сдерживающих эффективность оздоровительных мероприятий при лейкозе, является недостаточная изученность особенностей патогенеза инфекционного процесса. Несмотря на использование разноплано-
вых методов и технологий в диагностических исследованиях, основу диагностики лейкоза крупного рогатого скота составляют серологические методы, которые основаны на обнаружении в сыворотке крови животных специфических антител к анти-
генам ВЛКРС. Специфические антитела появляются в крови животного через 2-8 недель после заражения ВЛКРС и сохраняются в организме пожизненно. Кроме того, известно, что при хронических инфекциях, вызванных ретровирусами, в биологических жидкостях организма появляются иммунные комплексы (ЦИК). Не является исключением и лейкоз крупного рогатого скота. Согласно данным Yakob-son et а1. (1998), иммунные комплексы в сыворотке крови инфицированных ВЛКРС коров содержат иммуноглобулины G, M и вирусные компоненты [7]. В исследованиях по выяснению структуры ЦИК нами доказано, что иммунные комплексы при лейкозе крупного рогатого скота могут содержать провирусную ДНК вируса [1]. Этот факт может иметь определенное значение в патогенезе инфекционной болезни. Во первых, иммунные комплексы в результате взаимодействия с Fc-рецепторами поглощаются макрофагами, в которых вирус восстанавливает свою инфекционность [2]. Во вторых, в процессе развития инфекционного процесса соотношение между свободными и связанными антителами в сыворотке крови постоянно меняется. Поэтому разовые серологические тесты в диагностике лейкоза крупного рогатого скота могут быть недостаточно эффективными [8].
В настоящее время, наряду с серологическими методами исследования, в диагностике лейкоза крупного рогатого скота регламентировано применение по-лимеразной цепной реакции (ПЦР) В качестве индикатора инфицированности животных в проведении противолейкозных мероприятий рекомендуют также использовать определение уровня провирусной нагрузки (РЦУ) [6]. Провирус большинства ретровирусов считается инфекционной единицей, а относительное количество интегрированного провируса в геноме хозяина, известное как провирусная нагрузка (PVL), связано с увеличением риска распространения инфекции [4, 5].
Учитывая, что диагностические мероприятия при лейкозе крупного рогатого скота по исследованию проб молока являются экономически более выгодными, це-
лью настоящей работы являлось определение зависимости появления ЦИК в пробах молока, содержащих провирусную ДНК, от стадий развития инфекционного процесса.
Материал и методы исследований. Создали опытную группу животных из 12 коров, инфицированных в естественных условиях, из числа диагностированных, впервые по результатам РИД исследований и подтвержденные методами ИФА и ПЦР. Через каждые 2 месяца проводили исследования проб крови и молока на обнаружение ЦИК, провирусной ДНК и гематологических изменений. Иммуно-ферментный анализ проводили с использованием «Набора для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС)» производства НПО «Нарвак» по общепринятой методике и с предварительной диссоциацией ЦИК в пробах. Результаты исследований по РИД получены в Республиканской ветеринарной лаборатории. ПЦР ставили с использованием реактивов тест-системы «Лейкоз КРС-провирус» на обнаружение провирусной ДНК в лейкоцитах и ЦИК молока. Циркулирующие иммунные комплексы выделяли методом преципитации в полиэтиленгли-коле (ПЭГ). При этом, пробы сыворотки крови смешивали в соотношении 1:1 с 7 % раствором ПЭГ-6000 в 0,1М боратном буфере (рН 8,8), перемешивали и инкубировали при +4 оС в течение 72 часов. Преципитат осаждали центрифугированием при 5000 g в течение 20 минут и трижды промывали десятикратным объемом ПЭГ в концентрациях: 3,5, 7 и 10,5 % в боратном буфере. Выделенные иммунные комплексы растворяли в физиологическом растворе и изучали их активность в ИФА. Подсчет лейкоцитов проводили в счетной камере с сеткой Горяева. Статус животного по лейкозу определяли исходя из количества лейкоцитов и лимфоцитов в 1 мкл крови животного согласно «лейкозному ключу».
Результаты исследований. В экспериментальной группе животных наблюдения велись в течение года. Через каждые 2 месяца брали пробы крови и молока. Определяли количество лейкоцитов в
1 мкл крови, титры циркулирующих иммунных комплексов в молоке и наличие провирусной ДНК в ЦИК. Результаты исследований представлены в таблице 1.
Все коровы экспериментальной группы с одного стада, возраст 2-4 года, все были диагностированы как инфицированные ВЛКРС впервые, т.е. с момента их заражения прошло не более 6 месяцев. Как видно по результатам исследований, представленных в таблице, после первого и второго исследований количество лейкоцитов в крови у всех подопытных животных в пределах физиологической нормы. Следовательно, гематологически больных животных нет. Следует отметить, что в пробах молока у всех животных, кроме № 5 после первого исследования обнару-
живаются ЦИК-содержащие противолей-козные антитела в титрах от 1:2 до 1:16, которые в дальнейшем не исчезали практически у всех животных в течение всего эксперимента. Исключение составляет лишь корова № 2, у которой в исследованиях в третий раз (через 6 месяцев) в пробе ЦИК не обнаружены.
Провирусная ДНК в ЦИК молока обнаруживаются впервые у двух коров под № 3, 7 в исследованиях во второй раз, т.е. через 4 месяца после начала эксперимента. Важно отметить, что гематологические показатели у этих животных на данный момент в пределах физиологической нормы. В пределах нормы продолжает оставаться этот показатель у коровы № 7 и после третьего раза исследований.
аблица 1 - Результаты исследований проб крови и молока инфицированных ВЛКРС коров.
Порядок исследований, показатели
2
3
ю
о р
п п
в о т и я о к й е л
о в
I
л о к
рт и т
н
с
^
р
и в
о р
п
в о н ^
» 2
И X й
е л
о в
■
л о к
л к
рт и т
н
с р
и в
о р
п
в о н ^
» 2
И ^ «
е л
о в
■
л о к
рт и т
н
с
^
р
и в
о р
п
в о т и Я о к й е л
о в
■
л о к
рт и т
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12
9,7 10,2 8,6 8,9 9,1 9,5
8.7
8.8 9,1 8,8 9,7 10,1
1:8 1:8 1:2 1:8 отр.
1:2 1:8 1:8 1:16 1:2 1:16 1:8
9.1 9,9
9.2 8,9 9,2 8,9
9.7 10,1
9.8
8.7
8.8 9,5
+
+
9.8 10,1 14,5 9,2 10,1
9.9 10,1 10,1 10,2
9.8 10,3
9.9
1:2 отр. 8 8 4 2 2 8 16 8 8 8
+
+
+
10,1 17,3 9,9 10,2 9,8 16,2
10.3
12.4 9,8 10,3 16,8
+ + + + + +
1
4
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
После третьего раза исследований или через 6 месяцев с начала эксперимента провирусная ДНК в ЦИК молока обнаруживаются еще у одной пробы - № 12. При этом также гематологические показатели в пределах нормы - 9900 лейкоцитов в 1 мкл крови. Как известно, согласно «лейкозно-му ключу», у гематологически больных лейкозом коров, в возрасте 2-4 года, содержание лейкоцитов в 1 мкл крови свыше 11 тыс.
После четвертого раза исследований провирусная ДНК в ЦИК молока обнаруживаются всего у 6 проб. У троих из них, № 4, 5, 9, они обнаружены впервые. Только у коровы № 9 параллельно с обнаружением провирусной ДНК в ЦИК молока проявились и характерные для лейкоза гематологические изменения. Содержание лейкоцитов более 12 тыс. на 1 мкл крови.
Согласно правилам по профилактике и борьбе с лейкозом крупного рогатого
скота, животные, сыворотки крови которых дали положительный результат в РИД или ИФА, признаются инфицированными вирусом лейкоза, и подлежат исследованию через каждые 6 месяцев гематологическим методом на лейкоз. Животных с изменениями крови, характерными для лейкоза, признают больными, изолируют и сдают на убой. По существующим нормативно-правовым актам инфицированный ВЛКРС крупный рогатый скот может использоваться в хозяйственных нуждах с соблюдением ветеринарно-санитарных правил. Однако, обнаружение в крови и молоке ЦИК-содержащих провирусную ДНК, ставит под сомнение существующие методики о сроках возможной эксплуатации животных и о признании их больными лейкозом. Тем более способность ДНК сохранять жизнеспособность даже после длительной термической обработки считается доказанной [3].
Заключение. Роль циркулирующих иммунных комплексов в патогенезе ВЛКРС инфекции недостаточно изучена. ЦИК, содержащие провирусную ДНК, возможно, формируются в процессе гибели инфицированных В-лимфоцитов путем соединения не встроенных в геном вирусных ДНК с поверхностными ^М, обладающими высокой аффинностью к ДНК. Очевиден тот факт, что появляются они в молоке на более поздних стадиях болезни, при выраженной вирусемии организма, когда животное становится потенциально опасным источником заражения стада. Гематологические изменения в этот период в большинстве случаев остаются стабильными. Использование образцов молока для проведения молекулярно-генетических анализов по выявлению ВЛКРС в ЦИК является достаточно перспективным направлением для оценки эпизоотической ситуации в хозяйствах и весьма информативным при определении статуса животного, а также возможностей и сроков эксплуатации инфицированного животного в производственных условиях. Результаты исследований дают основание пересмотреть критерии «инфицированного» и «больного» лейкозом животного.
ЛИТЕРАТУРА
1. Зиннатов, Ф.Ф. Диагностическая ценность выявления провирусной ДНК ВЛКРС в молоке / Ф.Ф. Зиннатов, Т.Р. Якупов // Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии. -2010. - № 4. - С. 290-293.
2. Хазипов, Н.З. Репродукция вируса лейкоза крупного рогатого скота и иммунный ответ на неё / Н.З. Хазипов, Р.П. Тюрикова // Ученые записки КГАВМ.
- Казань. - 2008. -Т. 192. - С. 152-160.
3. Niziol, Jacek Thermal stability of the solid DNA as a novel optical material / Jacek Niziol, Katarzyna Makyla-Juzak, Ma-teusz M.Marzec, Robert Ekiert [et al.] // Optical Materials. Volume 66. - 2017. - P. 344350.
4. Li, H.C. Provirus load in breast milk and risk of mother-to-child transmission of human T lymphotropic virus type I / H.C. Li, R.J. Biggar, W.J. Miley [et al.] // J. Infect. Dis. - 2004. - V. 190. - P. 1275-1278.
5. Ureta-Vidal, A. Mother-to-child transmission of human T-cell-leukemia / lymphoma virus type I: Implication of high antiviral antibody titer and high proviral load in carrier mothers / A. Ureta-Vidal, C. Angelin-Duclos, P. Tortevoye [et al.] // Int. J. Cancer.
- 1999. - V. 82. - P. 832-836
6. Ruggiero, V.J. Controlling bovine leukemia virus in dairy herds by identifying and removing cows with the highest proviral load and lymphocyte counts / V.J. Ruggiero, 1.B. Norby, O.J. Benitez, H. Hutchinson [et al.] // J. Dairy Sci. - 2019 - V. 102 (10). - P. 9165-9175.
7. Yakobson, B. Short-termed expression of interleukin during experimental BLV infection may direct disease progression to persistent lymphocytosis / B. Yakobson, J. Brenner, H. Ungar-Waron, Z. Trainin, // Veterinary Immunology and Immunopatholo-gy. - 1998. - 64(3). P. 136-142.
8. Yakupov, T.R. Features of humoral immunity in cows infected with the leukaemia virus / T.R. Yakupov, M.M. Valiev, F.F Zin-natov [et al.] // International Journal of Research in Pharmaceutical Sciences. - 2020. -Т. 11. - № 1. - P. 290-293.
ПРОВИРУСНАЯ ДНК ВЛКРС В ПАТОГЕНЕЗЕ ЛЕЙКОЗА КОРОВ
Якупов Т.Р., Зиннатов Ф.Ф., Гатина А.В. Масленников Н.Н.
Резюме
В статье описываются результаты исследований динамики изменений титров циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в молоке, обнаружения в них провирусной ДНК, а также гематологические изменения в разные стадии инфекционного процесса у инфицированных ВЛКРС коров. Приводятся сведения о том, что провирусная ДНК в ЦИК молока коров, инфицированных ВЛКРС, обнаруживаются гораздо раньше гематологических изменений, позволяющих считать их больными лейкозом. Использование образцов молока для проведения молекулярно-генетических анализов по выявлению ВЛКРС в ЦИК является достаточно перспективным направлением для оценки эпизоотической ситуации в хозяйствах и весьма информативным при определении статуса животного.
VLVIRAL DNA BLV IN PATHOGENESIS LEUKOSIS OF COWS
Yakupov T.R., Zinnatov F.F., Gatina A.V., Maslennikov N.N.
Summary
The article describes the results of studies of the dynamics of changes in the titers of circulating immune complexes (CIC) in milk, the detection of proviral DNA in them, as well as hematolog-ical changes at different stages of the infectious process in cows infected with BLV. Information is given that proviral DNA in the CEC of milk of cows infected with VLBV is detected much earlier than hematological changes, which make it possible to consider them as patients with leukemia. The use of milk samples for molecular genetic analyzes to identify VLBV at the CEC is a fairly promising direction for assessing the epizootic situation in farms and very informative in determining the status of an animal.
