CC BY
76
УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ КАЗАНСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ АКАДЕМИИ ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ им Н.Э.БАУМАНА
Т. 205
2011
УДК 619:616.98:579.873.21:636.22.28
ВЛИЯНИЕ ТЕРМООБРАБОТКИ МОЛОКА НА ВЫЯВЛЯЕМОСТЬ ПРОВИРУСНОЙ ДНК ВЛКРС В ПЦР Алимов А.М., Якупов Т.Р., Гибадулина И.Р., Шаева А.Ю.
ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э.Баумана»
Ключевые слова: лейкоз крупного рогатого скота, ВЛКРС, провирусная ДНК, ПЦР, пастеризация, молоко.
Key words: leukosis of cattle, BLV, DNA, PCR, pasteurization, milk.
Вирус лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) может находиться в соматических клетках, содержащихся в молозиве и молоке естественно зараженных животных. Установлено, что вирус чувствителен к температурным воздействиям и разрушается при повторных замораживаниях и оттаиваниях. Пастеризация молока разрушает его и он теряет инфекционность. Полная инактивация вируса в молоке или вируссодержащей жидкости достигается при 500С в течение 70 секунд (Сюрин В.Н. и др., 1986).
Ретровирусы, к семейству которых относится ВЛКРС, характеризуются наличием разных форм генетического материала: РНК в вирусных частицах, провирусная ДНК в ядре и цитоплазме, РНК-транскрипты в клетке. У инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота в В-лимфоцитах синтезируются десятки и сотни молекул провирусной ДНК, но только часть из них встраивается в геном клетки хозяина, а остальные выходят из клетки при её разрушении (Сергеев В. А. и др., 1983; Хазипов Н.З. и др., 2008).
По нашим данным при исследовании методом ПЦР проб молока от инфицированных ВЛКРС коров до 30% случаев обнаруживается провирусная ДНК ВЛКРС. В зависимости от стадий развития болезни в 15% от исследованных проб провирусная ДНК выявляется в иммунных комплексах молока.
Выявление провирусной ДНК служит важным фактором контаминации молока вирусом лейкоза крупного рогатого скота.
Целью работы явилось определение влияния термической обработки молока в различных температурных режимах на выявляемость провирусной ДНК ВЛКРС полимеразной цепной реакцией.
Материалы и методы. Исследовали 36 проб молока от больных лейкозом коров из неблагополучных хозяйств РТ. ПЦР ставили с использованием реактивов тест-системы «Лейкоз КРС-провирус» для диагностики лейкоза крупного рогатого скота, ФГУН ЦНИИЭ - фирмы АмплиСенс, на обнаружение провирусной ДНК в лейкоцитах и циркулирующих иммунных комплексах (ЦИК) в молоке. ДНК из исследуемого материала выделяли используя набор реагентов тест-системы - «ДНК - сорб - В». Электрофоретический анализ продуктов ПЦР проводили в 2% агарозном геле, содержащем 5 мкл 10% бромистого этидия. Согласно временному наставлению по применению тест-системы, положительными считаются образцы, содержащие на электрофореграмме продуктов амплификации специфическую полосу на уровне 294 п.н.
Циркулирующие иммунные комплексы выделяли методом
преципитации в полиэтиленгликоле (ПЭГ). Для этого пробы
обезжиренного молока смешивали в соотношении 1:1 с 7% раствором
ПЭГ-6000 в 0,1М боратном буфере (рН 8,8), перемешивали и инкубировали при +4оС в течение 48 часов. Преципитат осаждали центрифугированием при 3000g в течение 20 минут и трижды промывали с десятикратным объемом 3,5% ПЭГ в боратном буфере.
Каждую пробу обезжиренного молока после тщательного
перемешивания делили на 2 ровные части по 30 мл. Первую часть использовали для постановки ПЦР без предварительной обработки с ПЭГ.
Вторую часть обезжиренного молока использовали для выделения ЦИК. Полученный осадок иммунных комплексов растворяли в 1 мл физиологического раствора и также ставили реакцию полимеразной цепной реакции.
Результаты исследований. В 10 пробах нативного молока (28%) и в 12 пробах выделенных из него ЦИК (33%) обнаружили провирусную ДНК ВЛКРС. В 7 пробах молока провирусная ДНК выявлена как в соматических клетках, так и в ЦИК. Для дальнейших исследований использовали эти пробы.
Отобранные положительные пробы разливали в 3 стеклянные стаканчики в объеме по 10 мл и подвергли термической обработке в 3-х режимах:
- пастеризация в течение 30 мин при 700С;
- кипячение - 5 мин;
- кипячение - 10 мин;
Все пробы исследовали методом ПЦР.
Во всех 7 пробах молока, подвергнутых пастеризации и в 5 пробах из 7 после 5 минутного кипячения, обнаруживали провирусную ДНК. Пробы
молока, подвергнутые 10 минутному кипячению, были свободны от провирусной ДНК ВЛКРС. Однако, при исследовании поверхностных пленок, образовавшихся после кипячения этих проб, ПЦР-анализ показал положительные результаты.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
294 п.н.
1. Электрофореграмма продуктов амплификации.
Обозначения: Треки: 1-4, 8 - пробы молока пастеризованные; 5, 6, 9
- кипяченные 5 мин; 7,10 - кипяченные 10 мин.
Роль циркулирующих иммунных комплексов в патогенезе ВЛКРС инфекции не изучена. Возможно, они формируются в процессе гибели инфицированных В-лимфоцитов путем соединения невстроенных в геном вирусных ДНК с поверхностными ^М, обладающими высокой аффинностью к ДНК. По нашим данным появляются они в более поздних стадиях болезни при выраженной вирусемии организма, когда животное становится потенциально опасным источником заражения стада. Гематологические изменения в этот период могут оставаться стабильными. Поэтому при лейкозе крупного рогатого скота окончательная постановка диагноза может быть направлена на обнаружение ДНК вируса в ЦИК методом ПЦР. Особенно перспективным, в этом отношении, может стать обнаружение ДНК вируса в циркулирующих иммунных комплексах содержащихся в молоке.
Влияние генетического материала ВЛКРС, содержащегося в молоке, на организм человека мало изучено. Тем более мало известно о нативных свойствах провирусной ДНК после пастеризации и кипячения молока. Изучение структуры и свойств провирусной ДНК в молоке после термической обработки должно стать объектом дальнейших научных исследований для установления её инфекционности.
ЛИТЕРАТУРА. 1. Сюрин В.Н. Вирус лейкоза крупного рогатого скота / В.Н. Сюрин, Р.В.Белоусова, Н.В.Фомин. - М.: Агропромиздат, 1986.
- С.76-85; 2. Сергеев В.А. Структура и биология вирусов животных/ В.А.Сергеев, Б.Г.Орлянкин// М. «Колос».- 1983.- с.36; 3. Хазипов Н.З. Репродукция вируса лейкоза крупного рогатого скота и иммунный ответ на неё/ Н.З.Хазипов, Р.П.Тюрикова// Ученые записки КГАВМ.- Казань.-2008.- Т.192.- с.152-160.
ВЛИЯНИЕ ТЕРМООБРАБОТКИ МОЛОКА НА ВЫЯВЛЯЕМОСТЬ ПРОВИРУСНОЙ
ДНК ВЛКРС В ПЦР
Алимов А.М., Якупов Т.Р., Гибадуллина И.Р., Шаева А.Ю.
Резюме
Показано влияние термической обработки на выявляемость провирусной ДНК ВЛКРС в молоке методом полимеразной цепной реакцией. Установлено, что провирусная ДНК в молоке сохраняется после пастеризации и кипячения до 5 минут.
INFLUENCE OF HEAT TREATMENT ON DETECTION BLV PROVIRAL DNA IN
MILK PCR
Alimov A.M., Yakupov T.R., Gibadullina I.R., Shaiva A.J.
Summary
Influence of thermal processing on detectability of provirus DNA BLV in milk by PCR is shown. It is established that provirus DNA in milk remains after pasteurization and boiling till 5 minutes.
УДК 619:614.31:637.5
ВЛИЯНИЕ ОЗОНИРОВАННОГО ВОЗДУХА НА КАЧЕСТВО И СРОКИ ХРАНЕНИЯ МЯСА МОЛОДНЯКА СВИНЕЙ Алексеев И.А., Семенова А.Г.
ФГОУ ВПО «Чувашская государственная сельскохозяйственная академия»
Ключевые слова: озоно-воздушная смесь, ветсанэкспертиза,
свинина.
Key words: ozone-air mixture, veterinary sanitary inspection, pork.
Актуальность темы. Современные методы ведения промышленного свиноводства в значительной степени предусматривают такие способы содержания животных, которые не в полной мере соответствуют физиологическим особенностям жизнедеятельности их организма. Безвыгульное содержание свиней, изменение параметров микроклимата, формирование больших групп, частые перегруппировки, нарушение кормления, интенсивная эксплуатация и другие факторы современных интенсивных технологий часто становятся причинами стрессовых реакций, вследствие чего понижается продуктивность животных, в том числе резко снижается качество свинины. Нарушение аутолитических процессов в
