CC BY
5Вчеш записки Тавршського нацiонального унiверситету îm. В.1. Вернадського Серiя «Бюлопя, хiмiя». Том 26 (65). 2013. № 3. С. 77-83.
УДК 577.121:963
ПРОЦЕСИ СИНТЕЗУ ОКСИДУ АЗОТУ I Н1ТРОЗИЛЮВАННЯ В ЕРИТРОЦИТАХ ХВОРИХ НА АПЛАСТИЧНУ АНЕМ1Ю
Йолтна Н.М.1, Коношенко С.В.2, Коцюруба А.В.3, Добровольський Ф.В.3
1Кримський факультет Запоргзького нащонального ушеерситету, Симферополь, Украта
2Таершський нащональний ушеерситет ¡м. В.1. Вернадського, Симферополь, Украта
31нститут фЫологй ¡м. О. О. Богомольця НАН Украти, Kuïe
E-mail: nataleiolkina@gmail. com
Показано, що в еритроцитах хворих на апластичну анемто спостертаються змши у систе]ш синтезу оксиду азоту, яю ведуть до переваги неокисного, арпназного метаболiзму над окисним, NO-синтазним метаболiзмом L-аргшшу i до обмеження накопичення NO-анюшв.
Разом iз тим, простежуеться збшьшення вмюту в еритроцитах високомолекулярних продук^в штрозилювання, що може мати певний вплив на структурно-функцюнальний стан еритроцитарних протишв.
Ключое1 слова: еритроцити, система синтезу оксиду азоту, арпназа, NO-синтази, NO-анiони, низькомолекулярнi i високомолекулярнi продукти штрозилювання, апластична анемiя.
ВСТУП
За багатьох захворюваннях вщбуваеться посилення переб1гу вшьно-радикальних реакцш, що призводить до розвитку оксидативного стресу, залежного вщ активних форм кисню [1-3].
Разом ¡з тим, за останш роки накопичилося багато даних щодо тюно1' взаемодп продукцп вшьних радикал1в кисню та оксиду азоту [4]. Дослщження останнього десятир1ччя показали, що оксид азоту (NO) е одним ¡з ушверсальних регулятор1в ф1зюлопчних функцш оргашзму з надзвичайно широким спектром бюлопчно1' дп [5]. Зокрема, вщомо, що в оптимальних концентращях NO полшшуе ендотел1альну функщю периферичних судин, позитивно впливае на активнють деяких протешкшаз, а також може бути шпб1тором каспаз, пригшчувати 1ндукщю апоптозу [6, 7]. Але синтез оксиду азоту у надм1рних концентращях може бути причиною штрозативного стресу, що викликаеться активними формами азоту, перш за все, пероксиштритом i продуктом його деградацп дюксидом азоту [4].
Певним маркером штрозативного стресу вважаеться також утворення штрозотюл1в, зокрема, продукпв штрозилювання проте1'тв [4].
Все це свщчить про доцшьшсть вивчення процес1в, яю стосуються метабол1зму оксиду азоту, його синтезу i використання в клггинах р1зного типу як за умов норми, так й за умов патологи.
Оскшьки за рядом захворювань в патолопчний процес залучаються еритроцити [8, 9], метою ще1 роботи було вивчення окремих показниюв системи синтезу оксиду
азоту i процешв штрозилювання в еритроцитах хворих на апластичну анемiю (аплазiю кiсткового мозку).
МАТЕР1АЛИ I МЕТОДИ
Матерiалом для дослщжень слугували еритроцити практично здорових людей (25 донорiв станцiï переливання кровi) та хворих на апластичну анемда (11 осiб, середнiй вш 56,0 рокiв). У кожнiй груш сшввщношення чоловiкiв та жiнок було приблизно однаковим. Кров брали на б^ Кримського онкологiчного центру при ïx вступi до стацiонару, перед початком лiкування.
Гемолiз еритроцитiв здшснювали у рiвному об'eмi дистильованоï води, взяв за основу метод Драбкша [10].
Стан системи синтезу оксиду азоту ощнювали, вивчаючи показники гемолiзатiв, що характеризують iнтенсивнiсть неокисного (аргшазного) та окисного (NO-синтазного) метаболiзму L-аргшшу.
Iнтенсивнiсть неокисного метаболiзму L-аргiнiну ощнювали, визначаючи активнiсть аргiнази [11]. 1нтенсившсть окисного перетворення L-аргiнiну, що супроводжусться синтезом оксиду азоту de novo, ощнювали за актившстю iзоферментiв NO-синтаз - кальцiй-залежноï, конститутивноï (сNOS) i кальцш-незалежноï iндуцибельноï (iNOS) синтази [12].
Вщсоткову долю активностi с NOS (% сNOS) вiдповiдно сумарно1' активностi NO-синтаз визначали за формулою:
% cNOS = cNOS 100% / nôiàôià àêôèâi3nôu NOS .
Поряд iз цим, в гемолiзатаx еритроцитiв визначали вмют стабiльниx метаболiтiв оксиду азоту - штрит-анюшв ( NO- ) i штрат-анюшв ( NO3- ) [13].
Для ощнки процесiв штрозилювання визначали вмют низькомолекулярних i високомолекулярних нiтрозотiолiв [14].
В усix дослщах використовували спектрофотометричнi методи бiоxiмiчного аналiзу.
Одержанi експериментальнi данi обробляли статистично з використанням t-критерiю Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ
З лiтератури вщомо [4], що при рiзниx патолопях активнiсть кальцiй-залежноï, конститутивно!' синтази оксиду азоту ^NOS) е порiвняно низькою, але зростае активнiсть кальцiй-незалежноï, iндуцибельноï синтази (iNOS), яка в багатьох кттинах iндукуеться запальними цитокiнами, штерлейкшом в, iнтерфероном у. Активацiя конститутивноï NOS здiйснюеться пiдвищенням внутрiшньоклiтинного вмюту Ca2+ i конститутивно протеïнкiназою В, яка знаходиться тд контролем iнсулiновоï сигнальноï системи чи сфiнгомiелiнового сигнального каскаду [4, 15].
Як показали результати наших дослщжень, в еритроцитах хворих на апластичну анемда суттево знижуеться штенсивнють конститутивного синтезу оксиду азоту.
Актившсть кальцш-залежно! конститутивно! синтази оксиду азоту визначена на 43% меншою порiвняно з контрольною групою донорiв (таблиця). Водночас, iнтенсивнiсть iндуцибельного синтезу оксиду азоту значно зростае. Актившсть кальцш-незалежно! синтази оксиду азоту збшьшувалась у 3,2 разу порiвняно з контрольною групою.
Доля фiзiологiчного конститутивного синтезу оксиду азоту в еритроцитах практично здорових людей складала, в середньому, 66% вщ сумарного синтезу оксиду азоту, тодi як у хворих на апластичну анемiю спостер^алося виражене зниження даного показника - до 26,0% вщ показника контрольно! групи.
Оскшьки субстратом для КО-синтаз е L-аргiнiн було важливим дати ощнку неокисного метаболiзму цiе! амшокислоти, здатно! перетворюватися ферментом аргiназою до сечовини та орштину. Було встановлено, що активнiсть аргiнази в еритроцитах хворих на апластичну анемда достовiрно зростае: у 2,0 рази порiвняно з контрольною групою, що свщчить про активiзацiю неокисного, аргiназного метаболiзму, який конкуруе з окисним КО-синтазним метаболiзмом L-аргiнiну. Спiввiдношення неокисного та окисного метаболiзму L-аргiнiну (Arg/NOS) достовiрно зростало в еритроцитах хворих: у 1,5 разу порiвняно з контрольною групою.
Таблиця
Показники системи синтезу оксиду азоту i процепв нiтрозилювання в еритроцитах хворих на апластичну анемiю (вщсоткова доля вiдносно показника контрольно! групи ); М ± т
Показники Обстежеш групи
Контрольна група Хворi на апластичну анемiю
cNOS 100± 15,0 57,0 ± 4,5**
iNOS 100 ± 16,4 320,0 ± 45,0**
% c NOS 66,3 ± 6,4 26,0 ± 3,5**
Аргшаза 100 ± 8,0 214,7 ± 36,0**
Arg/NOS 100 ± 17,0 154,0 ± 15,0**
no- 100 ± 18,0 120,0 ± 20,0
no; 100 ± 16,0 77,0 ± 11,0
НМНТ 100 ± 11,3 93,0 ± 11,5
ВМНТ 100 ± 13,5 390,0 ± 55,0**
* - контроль - 100%;
** - вiрогiднiсть вщмши показника вщносно контрольно! групи (р < 0,05).
Вивчення пулiв стабiльних метаболiтiв оксиду азоту (штрит- i нiтрат-анiонiв) показало, що !х вмiст зазнае незначш змiни, якi простежуються на рiвнi тенденцi!.
Практично вмiст N02- i N03 в еритроцитах хворих залишався на рiвнi контрольно!
групи. Це може свщчити або про гальмування процесiв окиснення N0 (на тлi
достатньо високо1' активносп 1ндуцибельно1' синтази оксиду азоту), або про бшьш активне використання NO в шших реакщях метабол1зму оксиду азоту, зокрема, в реакщях утворення штрозотюл1в.
Вивчення вмюту в еритроцитах низькомолекулярних i високомолекулярних продукпв штрозилювання показало, що у хворих на апластичну анемда спостершаеться суттеве зростання р1вня високомолекулярних н1трозот1ол1в (ВМНТ): у 3,9 разу пор1вняно з контрольною групою (таблиця). Вмют низькомолекулярних штрозотюл1в (НМНТ) практично не змшювався.
Оскшьки головним представником низькомолекулярних н1трозот1ол1в е штрозоглутатюн [4], можна допустити можливють вившьнення глутатюну з процешв штрозилювання для бшьш активного його використання еритроцитами за умов патологи у вщновлювальних реакщях.
Разом ¡з тим, досить виражене збшьшення вмюту в еритроцитах хворих високомолекулярних штрозотюл1в свщчить про активний перебш процешв, що ведуть до утворення р1зних продукпв х1м1чно1' модифшаци протешв, головним чином, гемоглобшу. Штрозилювання гемоглобшу можна було б ощнювати як один з мехашзм1в регуляци його спорщненосп до кисню, утворення оксигеновано1' форми (за умов штрозилювання по зал1зу гемово1' групи).
Отже, одержат даш свщчать про те, що за апластичнш анеми в еритроцитах вщбуваються метабол1чш перебудови, яю пов'язаш з системою синтезу оксиду азоту i ведуть до переваги штенсивносп неокисного, арпназного метабол1зму над штенсивнютю окисного, NO-синтазного метабол1зму L-аргiнiну. Змши у систем! синтезу оксиду азоту разом ¡з вщповщними особливостями в утворенш низькомолекулярних i високомолекулярних продукпв штрозилювання можуть мати певне значення, впливаючи на генерування в еритроцитах хворих активних форм азоту, на р1вень вщновлювальних екшваленпв у форм1 глутатюну, а також, що цшком 1мов1рно, на функцюнальний стан окремих протешв, зокрема, гемоглоб1ну.
ВИСНОВКИ
1. В еритроцитах хворих на апластичну анемда вщбуваються змши у систем1 синтезу оксиду азоту, що ведуть до переваги неокисного, арпназного метабол1зму над окисним, NO-синтазним метабол1змом L-аргiнiну, а також до обмеження накопичення NO-анiонiв.
2. За апластичнш анеми в еритроцитах змшюеться спiввiдношення низькомолекулярних i високомолекулярних продукпв нiтрозилювання: суттево збiльшуеться вмют високомолекулярних штрозотюл!в, що може вплинути на структурно-функцiональний стан еритроцитарних протешв.
3. Змши у системi синтезу оксиду азоту, як! простежуються в еритроцитах хворих на апластичну анемда, можуть мати певне компенсаторне значення, впливаючи на генерування активних форм азоту i шдтримку р!вня вщновлювальних еквiвалентiв у форм! глутатiону.
Список лггератури
1. Дубинина Е.Е. Окислительная модификация протеинов, ее роль при патологических состояниях / Е.Е. Дубинина, А.В. Пустыгина // Укр. бюим. журн. - 2008. - Т. 80, № 6. - С. 5-18.
2. Меньщиков Е.Б. Окислительный стресс при воспалении / Е.Б. Меньщиков, Н.К. Зенков // Усп. совр. биол. - 1997. - Т. 117, № 2. - С. 155-169.
3. Меньщиков Е.Б. Окислительный стресс: патологические состояния и заболевания / Е.Б. Меньщиков, Н.К. Зенков, В.З. Ланкин // Новосибирск: АРТА, 2008. - 284 с.
4. Сагач В.Ф. Пригшчення оксидативного та штрозативного стресу як мехашзм кардю- i вазо протекторно! дл екдистерону за умов експериментального цукрового дiабету I типу / В.Ф. Сагач, Ю.П. Коркач, А.В. Коцюруба, О.Д. Присяжна // Фiзiол. журн. - 2008. - Т. 54, № 5. - С. 46-54.
5. Акопова О.В. Оксид азоту пригшчуе вщкриття мiтохондрiальноi пори i збшьшуе кальщеву емшсть м^охондрш in vivo / О.В. Акопова, А.В. Коцюруба, Ю.П. Ткаченко, В.Ф. Сагач // Фiзiол. журн. -2005. - Т. 51, № 3. - С. 3-11.
6. Ping P. Isoform-selective activation of protein kinase C by nitric oxide in the heart of conscious rabbits: a signaling mechanism for both nitric-oxide-induced and ischemia-induced preconditioning / P. Ping, H. Takano, J. Zhang et al // Circulat. Res. - 1999. - V. 84. - P. 587-604.
7. Li J. Nitric oxide suppresses apoptosis via interrupting caspase activation and mitochondrial dysfunction in cultured hepatocytes / J. Li, C.A. Bombeck, S. Yang, Y.M. Kim, T.R. Billiar // J. Biol. Chem. - 1999. -V. 274. - P. 17325-17333.
8. Ёлкина Н.М. Энзиматическая активность эритроцитов человека при ишемической болезни сердца в условиях развития окислительного стресса / Н.М. Ёлкина, С.В. Коношенко, И. Шашуа // Ученые записки Таврического национального университета им. В.И. Вернадского. - Серия: Биология, химия. - 2011. - Т. 24 (63), № 2. - С. 124-128.
9. Новицкий В.В. Белковый спектр мембран эритроцитов у больных раком легкого и с опухолями головы и шеи / В.В. Новицкий, В.Е. Гольберг, М.В. Колосова и др. // Бюл. эксперим. биол. и медиц. -1999. - Прил. 1. - С. 18-20.
10. Drabkin D. A simplified technique for large scale crystallization myoglobin and haemoglobin in the crystalline / D. Drabkin // Arch. biochem. - 1949. - V. 21. - P. 224-226.
11. Шугалей В.С. Содержание мочевины и активность аргиназы в органах крыс при акклиматизации к холоду / В.С. Шугалей, А.С. Козина // Физиол. журн. СССР. - 1977, № 8. - С. 1199-1202.
12. Chin S.Y. Increased activity and expression of Ca2+ - depended NOS in renal cortex of ANG Il-infused hypertensive rats / S.Y. Chin, K.N. Pandey, S.J. Shi et al // Amer. J. Physiol. - 1999. - V. 277, N 5. - P. 797804.
13. Green L.L. Analysis of nitrate, nitrite and [N+5]-nitrate in biological fluids / L.L. Green, D.A. Wagner, J. Glogowski et al // Anal. Biochem. - 1982. - V. 126, N 1. - P. 131-138.
14. Gerdal D. Inhibition of the catalitic activity of alkoholdegydrogenase by NO is associated with S-nitrosylation and the release of zinc / D. Gerdel, A.J. Cederbaum // Biochemistry. - 1996. - V. 35, N 50. -P. 16186-16194.
15. Villa Bianca R. Sphingosine 1-phosphate induced endothelial nitric-oxide synthase activation through phosphorylation in human corpus cavernosum / R. Bianca Villa, R. Sorrentino, C. Imbimbo et al // J. Pharmacol. Exp. Therap. - 2006. - V. 316, N 2. - P. 703-708.
Ёлкина Н.М. Процессы синтеза оксида азота и нитрозилирования в эритроцитах больных апластической анемией / Н.М. Ёлкина, С.В. Коношенко, А.В. Коцюруба, В.Ф. Сагач, Ф.В. Добровольский // Ученые записки Таврического национального университета им. В.И. Вернадского. Серия «Биология, химия». - 2013. - Т. 26 (65), № 3. - С.77-83. Показано, что в эритроцитах больных апластической анемией наблюдаются изменения в системе синтеза оксида азота, которые ведут к преобладанию неокислительного, аргиназного метаболизма над окислительным, NO-синтазным метаболизмом L-аргинина и к ограничению накопления NO-анионов.
Вместе с этим, прослеживается увеличение содержания в эритроцитах высокомолекулярных продуктов нитрозилирования, что может влиять на структурно-функциональное состояние эритроцитарных протеинов.
Ключевые слова: эритроциты, система синтеза оксида азота, аргиназа, NO-синтазы, NO-анионы, низкомолекулярные и высокомолекулярные продукты нитрозилирования, апластическая анемия.
PROCESSES OF NITRIC OXIDE SYNTHESIS AND NITROSYLATION IN ERYTHROCYTES OF PATIENTS WITH APLASTIC ANEMIA Yolkina N.M.1, Konoshenko S.V.2, Kotsuruba A.V.3, Dobrovolsky F.V.3
1Crimea faculty of Zaporogie National University, Simferopol, Ukraine 2TavridaNational V.I. Vernadsky University, Simferopol, Crimea, Ukraine 3O.O. Bogomolets Institute of Physiology National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv E-mail: nataleiolkina@gmail.com
Elucidation of the molecular basis of various diseases and pathological states of human organism is one of the most significant problems of medicine and biology [1-3]. It is known, that the ways of production of free radicals of oxygen and nitric oxide are closely binded [4]. The synthesis of nitric oxide over standard level may causes nitrosative stress, that is binded with active forms of nitric oxide, for example, peroxinitrite and nitric dioxide [4]. The formation of nitrosothiols is one of the markers of nitrosative stress also [4, 5]. Given that in some diseases erythrocytes are involved in pathological process [6, 7], the aim the present work was to study the indexes of the system of nitric oxide synthesis and nitrosylation in erythrocytes under aplastic anemia. The materials for the study were the erythrocytes of healthy subjects (control group) and patients with aplastic anemia. The erythrocytes were hemolisated by distilled water. In hemolisates of erythrocytes was
determined the content of NO-anions (NO- and NO3-) [8], low-molecular and high-
molecular products of nitrosylation [9] and the activity of arginase [10], cNOS and iNOS [11]. It has been shown, that in erythrocytes of patients with aplastic anemia the system of nitric oxide synthesis is changed. The metabolism of L-arginine by arginase prevailes over oxidative metabolism with NO synthesis (was 54% higher when compared to control group). The activity of Ca2+-dependent NO-synthase was 43% less when compared to control group. The activity of Ca2+-independent nitric oxide synthase was rised (22% higher when compared to control group). The activity of arginase was rised also (100% higher when compared to control group). The accumulation of NO-anions in erythrocytes of patients was limited. The level of low-molecular products of nitrosylation was not changed. It is known that nitrosoglutatione is one of the main low-molecular products of nitrosylation [4]. The lowring of the content of low-molecular products in erythrocytes of patients with aplastic anemia may be as index of releasing of glutatione from processes of nitrosylation for it more active utilization in reductative reactions. At the same time, the content of high-molecular products of nitrosylation was rised (290% higher when compared to control group). So far as the high-molecular products of nitrosylation are, in the main, nitrosylated proteins [4], these changes in erythrocytes of patients with aplastic anemia may have certain influence on structural-functional state of erythrocyte proteins;
in particular, of haemoglobin. The changes that are observed in the system of nitric oxide synthesis in erythrocytes may have influence on generation of nitric active forms and level of reductated glutatione also.
Thus, under aplastic anemia the metabolic changes are realized in erythrocytes, the development of nitrosative stress is accompanied by realization of some compensative reactions.
Key words: erythrocytes, system of nitric oxide synthesis, arginase, NO-synthases, NO-anions, low-molecular and high-molecular products of nitrosylation, aplastic anemia.
References
1. Dubinina E.E., Pustigina A.V., Oxidative modification of proteins, it importance in pathological states, Ukr. biochem. J., 80, 6, 5 (2008).
2. Menshikov E.B., Zenkov N.K., Oxidative stress under inflammation, Impr. mod. biol., 117, 2, 155 (1997).
3. Menshikov E.B., Zenkov N.K., Lankin V.Z., Oxidative stress: pathological states and diseases, 284 p. (ARTA, Novosibirsk, 2008).
4. Sagach V.F., Korkach U.P., Kotsuruba A.V., Prysyazhna O.D., The inhibition of oxidative stresses by ecdysterone as the mechanism of the cardio- and vasoprotective action at type I diabetes, Physiol. J., 54, 5, 46 (2008).
5. Akopova O.V., Kotsuruba A.V., Tkachenko U.P., Sagach V.F., Nitric oxide suppresses permeability, transition pore opening and enhances calcium uptake in mitochondria in vivo, Physiol. J., 51, 3, 3 (2005).
6. Yolkina N.M., Konoshenko S.V., Shashua I., Enzym activity of human erythrocytes under ischemic heart desease, Scientific Notes Taurida National V.I. Vernadsky University, 24 (63), 2, 124 (2011).
7. Novitski V.V., Goldberg V.E., Kolosova M.V., Protein spector of erythrocyte membranes of patients with lung cancer and tumours of head and neck, Bul. experim. biol. and med., suppl. 1, 18 (1999).
8. Green L.L., Wagner D.A., Glogowski J., Analysis of nitrate, nitrite and [N^j-nitrate in biological fluids, Anal. Biochem., 126, 1, 131 (1982).
9. Gerdal D., Cederbaum A.J., Inhibition of the catalitic activity of alkoholdegydrogenase by NO is associated with S-nitrosylation and the release of zinc, Biochemistry, 35, 50, 16186 (1996).
10. Shugaley V.S., Kozina A.S., Content of urea and arginase activity in rats organs under acclimatization for cold, USSR Physiol. J., 8, 1199 (1977).
11. Chin S.Y., Pandey K.N., Shi S.J., Increased activity and expression of Ca2+ - depended NOS in renal cortex of ANG II-infused hypertensive rats, Amer. J. Physiol., 277, 5, 797 (1999).
Поступила в редакцию 16.08.2013 г.
