CC BY
10
УДК 616.316-008-092.18-092.6
Сл'шська А.М., Соловйова Н.В., Костенко В.О.
РОЛЬ ПЕРОКСИН1ТРИТУ У МЕХАН1ЗМАХ В1ЛЬНОРАДИКАЛЬНИХ ПРОЦЕС1В У СЛИННИХ ЗАЛОЗАХ ЗА УМОВ В1ДТВОРЕННЯ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО МЕТАБОЛ1ЧНОГО СИНДРОМУ
ВДНЗУ «Украшська медична стоматологiчна академiя», м. Полтава
У експеримент1 на 30 б/лих щурах досл/джено роль пероксин1триту в механ/змах порушень в/льно-радикальних процес/в у тканинах п/днижньощелепних слинних залоз (СЗ) при моделюванн/ метабо-л1чного синдрому (МС). Показано, що розлади окиснювального метабол/зму та дисбаланс NO-синтазного та арг/назного шлях'т метабол/зму L-аргiнiну у СЗ за цих умов е пероксин/трит-залежними. Введення п/д час експерименту щурам скевенджеру пероксин1триту L-селенометiонiну знижуе у СЗ активн/сть NO-синтази та концентрац1ю н/трит-йон/в, п/двищуе активн/сть ферменту неокисного (арг/назного) шляху метабол/зму L-аргiнiну - орн/тиндекарбоксилази. При цьому L-селеномет/он/н знижуе у тканинах СЗ продукцю супероксидного ан/он-радикала НАДФН-залежним (м1кросомальним та NO-синтазою) та НАДН-залежним (м1тохондр1альним) електронно-транспортними ланцюгами, iнтенсивн/сть пероксидного окиснення л/п/д/в, п/двищуе антиоксидан-тний захист, активн/сть супероксиддисмутази та каталази.
Ключов1 слова: метабол1чний синдром, пероксиытрит, L-селенометiонiн, слинн залози, NO-синтаза, пероксидне окиснення л1п1д1в, антиоксидантна система.
Робота е фрагментом НДР "Кисень- та NO-залежнi механ/зми ушкодження внутр/шн/х орган/в та )'х корекц/я ф/з/ологЧно активними речовинами" (№ держреестрацп 0108U010079).
Вщомо, що серед хворих з ознаками метабо-лiчного синдрому (МС) досить поширеними е реактивно-дистрофiчнi ураження слинних залоз (СЗ) з порушенням ТхньоТ функцп [1]. За думкою авторiв ц змши можуть розглядатися в структурi единого патолопчного процесу, загальним пато-генетичним мехаызмом якого е шсулшорезисте-нтнють (1Р). Виразнють кл^чних проявiв аалоа-денозу корелюе з тяжкютю переб^у МС.
Структури СЗ е досить чутливими до дефщи-ту або надлишку оксиду азоту (NO), що утворю-еться за участю рiзних iзоформ NO-синтази, жт-ритредуктаз, неферментативних реакцш вщнов-лення жтрит-йожв [4]. В останж роки показано, що NO-залежне ураження СЗ за умов хрожчного запалення та штоксикацп в значнш мiрi опосе-редковуеться через утворення високотоксичного пероксижтриту [2,7].
Утворення пероксинiтриту вiдбуваеться в результат взаемодiТ NO з супероксидним анюн-
радикалом (О 2 ) [14], вироблення якого у тканинах СЗ за умов МС, за нашими попереджми даними, ютотно збтьшуеться [3].
Одним iз шляхiв дослiдження ефектiв пероксижтриту in vivo е застосування скевенджерiв ць еТ речовини. Так, з ^ею метою використовують L-селенометiонiн [12], у тому чи^ при дослн дженнi ролi пероксинiтриту у пошкодженж СЗ [2,7]. Показано, що сполуки селену з низькою молекулярною масою ефективно реагують з пе-роксижтритом та захищають модельж речовини вщ окиснення та нiтрування, а плазмщну ДНК вiд пероксинiтрит-iндукованих однониткових розривiв [12].
Проте роль пероксинiтриту у патогенезi порушень окиснювальних процеав у слинних за-лозах за умов МС залишаеться нез'ясованою. Розв'язання цього питання дозволить розширити арсенал засобiв попередження та лiкування
розладiв СЗ та iнших залежних вщ ix стану систем при дм факторiв-iнiцiаторiв розвитку МС.
Метою роботи було вивчення ролi пероксиштриту в мехажзмах порушень втьнорадикаль-них процесiв у тканинах пщнижньощелепних СЗ щурiв за умов моделювання МС.
Матерiали та методи дослщження
Дослiдження були проведенi на 30 бiлиx щу-рах-самцях лшп Вютар масою 180-230 г у 3-х се-рiяx дослiдiв: у першш необxiднi показники ви-вчали у штактних тварин (контрольна серiя), у другш - пiсля моделювання МС, у третш - про-тягом вщтворення МС щурам вводили скевен-джер пероксинiтриту - L-селенометiонiн ("Sigma-Aldrich, Inc.", США) - в дозi 3 мг/кг [13] внутрш ньоочеревинно 2 рази на тиждень. Тварин дека-пiтували пiд ефiрним наркозом.
Для моделювання МС гризунам протягом двох мюя^в призначали 20% водний розчин фруктози для пиття та '"фету захщного типу" [5].
Активнють ферменту окисного шляху мета-болiзму L-аргiнiну - NO-синтази - визначали за
рiзницею концентрацп жтрит-йожв (NO2) до та жсля шкубаци гомогенату пiднижньощелепниx СЗ у середовищ^ що мiстить L-арпнш та НАДФН. Концентрацiю NO2- визначали шляхом утворення дiазосполук у реакцп з сульфажло-вою кислотою, а по™ проводили реакцiю з а-нaфтилетилендiaмiном, у результатi яко! утво-рюються поxiднi червоного кольору (азобарвни-ки) [10].
Активнiсть ферменту неокисного (арпназно-го) шляху метaболiзму L-арпншу - оржтиндека-рбоксилази - визначали за зниженням вмюту орнiтину в шкубацшному середовищi методом Chinard у модифкацп [8].
Утворення О2 у тканинах пщнижньощелеп-
Актуальш проблеми сучасно'1 медицини
них СЗ оцшювали при проведеннi тесту з штро-синiм тетразолieм з такими шдукторами: НАДН -
для оцшки продукци О2 мiтохондрiальним елек-тронно-транспортним ланцюгом (ЕТЛ); НАДФН -
для оцшки продукци О2 мiкросомальним ЕТЛ та NO-синтазою [9]. Рiвень пероксидного окиснення лiпiдiв (ПОЛ) у тканинах оцшювали за утворен-ням у реакци тюбарб^уровоТ кислоти (ТБК) з ТБК-активними продуктами забарвленого три-метiнового комплексу до i пiсля 1,5-годинноТ ш-кубаци у прооксидантному залiзоаскорбатному буферному розчин [6]. Стан антиоксидантноТ (АО) системи оцшювали за приростом концент-раци ТБК-активних продуктiв за час швтораго-динноТ шкубаци гомогенату тканин СЗ у залiзо-аскорбатному буферному розчиш, а також за ак-тивнютю АО ферментiв - супероксиддисмутази (СОД) та каталази [6].
Отримаш дат обробляли варiацiйно-статистичним методом з використанням крите-рiю Ст'юдента.
Вплив L-селенометiонiну на показники окиснюв
Результати дослщження та ïx обговорення
Вщомо, що найбiльший piBeHb постачання
NO у реакцш, де bîh взаeмодie з О 2 , забезпе-чуеться функцiонуванням шдуцибельно'Г NO-синтази (поряд з штритредуктазним шляхом) [14]. У той же час, за небажаних умов (ппошя, дефщит субстра^в NO-синтазно'!' реакци) NOS
генеруе О 2 замiсть NO. Крiм того, виявлено, що NOS здатнi продукувати штроксильний анiон, який бере участь у реакци з молекулярним киснем з утворенням пероксиштриту [11]. Тобто, рь вень утворення пероксиштриту залежить вщ ба-гатьох чинниш i е важко прогнозованим.
Нами дослщжено вплив скевенджеру пероксиштриту L-селенометiонiну на сумарну активнють NOS та концентрацiю промiжного стабть-ного метаболiту NO - штрит-йошв - у тканинах пiднижньощелепних СЗ за умов МС (див. табл.).
Таблиця
процесв у тканинах СЗ умов вiдтворення МС (M+m, n=30)
Серп дослав
Показники 1нтактш Вiдтворення МС
тварини Контроль + L-селенометюнш
NOS, мкмоль NÛ 2 /г хв. 4.12±0.22 8.51±0.38 * 6.18±0.38 */**
Вмiст NÛ 2 , мкмоль/г 0.112±0.007 0.149±0.011 * 0.089±0.007 */**
Орштиндекарбоксилаза, нмоль/гхв. 275.4±10.2 205.3±9.8 * 257.9±15.6 **
Продукцiя О 2 , нмоль/г с НАДФН-залежними ЕТЛ НАДН-залежними ЕТЛ 16.13±0.77 16.80±0.33 24.00±0.42 * 25.73±0.27 * 22.53±0.39 */** 23.07±0.16 */**
Концентра^я ТБК-реактантiв, мкмоль/кг 24.6±0.9 37.5±0.6 * 29.3±0.9 */**
Прирют концентрацп' ТБК-реактантiв, мкмоль/кг 8.1±0.6 12.0±0.8 * 8.7±1.0 **
СОД, од. акт. 0.24±0.02 0.15±0.02* 0.22±0.02 **
Каталаза, мккатал/кг 2.79±0.21 1.80±0.16 * 2.72±0.18 **
npuMimKa: * - р<0,05 у порiвняннi з даними iHmaKmHux щурв, **
При внесены L-селенометюншу за умов мо-делювання МС активнють NOS i концентра^я штрит-йошв у тканинах пщнижньощелепних Сз зменшуються - вщповщно на 27.4% (p<0.01) та 40.3% (p<0.01) у порiвняннi з даними другоТ серн'.
Звертае на себе увагу, що за цих умов у тканинах СЗ пщвищуеться активнють орштиндекар-боксилази - на 25.6% (p<0,05) у порiвняннi з даними другоГ сери.
Введення бiлим щурам L-селенометюншу за
умов вiдтворення МС знижуе вироблення О 2 НАДФН i НАДН-залежними ЕТЛ - вщповщно на 6.1% (p<0.05) та 10.3% (p<0.001) у порiвняннi з даними друго'Г сери.
Обмеження продукци' О 2 НАДФН-залежним ^кросомальним та NOS) i НАДН-залежним (мь тохондрiальним) ЕТЛ при дм скевенджеру перо-
р<0,05 у порiвняннi з даними другоТсерТ ксиштриту L-селенометiонiну, за нашою думкою, вщображуе здатнiсть пероксинiтриту порушува-ти у кл^инах функцiонування цих ланцюпв (шак-тивувати НАДН- та НАДФН-залежш оксидореду-ктази, руйнувати FeS-кластери) [14,15]. У мто-хондрiях пероксинiтрит пригшчуе комплекси МФК I (НАДН-дегiдрогеназа), МФК II (сукцинат-дегiдрогеназа), МФК III (цитохром с редуктаза) та комплекс V (АТФ-синтаза), за допомогою рiз-них механiзмiв, пов'язаних, зокрема, з окиснен-ням цистеТнових i метюншових залишкiв бiлкiв, нiтруванням тирозину, ушкодженням FeS центрiв. Нiтрування пероксинiтритом Мп-СОД
запобiгаe дисмутаци О 2 з подальшою участю останнього в утворенш пероксинiтриту. Тобто, цей механiзм функцюнуе з ознаками «зачарова-ного» кола.
Введення тваринам L-селенометiонiну за умов вщтворення МС достовiрно зменшуе кон-
Том 14, Випуск 3(47) 199
центрацш ТБК-активних сполук - на 21.9% (р<0.001). Величина приросту концентрацп ТБК-активних сполук за час твторигодинноТ шкубаци у залiзоаскорбатному буферному розчиш - зни-жуеться на 27.5% (р<0.05) у порiвняннi з даними другоТ серiТ.
Зниження величини останнього показника вказуе на здатнють L-селенометiонiну обмежу-вати зниження АО потен^алу, що також пщтве-рджуеться достовiрним пiдвищенням у тканинах активност АО ферментiв. Так, при введенш тва-ринам L-селенометiонiну за умов експеримента-льного МС активнiсть СОД i каталази збтьшу-еться - вщповщно на 46.7% (р<0.05) та 51.1% (р<0,01) у порiвняннi з даними другоТ серп.
Висновки
1. Дисбаланс NO-синтазного та аргшазного шляхiв метаболiзму L-аргiнiну у тканинах пщнижньощелепних СЗ за умов експериментального МС е пероксиштрит-залежним процесом. Введення бтим щурам скевенджеру пероксиштриту L-селенометiонiну за умов експериментального МС знижуе у тканинах пщнижньощелепних СЗ активнють NO-синтази та концентрацш штрит-йошв i пiдвищуе активнiсть ферменту аргшазно-го шляху метаболiзму L-аргiнiну - орнiтиндекар-боксилази.
2. Введення бтим щурам скевенджеру пероксиштриту L-селенометiонiну за умов експериментального МС знижуе у тканинах пщнижньощелепних СЗ продукцш супероксидного анюн-радикала НАДФН-залежним ^кросомальним та NO-синтазою) i НАДН-залежним (мiтохондрiаль-ним) електронно-транспортними ланцюгами.
3. Введення бiлим щурам скевенджеру пероксиштриту L-селенометiонiну за умов вщтворен-ня МС знижуе у тканинах пщнижньощелепних СЗ активнють ПОЛ i пщвищуе стан АО захисту, що пщтверджуеться зменшенням концентрацiТ ТБК-активних сполук та Тх приросту за час швто-ригодинноТ iнкубацiТ у прооксидатному буферному розчиш, збтьшенням активносп СоД i ка-талази.
Реферат
РОЛЬ ПЕРОКСИНИТРИТА В МЕХАНИЗМАХ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ В СЛЮННЫХ ЖЕЛЕЗАХ ПРИ ВОСПРОИЗВЕДЕНИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО МЕТАБОЛИЧЕСКОГО СИНДРОМА Елинская А.Н., Соловьева Н.В., Костенко В.А.
Ключевые слова: метаболический синдром, пероксинитрит, Ь-селенометионин, слюнные железы, NO-синтаза, пероксидное окисление липидов, антиоксидантная система.
В эксперименте на 30 белых крысах исследована роль пероксинитрита в механизмах нарушений свободнорадикальных процессов в тканях поднижнечелюстных слюнных желез (СЖ) при моделировании метаболического синдрома (МС). Показано, что расстройства окислительного метаболизма и дисбаланс NO-синтазного и аргиназного путей метаболизма Ь-аргинина в СЖ в этих условиях являются пероксинитрит-зависимыми. Введение в ходе эксперимента крысам скэвенджера пероксинитрита Ь-селенометионина снижает в СЖ активность NO-синтазы и концентрацию нитрит-ионов, повышает активность фермента неокислительного (аргиназного) пути метаболизма Ь-аргинина - орнитинде-карбоксилазы. При этом Ь-селенометионин снижает в тканях СЖ продукцию супероксидного анион-радикала НАДфН-зависимой (микросомальной и NO-синтазой) и НАДН-зависимой (митохондриаль-ной) электронно-транспортными цепями, интенсивность пероксидного окисления липидов, повышает антиоксидантную защиту, активность супероксиддисмутазы и каталазы.
Лтература
1. Афанасьев В.В. Реактивно-дистрофические процессы слюнных желез (сиалоаденозы), протекающие на фоне метаболического синдрома / В.В. Афанасьев, Р.И. Стрюк, С.Э. Арутю-нян [и др.] // Стоматология. - 2011. - Т. 90, № 4. - С. 49-53.
2. Коваленко О.В. Морфофункцюнальш змши пщнижньощелеп-ноТ залози щурiв за умов вщтворення хрошчного травматичного Ыалоадешту та введення L-селенометюншу / О.В. Коваленко, Г.А. брошенко, В.О. Костенко // Свп" мед. та бюл. -2012. - № 1. - C. 63-67.
3. Костенко В.А. NO- и пероксинитрит-зависимые изменения продукции супероксидного анион-радикала в органах крыс при экспериментальном метаболическом синдроме / В.А. Костенко, А.Н. Елинская, Л.И. Ляшенко [и др.] // Журн. Грод-ненск. гос. мед. ун-та. - 2014. - № 2. - C. 74-77.
4. Костенко В.О. Роль слинних залоз у мехашзмах ауторегуляцп рiвня оксиду азоту в органiзмi ссав^в та Тх порушень / В.О. Костенко, А.М. блшська, Л.1. Ляшенко [та ш.] // Актуальш про-блеми сучасноТ медицини: Вюн. УкраТнськоТ мед. стоматол. академп. - 2013. - Т. 13, № 2. - C. 10-14.
5. Ляшенко Л.1. Роль NO-синтаз у мехашзмах порушень втьно-радикальних процеЫв у тканинах пародонта i слинних залоз щурiв за умов експериментального метаболiчного синдрому / Л.1. Ляшенко, А.М. блшська, В.В. Талаш [та ш.] // Свп" бiол. та мед. - 2014. - № 2. - С. 139-142.
6. Методи кшшчних та експериментальних дослщжень в медицин / [Л.В. Беркало, О.В. Бобович, Н.О. Боброва та ш.] ; За ред. 1.П. Кайдашева. - Полтава, 2003. - 320 с.
7. Стасюк О.А. Вплив скевенджерiв пероксинiтриту на окисню-вальнi процеси у тканинах слинних залоз бтих щурiв за умов сптьного надлишкового надходження нiтрату та фториду на-трiю / О.А. Стасюк, В.О. Костенко // Проблеми екологп та ме-дицини. - 2012. - Т. 16, № 5-6. - С. 30-33.
8. Храмов В.А. Простой метод определения активности орнити-ндекарбоксилазы в смешанной слюне человека / В.А. Храмов. // Клин. лаб. диагностика. - 1997. - № 4. - С. 14-15.
9. Цебржинский О.И. Дифференцированное спектрофотометри-ческое определение продукции супероксида в тканях НСТ-тестом / О.И. Цебржинский // Актуальш проблеми сучасноТ медицини: Вюн. УкраТнськоТ мед. стоматол. академп. - 2002. -Т. 2, № 1. - C. 96-97.
10. Hevel J.M. Purification of the inducible murene macrophage nitric oxide synthase / J.M. Hevel // J. Biol. Chem. - 1991. - V. 266, № 34. - Р. 22789-22791.
11. Kirsch M. Formation of peroxynitrite from reaction of nitroxyl anion with molecular oxygen / M. Kirsch, H. de Groot // J. Biol. Chem. -2002. - V. 277. - P. 13379-13388.
12. Klotz L.O. Defenses against peroxynitrite: selenocompounds and flavonoids / L.O. Klotz, H. Sies // Toxicol. Let. - 2003. - V. 140/141. - P. 125-132.
13. Laude K. NO produced by endothelial NO synthase is a mediator of delayed preconditioning-induced endothelial protection / K. Laude, J. Favre, C. Thuillez [et al.] // Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. - 2003. - Vol. 284, №6. - P. H2053-H2060.
14. Pacher P. Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease / P. Pacher, J.S. Beckman, L. Liaudet // Physiol. Rev. - 2007. - V. 87. - P. 315-424.
15. Szabo S. Peroxynitrite: biochemistry, pathophysiology and development of therapeutics / C. Szabo, H. Ischiropoulos, R. Radi // Nature Reviews. - 2007. - V. 6. - P. 662-680.
AKTyantrn npo6.TOMH cyHacHo'i Meg^HHH
Summary
ROLE OF PEROXYNITRITE IN THE MECHANISMS OF FREE RADICAL PROCESSES IN SALIVARY GLANDS UNDER MODELED
METABOLIC SYNDROME
Yelinska A.M., Solovyova N.V., Kostenko V.O.
Key words: metabolic syndrome, peroxynitrite, L-selenomethionine, salivary glands, NO-synthase, lipid peroxidation, antioxidant system.
The role of peroxynitrite in the mechanisms impairing free radical processes in the tissues of submandibular salivary gland (SG) under modeled metabolic syndrome (MS) was investigated in the experiment on 30 white rats. We have found out that oxidative metabolism disorder and imbalance of NO-synthase and ar-ginase metabolic pathways of L-arginine in the SG under these conditions are peroxynitrite-dependent. The use of peroxynitrite scavenger (L-selenomethionine) in MS modeling inhibits NO-synthase activity, lowers nitrite ions concentration and increases the activity of ornithine decarboxylase, an enzyme of non-oxidative (arginase) pathway of L-arginine metabolism. L-selenomethionine introduction under experimental conditions reduces superoxide anion radical overproduction by NADPH-dependent (microsomal and NO-synthase) and NADH-dependent (mitochondrial) electron transport chains, lipid peroxidation intensity, improves antioxidant status and activity of superoxide dismutase and catalase.
TOM 14, BnnycK 3(47) 201
