CC BY
5Вчеш записки Тавршського нацiонального унiверситету îm. В.1. Вернадського Серiя «Бюлогш, хiмiя». Том 27 (66). 2014. № 1. С. 64-70.
УДК 577.121:963
ПОКАЗНИКИ МЕТАБОЛ1ЗМУ ОКСИДУ АЗОТУ В ЕРИТРОЦИТАХ ХВОРИХ НА ЕРИТРЕМ1Ю
Йолтна Н.М.1, Коношенко С.В.2
1 Кримський факультет Запор1зького нащонального ушверситету, Симферополь, Украта
2 Тавршський нащональний ушверситет ¡м. В.1. Вернадського, Симферополь, Украта
E-mail: nataleiolkina@gmail. com
Показано, що в еритроцитах хворих на еритремш спостертаються змши у систе]М синтезу оксиду азоту, яю ведуть до переваги неокисного, арпназного метаболiзму над окисним, NO-синтазним метаболiзмом L-аргшшу i до обмеження накопичення NO-анiонiв.
Разом iз тим, простежуеться збiльшення вмюту в еритроцитах високомолекулярних продуктiв штрозилювання, що може мати певний вплив на структурно-функцюнальний стан еритроцитарних протишв.
Ключов1 слова: еритроцити, система синтезу оксиду азоту, аргшаза, NO-синтази, NO-анюни, низькомолекулярнi i високомолекулярнi продукти штрозилювання, еритремiя.
ВСТУП
За багатьох захворюваннях вщбуваеться посилення переб1гу вшьно-радикальних реакцш, що призводить до розвитку оксидативного стресу, залежного вщ активных форм кисню [1-3].
Разом ¡з тим, за останш роки накопичилося багато даних щодо тюно1' взаемодп продукцп вшьних радикал1в кисню та оксиду азоту [4]. Дослщження останнього десятир1ччя показали, що оксид азоту (NO) е одним ¡з ушверсальних регулятор1в ф1зюлопчних функцш оргашзму з надзвичайно широким спектром бюлопчно1' дп [5]. Зокрема, вщомо, що в оптимальних концентращях NO полшшуе ендотел1альну функщю периферичних судин, позитивно впливае на активнють деяких протешкшаз, а також може бути шпб1тором каспаз, пригшчувати 1ндукщю апоптозу [6, 7]. Але синтез оксиду азоту у надм1рних концентращях може бути причиною штрозативного стресу, що викликаеться активними формами азоту, перш за все, пероксиштритом i продуктом його деградацп дюксидом азоту [4].
Певним маркером штрозативного стресу вважаеться також утворення штрозотюл1в, зокрема, продукпв штрозилювання протешв [4].
Все це свщчить про доцшьшсть вивчення процес1в, яю стосуються метабол1зму оксиду азоту, його синтезу i використання в кттинах р1зного типу як за умов норми, так й за умов патологи.
Оскшьки за рядом захворювань в патолопчний процес залучаються еритроцити [8, 9], метою ще1 роботи було вивчення окремих показниюв системи синтезу оксиду азоту i процес1в штрозилювання в еритроцитах хворих на еритрем1ю.
МАТЕР1АЛИ I МЕТОДИ
MaTepiaroM для дослiджень слугували еритроцити практично здорових людей (25 доноpiв станци переливання кpовi) та хворих на еритремда (11 осiб, сepeднiй bîk 55 pокiв). У кожнiй груш сшввщношення чоловiкiв та жшок було приблизно однаковим. Кров брали на б^ Кримського онкологiчного центру при ïx вступi до стaцiонapу, перед початком лшування.
Гeмолiз epитpоцитiв здшснювали у piвному об'eмi дистильовaноï води, взяв за основу метод Драбкша [10].
Стан системи синтезу оксиду азоту ощнювали, вивчаючи показники гeмолiзaтiв, що характеризують iнтeнсивнiсть неокисного (арпназного) та окисного (NO-синтазного) мeтaболiзму L-аргшшу.
Iнтeнсивнiсть неокисного мeтaболiзму L-apгiнiну ощнювали, визначаючи aктивнiсть apгiнaзи [11]. 1нтенсившсть окисного перетворення L-apгiнiну, що супроводжусться синтезом оксиду азоту de novo, ощнювали за актившстю iзофepмeнтiв NO-синтаз - кaльцiй-зaлeжноï, конститутивноï (сNOS) i кальцш-нeзaлeжноï iндуцибeльноï (iNOS) синтази [12].
Вщсоткову долю aктивностi с NOS (% сNOS) вiдповiдно сумарно1' aктивностi NO-синтаз визначали за формулою:
% cNOS = cNOS 100%/nàïàôià àêôèâi3nôu NOS .
Поряд iз цим, в гeмолiзaтax epитpоцитiв визначали вмют стaбiльниx мeтaболiтiв оксиду азоту - штрит-анюшв ( NO- ) i штрат-анюшв ( NO3- ) [13].
Для ощнки пpоцeсiв штрозилювання визначали вмiст низькомолекулярних i високомолекулярних нiтpозотiолiв [14].
В усix дослщах використовували спeктpофотомeтpичнi методи бiоxiмiчного aнaлiзу.
Одepжaнi eкспepимeнтaльнi дaнi обробляли статистично з використанням t-кpитepiю Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ
З лiтepaтуpи вщомо [4], що при piзниx патолопях aктивнiсть кaльцiй-зaлeжноï, конститутивно!' синтази оксиду азоту ^NOS) е поpiвняно низькою, але зростае aктивнiсть кaльцiй-нeзaлeжноï, iндуцибeльноï синтази (iNOS), яка в багатьох кттинах iндукуеться запальними цитокiнaми, штерлейкшом в, iнтepфepоном у. Активaцiя конститутивноï NOS здiйснюеться пiдвищeнням внутpiшньоклiтинного вмюту Ca2+ i конститутивно пpотeïнкiнaзою В, яка знаходиться тд контролем iнсулiновоï сигнaльноï системи чи сфiнгомiелiнового сигнального каскаду [4, 15].
Як показали результати наших дослщжень, в еритроцитах хворих на еритремда суттево знижуеться iнтeнсивнiсть конститутивного синтезу оксиду азоту.
Актившсть кaльцiй-зaлeжноï конститутивноï синтази оксиду азоту визначена на 89% меншою поpiвняно з контрольною групою доноpiв (таблиця). Водночас, iнтeнсивнiсть iндуцибeльного синтезу оксиду азоту значно зростае. Актившсть кaльцiй-нeзaлeжноï синтази оксиду азоту збшьшувалась у 2,0 рази поpiвняно з контрольною групою.
Таблиця
Показники системи синтезу оксиду азоту i процепв штрозилювання в еритроцитах хворих на еритремто (вiдсоткова доля вщносно показника контрольно! групи ); М ± т
Показники Обстеженi групи
Контрольна група Хворi на еритремiю
cN0S 100± 15,0 10,9 ± 0,4**
iN0S 100 ± 16,4 200,1 ± 33,0**
Аргiназа 100 ± 8,0 285,0 ± 33,0**
Arg/N0S 100 ± 17,0 384,0 ± 39,0**
N0- 100 ± 18,0 112,0 ± 16,0
N0- 100 ± 16,0 78,0 ± 10,0
НМНТ 100 ± 11,3 70,5 ± 9,0
ВМНТ 100 ± 13,5 436,0 ± 62,0**
^-*---
Примiтка: - контроль - 100%;
- вiрогiднiсть вщмши показника вiдносно контрольно! групи (р < 0,05).
Доля фiзiологiчного конститутивного синтезу оксиду азоту в еритроцитах практично здорових людей складала, в середньому, 66% вiд сумарного синтезу оксиду азоту, тодi як у хворих на еритремда спостерталося виражене зниження даного показника - до 9,3% вщ показника контрольно! групи.
Оскшьки субстратом для КО-синтаз е L-аргiнiн було важливим дати ощнку неокисного метаболiзму цiе! амшокислоти, здатно! перетворюватися ферментом аргiназою до сечовини та орштину. Було встановлено, що активнiсть аргiнази в еритроцитах хворих на еритремда достовiрно зростае: у 2,9 разу порiвняно з контрольною групою, що свiдчить про активiзацiю неокисного, аргiназного метаболiзму, який конкуруе з окисним КО-синтазним метаболiзмом L-аргiнiну. Спiввiдношення неокисного та окисного метаболiзму L-аргiнiну (Arg/NOS) достовiрно зростало в еритроцитах хворих: у 3,8 разу порiвняно з контрольною групою.
Вивчення пулiв стабшьних метаболiтiв оксиду азоту (штрит- i нiтрат-анiонiв) показало, що !х вмiст зазнае незначш змiни, якi простежуються на рiвнi тенденцi! для N02-. Вмiст N03- в еритроцитах хворих достовiрно збшьшувався на 22,0 %
пор!вняно з контрольною групою. Це може свщчити або про гальмування процешв окиснення N0 (на тлi достатньо високо! активностi iндуцибельно! синтази оксиду азоту), або про бшьш активне використання N0 в шших реакцiях метаболiзму оксиду азоту, зокрема, в реакщях утворення нiтрозотiолiв.
Вивчення вмюту в еритроцитах низькомолекулярних i високомолекулярних продyктiв штрозилювання показало, що у хворих на еритремда спостер^аеться суттеве зростання рiвня високомолекулярних нiтрозотiолiв (ВМНТ): у 4,36 разу порiвняно з контрольною групою (таблиця). Вмiст низькомолекулярних нiтрозотiолiв (НМНТ) був на 30,0 % менше.
Осюльки головним представником низькомолекулярних нiтрозотiолiв е нiтрозоглyтатiон [4], можна допустити можливють вивiльнення глyтатiонy з процешв нiтрозилювання для бiльш активного його використання еритроцитами за умов патологи у вщновлювальних реакцiях.
Разом iз тим, досить виражене збiльшення вмюту в еритроцитах хворих високомолекулярних нiтрозотiолiв свщчить про активний перебiг процешв, що ведуть до утворення рiзних продyктiв хiмiчноï модифiкацiï протеïнiв, головним чином, гемоглобшу. Нiтрозилювання гемоглобiнy можна було б оцшювати як один з механiзмiв регyляцiï його спорщненосп до кисню, утворення оксигенованоï форми (за умов штрозилювання по залiзy гемово1' групи).
Отже, одержанi даш свiдчать про те, що за еритремп в еритроцитах вiдбyваються метаболiчнi перебудови, якi пов'язанi з системою синтезу оксиду азоту i ведуть до переваги штенсивносп неокисного, арпназного метаболiзмy над штенсивнютю окисного, NO-синтазного метаболiзмy L-аргiнiнy. Змiни у систем синтезу оксиду азоту разом iз вiдповiдними особливостями в yтвореннi низькомолекулярних i високомолекулярних продукпв нiтрозилювання можуть мати певне значення, впливаючи на генерування в еритроцитах хворих активних форм азоту, на рiвень вщновлювальних еквiвалентiв у формi глyтатiонy, а також, що цшком iмовiрно, на функцюнальний стан окремих протеïнiв, зокрема, гемоглобiнy.
ВИСНОВКИ
1. В еритроцитах хворих на еритремда вщбуваються змши у œ^^i синтезу оксиду азоту, що ведуть до переваги неокисного, арпназного метаболiзмy над окисним, NO-синтазним метаболiзмом L-аргiнiнy, а також до обмеження накопичення NO-анiонiв.
2. За еритремп в еритроцитах змшюеться сшввщношення низькомолекулярних i високомолекулярних продyктiв штрозилювання: суттево збiльшyеться вмiст високомолекулярних нiтрозотiолiв, що може вплинути на структурно-фyнкцiональний стан еритроцитарних протеïнiв.
3. Змши у систем синтезу оксиду азоту, яю простежуються в еритроцитах хворих на еритремда, можуть мати певне компенсаторне значення, впливаючи на генерування активних форм азоту i шдтримку рiвня вiдновлювальних еквiвалентiв у формi глyтатiонy.
Список лiтератури
1. Дубинина Е.Е. Окислительная модификация протеинов, ее роль при патологических состояниях / Е.Е. Дубинина, А.В. Пустыгина // Укр. бюх1м. журн. - 2008. - Т. 80, № 6. - С. 5-18.
2. Меньщиков Е.Б. Окислительный стресс при воспалении / Е.Б. Меньщиков, Н.К. Зенков // Усп. совр. биол. - 1997. - Т. 117, № 2. - С. 155-169.
3. Меньщиков Е.Б. Окислительный стресс: патологические состояния и заболевания / Е.Б. Меньщиков, Н.К. Зенков, В.З. Ланкин // Новосибирск: АРТА, 2008. - 284 с.
4. Сагач В.Ф. Пригшчення оксидативного та штрозативного стресу як мехашзм кардю- i вазо протекторно! дй екдистерону за умов експериментального цукрового дiабету I типу / В.Ф. Сагач, Ю.П. Коркач, А.В. Коцюруба, О.Д. Присяжна // Фiзiол. журн. - 2008. - Т. 54, № 5. - С. 46-54.
5. Акопова О.В. Оксид азоту пригшчуе вщкриття мiтохондрiальноi пори i збшьшуе кальцieву eмнiсть м^охондрш in vivo / О.В. Акопова, А.В. Коцюруба, Ю.П. Ткаченко, В.Ф. Сагач // Фiзiол. журн. -2005. - Т. 51, № 3. - С. 3-11.
6. Ping P. Isoform-selective activation of protein kinase C by nitric oxide in the heart of conscious rabbits: a signaling mechanism for both nitric-oxide-induced and ischemia-induced preconditioning / P. Ping, H. Takano, J. Zhang et al // Circulat. Res. - 1999. - V. 84. - P. 587-604.
7. Li J. Nitric oxide suppresses apoptosis via interrupting caspase activation and mitochondrial dysfunction in cultured hepatocytes / J. Li, C.A. Bombeck, S. Yang, Y.M. Kim, T.R. Billiar // J. Biol. Chem. - 1999.
- V. 274. - P. 17325-17333.
8. Ёлкина Н.М. Энзиматическая активность эритроцитов человека при ишемической болезни сердца в условиях развития окислительного стресса / Н.М. Ёлкина, С.В. Коношенко, И. Шашуа // Ученые записки Таврического национального университета им. В.И. Вернадского. - Серия: Биология, химия. - 2011. - Т. 24 (63), № 2. - С. 124-128.
9. Новицкий В.В. Белковый спектр мембран эритроцитов у больных раком легкого и с опухолями головы и шеи / В.В. Новицкий, В.Е. Гольберг, М.В. Колосова и др. // Бюл. эксперим. биол. и медиц. - 1999. - Прил. 1. - С. 18-20.
10. Drabkin D. A simplified technique for large scale crystallization myoglobin and haemoglobin in the crystalline / D. Drabkin // Arch. biochem. - 1949. - V. 21. - P. 224-226.
11. Шугалей В.С. Содержание мочевины и активность аргиназы в органах крыс при акклиматизации к холоду / В.С. Шугалей, А.С. Козина // Физиол. журн. СССР. - 1977, № 8. - С. 1199-1202.
12. Chin S.Y. Increased activity and expression of Ca2+ - depended NOS in renal cortex of ANG Il-infused hypertensive rats / S.Y. Chin, K.N. Pandey, S.J. Shi et al // Amer. J. Physiol. - 1999. - V. 277, N 5. -P. 797-804.
13. Green L.L. Analysis of nitrate, nitrite and [N+5]-nitrate in biological fluids / L.L. Green, D.A. Wagner, J. Glogowski et al // Anal. Biochem. - 1982. - V. 126, N 1. - P. 131-138.
14. Gerdal D. Inhibition of the catalitic activity of alkoholdegydrogenase by NO is associated with S-nitrosylation and the release of zinc / D. Gerdel, A.J. Cederbaum // Biochemistry. - 1996. - V. 35, N 50.
- P. 16186-16194.
15. Villa Bianca R. Sphingosine 1-phosphate induced endothelial nitric-oxide synthase activation through phosphorylation in human corpus cavernosum / R. Bianca Villa, R. Sorrentino, C. Imbimbo et al // J. Pharmacol. Exp. Therap. - 2006. - V. 316, N 2. - P. 703-708.
Ёлкина Н.М. Показатели метаболизма оксида азота в эритроцитах больных эритремией / Н.М. Ёлкина, С.В. Коношенко // Ученые записки Таврического национального университета им. В.И. Вернадского. Серия «Биология, химия». - 2014 - Т. 27 (66), № 1. - С.64-70. Показано, что в эритроцитах больных эритремией наблюдаются изменения в системе синтеза оксида азота, которые ведут к преобладанию неокислительного, аргиназного метаболизма над окислительным, N0-синтазным метаболизмом L-аргинина и к ограничению накопления N0-анионов. Вместе с этим, прослеживается увеличение содержания в эритроцитах высокомолекулярных продуктов нитрозилирования, что может влиять на структурно-функциональное состояние эритроцитарных протеинов.
Ключевые слова: эритроциты, система синтеза оксида азота, аргиназа, N0-синтазы, N0-анионы, низкомолекулярные и высокомолекулярные продукты нитрозилирования, эритремия.
INDEXES OF NITRIC OXIDE METABOLISM IN ERYTHROCYTES OF PATIENTS WITH ERYTHRAEMIA
Yolkina N.M.1, Konoshenko S.V.2
1Crimea faculty of Zaporogie National University, Simferopol, Ukraine
2TavridaNational V.I. Vernadsky University, Simferopol, Crimea, Ukraine
E-mail: [email protected]
Elucidation of the molecular basis of various diseases and pathological states of human organism is one of the most significant problems of medicine and biology [1-3]. It is known, that the ways of production of free radicals of oxygen and nitric oxide are closely binded [4]. The synthesis of nitric oxide over standard level may causes nitrosative stress, that is binded with active forms of nitric oxide, for example, peroxinitrite and nitric dioxide [4]. The formation of nitrosothiols is one of the markers of nitrosative stress also [4, 5]. Given that in some diseases erythrocytes are involved in pathological process [6, 7], the aim the present work was to study the indexes of the system of nitric oxide synthesis and nitrosylation in erythrocytes under erythraemia. The materials for the study were the erythrocytes of healthy subjects (control group) and patients with erythraemia. The erythrocytes were hemolisated by distilled water. In hemolisates of erythrocytes was determined the content of NO-anions (NO- and NO3-) [8], low-molecular and high-
molecular products of nitrosylation [9] and the activity of arginase [10], cNOS and iNOS [11]. It has been shown, that in erythrocytes of patients with erythraemia the system of nitric oxide synthesis is changed. The metabolism of L-arginine by arginase prevailes over oxidative metabolism with NO synthesis (was 284% higher when compared to control group). The activity of Ca2+-dependent NO-synthase was 89% less when compared to control group. The activity of Ca2+-independent nitric oxide synthase was rised (100% higher when compared to control group). The activity of arginase was rised also (290% higher when compared to control group). The accumulation of NO-anions in erythrocytes of patients was limited. The level of low-molecular products of nitrosylation was 30 % less when compared to control group. It is known that nitrosoglutatione is one of the main low-molecular products of nitrosylation [4]. The lowring of the content of low-molecular products in erythrocytes of patients with erythraemia may be as index of releasing of glutatione from processes of nitrosylation for it more active utilization in reductative reactions. At the same time, the content of high-molecular products of nitrosylation was rised (336% higher when compared to control group). So far as the high-molecular products of nitrosylation are, in the main, nitrosylated proteins [4], these changes in erythrocytes of patients with erythraemia may have certain influence on structural-functional state of erythrocyte proteins; in particular, of haemoglobin. The changes that are observed in the system of nitric oxide synthesis in erythrocytes may have influence on generation of nitric active forms and level of reductated glutatione also. Thus, under erythraemia the metabolic changes are realized in erythrocytes, the development of nitrosative stress is accompanied by realization of some compensative reactions. Keywords: erythrocytes, system of nitric oxide synthesis, arginase, NO-synthases, NO-anions, low-molecular and high-molecular products of nitrosylation, erythraemia.
References
1. Dubinina E.E., Pustigina A.V., Oxidative modification of proteins, it importance in pathological states, Ukr. biochem. J., 80, 6, 5 (2008).
2. Menshikov E.B., Zenkov N.K., Oxidative stress under inflammation, Impr. mod. biol., 117, 2, 155 (1997).
3. Menshikov E.B., Zenkov N.K., Lankin V.Z., Oxidative stress: pathological states and diseases, 284 p. (ARTA, Novosibirsk, 2008).
4. Sagach V.F., Korkach U.P., Kotsuruba A.V., Prysyazhna O.D., The inhibition of oxidative stresses by ecdysterone as the mechanism of the cardio- and vasoprotective action at type I diabetes, Physiol. J., 54, 5, 46 (2008).
5. Akopova O.V., Kotsuruba A.V., Tkachenko U.P., Sagach V.F., Nitric oxide suppresses permeability, transition pore opening and enhances calcium uptake in mitochondria in vivo, Physiol. J., 51, 3, 3 (2005).
6. Yolkina N.M., Konoshenko S.V., Shashua I., Enzym activity of human erythrocytes under ischemic heart desease, Scientific Notes Taurida National V.I. Vernadsky University, 24 (63), 2, 124 (2011).
7. Novitski V.V., Goldberg V.E., Kolosova M.V., Protein spector of erythrocyte membranes of patients with lung cancer and tumours of head and neck, Bul. experim. biol. and med., suppl. 1, 18 (1999).
8. Green L.L., Wagner D.A., Glogowski J., Analysis of nitrate, nitrite and [N^j-nitrate in biological fluids, Anal. Biochem., 126, 1, 131 (1982).
9. Gerdal D., Cederbaum A.J., Inhibition of the catalitic activity of alkoholdegydrogenase by NO is associated with S-nitrosylation and the release of zinc, Biochemistry, 35, 50, 16186 (1996).
10. Shugaley V.S., Kozina A.S., Content of urea and arginase activity in rats organs under acclimatization for cold, USSR Physiol. J., 8, 1199 (1977).
11. Chin S.Y., Pandey K.N., Shi S.J., Increased activity and expression of Ca2+ - depended NOS in renal cortex of ANG II-infused hypertensive rats, Amer. J. Physiol., 277, 5, 797 (1999).
nocmynurn e peda^uw 16.01.2014 г.
