Протон-чувствительные ионные каналы новая мишень для терапии боли Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

1542

© Л.Б. ПИОТРОВСКИЙ, М.А. ДУМПИС, С.В. КУЛИКОВ, Е.В. ЛИТАСОВА; 2007

ГУ НИИ экспериментальной медицины РАМН НЕЙРОФАРМАКОЛОГИЯ акад. Павлова ул., 12, Санкт-Петербург, 197376, Россия

Резюме

Протон-чувствительные ионные каналы (ASICs) представляют собой мишень для дизайна новой группы анальгетиков. Рассмотрены свойства этих каналов и возможные пути модуляции их функций.

На основе построенной трехмерной модели фармакофора пептид-связывающего сайта синтезирован ряд веществ, оказывающих модулирующее действие на эти каналы in vitro и проявляющих анальгетическую активность in vivo.

Пиотровский Л.Б., Думпис М.А., Куликов С.В., Литасова Е.В. Протон-чувствительные ионные каналы — новая мишень для терапии боли // Психофармакол. биол. наркол. — 2007. — Т. 7,

№ 2. — С. 1542-1547.

^КпЮЧе1БЫе-1СЛОБ^^

протон-чувствительные ионные каналы; ASICs; модуляторы; анальгетики; анальгетическое действие

ПРОТОН-ЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ ИОННЫЕ КАНАЛЫ — НОВАЯ МИШЕНЬ ДЛЯ ТЕРАПИИ БОЛИ

ВВЕДЕНИЕ

Человечеству давно известно, что действие кислоты вызывает боль. Однако из-за того, что ацидоз тканей возникает при различных физиологических и патофизиологических состояниях, включающих артриты, ишемию, воспаление и т.п., и именно он является причиной возникновения ощущения боли, этот факт имеет и клиническое значение [8, 9, 17, 19, 20].

В 1980 г. на нейронах сенсорных ганглиев крыс было показано, что в ответ на быстрое смещение pH внеклеточного раствора в сторону кислых значений возникает входящий натриевый ток, порог возникновения которого близок к рН 7,0, а насыщение происходит при рН 5,4 [13, 14]. В настоящее время уже достоверно установлено, что изменения кислотно-щелочного равновесия в тканях регулируется особым типом каналов — протон-чувствительными ионными каналами (ASICs — Acid-Sensing Ionic Channels) [15, 21]. Подсемейство про-тон-чувствительных ионных каналов ASICs принадлежит к семейству натриевых каналов/дегенеринов (NaC/DEG), не чувствительных к действию тетродотоксина, но избирательно блокирующихся амило-ридом [16]. Физиологическая роль ASICs пока еще мало изучена. Однако широкое распространение ASICs в нейронах как периферической, так и центральной нервной системы подразумевает большой спектр функций протон-чувствительных ионных каналов. Они вовлекаются во многие физиологические и патофизиологические процессы: такие, как ишемия мозга, болевая чувствительность при ишемии и воспалении, вкусовая чувствительность [16], участвуют в синаптической передаче [11], механорецепции [3] и пр. Уже в начале исследования рН-активируемой проводимости было высказано предположение, что «рецепторы протонов» могут иметь отношении к ноцицепции [12], и на сегодня можно считать твердо установленным, что протон-чувствительные ионные каналы принимают активное участие в формировании и передаче болевого стимула [10]. Именно поэтому эти каналы были выбраны нами в качестве биологической мишени при поиске новых веществ анальгетического действия.

Хотя в самом начале исследований по отношению к этим каналам употреблялся термин «рецепторы для протонов», следует отметить, что сам по себе факт существования в организме рецепторной структуры, комплементарной такой простой и симметрично устроенной частице как протон (Н +) не только маловероятен, но и невозможен.

Ведь даже при физиологических значениях рН концентрация свободных протонов в среде достаточно высока.

Существенным отличием ASICs от других рецепторных структур в организме является то, что изменение свойств этого комплекса, открытие канала, происходит не вследствие связывания лиганда с комплементарным ему местом связывания, а вследствие изменения физико-химических характеристик среды. Роль протона сводится лишь к тому, что его присоединение превращает нейтральные боковые цепи некоторых аминокислот в заряженную форму, что вызывает изменение конформации всей белковой молекулы (и других молекул, составляющих канал) и приводит к открытию ионного канал. Открытие ASICs происходит, как указывалось выше, при изменении величины рН от 7,2 до 5,4. Поэтому, учитывая величины рКа боковых цепей аминокислот, можно утверждать, что ведущую роль в этом процессе играет протонирование имидазольных циклов гистидина. По литературным данным, в субъединицах ASICs содержится 14 остатков этой аминокислоты, причем эти остатки находятся как в трансмембранных, так и во внемембранных доменах [5, 18].

К счастью, регулировать функции этих каналов, менять количество протекающего через них тока, возможно воздействием на пептидный модуляторный сайт. Известны пептидные соединения, способные модулировать функции ASICs. Одним из них является пептид FMRFa (Phe-Met-Arg-Phe-NH2), который, в частности, вызывает быстрый деполяризующий ответ нейронов беспозвоночных [6, 7]. Известно, что эффекты, сходные с эффектами FMRFa, вызывают и некоторые другие пептиды, содержащие концевую группировку Arg-Phe-NH2 (RFa-подобные), воздействуя, в том числе, и на центральные и на периферические мишени, включая те, которые модулируют болевые процессы в ЦНС млекопитающих [10]. Группой исследователей было выдвинуто предположение, что RFa-подобные пептиды связываются с ло-кусом канала в закрытом состоянии при нейтральных рН и оказываются «пойманными в ловушку» при последующем открытии канала при снижении значения внеклеточного рН [4]. В нашем случае важно также и то, что подкожно введенные RFa-подобные пептиды вызывают боль, проявляя тем самым ал-гогенные свойства [23]. Все эти данные позволили предположить, что вещества, способные модулировать действие ASICs, причем проявляющие действие, обратное действию RFa-подобных пептидов, будут обладать анальгетическим действием.

Анализ литературных данных по структуре и активности различных пептидных лигандов ASICs по-

казал, что ключевым фрагментом структуры молекул лигандов, определяющим активность, является плоская положительно заряженная (рКа = 12,5) гуанидиновая группа аргинина. На С- и N-концах пептида обязательно должны быть липофильные аминокислоты типа фенилаланина или триптофана. Для проявления активности необходима амидная группа на С-конце пептида, любая другая группа, а более всего карбоксильная, приводит к снижению активности. Появление отрицательно заряженной группы в любой другой части молекулы также приводит к резкому снижению активности. Кроме того, во втором положении тетрапептида желательно наличие неразветвленной аминокислоты.

С помощью программы HyperChem6 мы провели теоретический конформационный анализ некоторых тетрапептидов — агонистов модулирующего сайта ASICs. Результаты расчетов показали, что для всех пептидов наиболее энергетически выгодная конформация по энергии отличается от следующей более чем, на 0,5 ккал/моль, поэтому эти конформации можно считать, в первом приближении, биологически активными. В этих конформациях исследуемых пептидов оба остатка фенилаланина (в первом и четвертом положении) и остаток аминокислоты во втором положении образуют липофильное облако, из которого выступает положительно заряженная гуанидиновая группа аргинина, которая (как было сказано выше) является необходимой для проявления фармакологической активности [2].

Данные по структурному и конформационному анализу позволили построить общую модель строения лигандов протон-чувствительных ионных каналов, которая может быть схематически представлена следующим образом: положительно заряженная гуанидиновая группа аргинина, выступающая из ли-пофильного облака, образованного липофильными заместителями (рис. 1).

На основании предложенной модели было синтезировано два ряда новых соединений: соединения I ряда — ^О-дизамещенные производные аргинина, в которых варьировалась липофильность заместителей при атомах азота амидной и аминогрупп, и соединения II ряда — арилгуанидины, содержащие в ю-положении различные арильные заместители, присоединенные к алкильной цепи через амидную или аминогруппу.

Проверка действия этих соединений на изолированных нейронах спинальных заднекорешковых и тригеминальных ганглий крыс показала, что большинство из них действуют на ASICs (рис. 2).

В ряду производных аргинина все незамещенные амиды (R = H) практически не оказывали влияния на

1543

1544

I ряд

II ряд

R'—CH CO R (CH2)3 NH

C

HN

NH2

R"

i

X

(CH2)r

NH

C

R = H, Ph, CH2Ph, 2-нафтил;

R' = PhCO, PhCH2CO, Ph(CH2)2CO, PhCO(CH2)2CO, PhCONH(CH2)2CO, PhCH2OCONH(CH2)2CO, PhCH2OCONH(CH2)2CO, H2CH(Ph)CH2CO,

2 2Ph

X = NH, NHCO; n = 3, 5;

R" = o-, M-, n- N02Ph; o-, m-, n- NH2Ph; 2-нафтил

HN

NH2

Pue. 1

Схематическая модель строения молекул лигандов ASICs

Влияние соединений I ряда (50 мкМ) на изменение амплитуды амилорид-чувствительного протон-акти-вируемого тока

протон-активируемые токи, что свидетельствует, в первую очередь, о важной роли липофильности молекулы. В рядах соединений, содержащих одинаковый заместитель при атоме азота аминогруппы аргинина, увеличение липофильности заместителя при амидном атоме азота приводит к снижению пиковой амплитуды тока, т.е. усилению антагонистического действия. Подобное же влияние оказывает увеличение липофильности заместителя в амидной части молекулы. Однако резкое увеличение объема заместителя (как в амино-, так и амидной группах), несмотря на несомненное повышение липофильности молекулы, также приводит к некоторому снижению активности, по-видимому, за счет стерических препятствий взаимодей-

ствию с ионным каналом [1]. Причина этого может заключаться в том, что, по данным работы [22], про-тон-чувствительные ионные каналы имеют два трансмембранных домена и длинную внеклеточную петлю, форма и размер которой, по-видимому, и являются факторами, лимитирующим объем и степень липо-фильности подходящего к рецептору лиганда.

В отличие от агониста ASICs тетрапептида FMRFa, который увеличивает амплитуду входящего натриевого амилорид-чувствительного тока и является алгогеником, большинство синтезированных нами соединений снижают амплитуду этого тока. Это позволило предположить, что in vivo они будут проявлять анальгетические свойства.

100-

Œ

-&

-&

m

80-

60-

40-

20-

2065 2039 2037 2036 2061 2047 2066 2068 2067

ИЭМ

0

1545

Рис. 3

Анальгетическая активность соединений I ряда (100 мг/кг, мыши, контроль — физ. раствор); * — р < 0,01, ** — р < 0,001, # — р < 0,0001, ЛЫОУЛ

90

80'

70'

60

50'

40

30

20'

10

I

# # X X

X

i

-&

0

1

ф

«

LD

N

О

(М

Г— CD 00 О

I— I— I— о

О О О 'T-

СМ СМ СМ <м

en cocM^T-CMcol''

00 CD Г— CD Г— СО 00 СО

О ООООООО

СМ СМ СМ СМ СМ СМ СМ СМ

Ю 1- cd

ю о оо

От- о

см см см

СП

00

о

см

3

4

2

1

#

#

Рис. 4

Анальгетическая активность соединений II ряда (100 мг/кг, мыши, контроль — физ. раствор); [1 — (СН2)3; 2 - (СН2)5; 3 — (-СН2-ЫН-); 4 — Ш2-Я]; * р < 0,01, ** р < 0,001, # — р < 0,0001, ЛЫОУЛ

Действительно, скрининговая проверка соединений обоих рядов на модели болевой чувствительности «корчи» показала, что большинство синтезированных соединений проявляют анальгетический эффект (рис. 3 и 4).

Помимо арилгуанидинов — соединений II ряда — была определена анальгетическая активность и двух соединений, содержащих на конце молекулы свободную аминогруппу (ИЭМ-2086 и ИЭМ-2088), т.е.

представляющих собой негуанидированные производные нафтиламина с 3- и 5- метиленовыми группами в алкильной цепи, соответственно. Для этих соединений наблюдалось, помимо анальгетического, и седативное действие. Вероятно, это объясняется тем, что эти амины, в отличие от положительно заряженных гуанидиновых производных, проникают через ГЭБ и оказывают центральное действие. Этот факт еще раз указывает на то, что наличие в молекуле гуанидино-

1546

Рис. 5

Среднеэффективная доза некоторых из синтезированных соединений и среднеэффективные дозы препаратов сравнения анальгина и парацетамола

вой группы обязательно для получения веществ периферического действия.

Таким образом, проведенный нами анализ структурных требований к RFa-подобным пептидам и рациональный подход к дизайну новых соединений позволил в результате работы получить два ряда новых соединений непептидной природы, обладающих выраженной анальгетической активностью.

Для девяти из исследованных веществ, а именно для ИЭМ-2036, ИЭМ-2047, ИЭМ-2055, ИЭМ-2061, ИЭМ-2063, ИЭМ-2075, ИЭМ-2079, ИЭМ-2080, ИЭМ-2101, среднеэффективная доза (ED50) ниже, чем у анальгина и парацетамола (рис. 5).

Более детальное изучение этих соединений и дальнейшая оптимизация их структур позволит создать новые анальгетические препараты, механизм действия которых будет отличаться от механизмов действия применяемых в настоящее время известных анальгетиков и будет связан с регуляцией функционирования ASICs.

ЛИТЕРАТУРА

1. Литасова Е.В., Думпис М.А., С.В.Куликов, Пиотровский Л.Б., Паткина Н.А. Изучение анальгетического действия замещенных амидов N-ацилированного аргинина на модели «корчи» (writing test) у мышей // Бюл. Волгоградского научн. центра РАМН. —2005. — Вып. 3-4. — С. 3-7.

2. Литасова Е.В., Думпис М.А., Куликов С.В., Пиотровский Л.Б., Крышталь О.А. Поиск непептидных блока-торов протон-чувствительных ионных каналов // Вестн. ВолГМУ. — 2005. — Т. 4(16). — С. 19-22.

3. Adams C.M., Anderson M.G., Motto D.G., Price M.P.,

Johnson W.A., Welsh M.J. Ripped pocket and pickpocket, novel Drosophila DEG/ENaC subunits expressed in early development and mechanosensory neurons // J. Cell Biol. — 1998. — Vol. 140. — P. 143-152.

4. Askwith C.C., Cheng C., Ikuma M., Benson C., Price M., Welsh M. Neuropeptide FF and FMRFamide potentiate aside-evoked currents from sensory neurons and proton-gated DEG/EnaC channels // Neuron. — 2000. — Vol. 26. — P. 133-141.

5. Coric T., Zhang P., Todorovic N., Canessa C.M. The extracellular domain determines the kinetics of desensitization in acid-sensitive ion channel 1 // J. Biol. Chem. — 2004. — Vol. 278, N 46. — P. 45240-45247.

6. Cottrell G., Davies N. Multiple receptor sites for a molluscan peptide (FMRF amide) and related peptides of Helix // J. Physiol. — 1987. — Vol. 382. — P. 51-68.

7. Cottrell G.A., Green K.A., Davies N.W. The neuropeptide Phe-Met-Arg-Phe-NH2 (FMRFamide) can activate a ligand-gated ion channel in Helix neurons // Pflugers Arch. — 1990. — Vol. 416, N 5. — P. 612-614.

8. Garber K. Why it hurts: researchers seek mechanisms of cancer pain // J. Nat. Cancer Inst. — 2003. — Vol. 95. — P. 770-772.

9. Issberner U, Reeh P.W, Steen K.H. Pain due to tissue acidosis: a mechanism for inflammatory and ischemic myalgia? // Neurosci. Lett. — 1996. — Vol. 208. — P. 191-194.

10. Krishtal O. The ASICs: signaling molecules? Modulators? // Trends Neurosci. — 2003. — Vol. 26. — P. 477-483.

11. Krishtal O., Osipchuk Y., Shelest T., Smirnoff S. Rapid extracellular pH transients related to synaptic transmission in rat hippocampal slices // Brain Res. — 1987. — Vol. 436, N 2. — P. 352-356.

12. Krishtal O.A., Pidoplichko V.I. A receptor for protons in the membrane of sensory neurons may participate in nociception // Neurosci. — 1981. — Vol. 6. — P. 2599-2601.

13. Krishtal O.A., Pidoplichko V.I. A receptor for protons in the nerve cell membrane // Neurosci. — 1980. — Vol. 5. — P. 2325-2327.

14. Krishtal O.A., Pidoplichko V.I. Receptor for protons in the membrane of sensory neurons // Brain Res. — 1981. — Vol. 214. — P. 150-154.

15. Lilley S., LeTissier P., Robbins J. The discovery and characterization of a proton-gated sodium current in rat retinal ganglion cells // J. Neurosci. — 2004. — Vol. 24. — P. 1013-1022.

16. Lingueglia E., Deval E., Lazdunski M. FMRFami-de-gated sodium channel and ASIC channels: A new class of ionotropic receptors for FMRFamide and related peptides // Peptides. — 2006. — Vol. 27. — P. 1138-1152.

17. Pan H.L., Longhurst J.C., Eisenach J.C., Chen S.R. Role of protons in activation of cardiac sympathetic C-fibre afferents during ischaemia in cats // J. Physiol (Lond). — 1999. — Vol. 518. — P. 857-866.

18. Saugstad J.A., Roberts J.A., Dong J., Zeitouni S.,

Evans R.J. Analysis of the membrane topology of the acid-sensing ion channel 2a // J. Biol. Chem. — 2004. — Vol. 279, N 53. — P. 55514-55519.

19. Stubbs M., McSheehy P.M., Griffiths J.R., Bash-ford C.L. Causes and consequences of tumour acidity and implications for treatment // Mol. Med. Today. — 2000. — Vol. 6. — P. 15-19.

20. Sutherland S.P., Benson C.J., Adelman J.P., McCleskey E.W. Acidsensing ion channel 3 matches the acid-gated current in cardiac ischemiasensing neurons // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001. — Vol. 98. — P. 711-716.

21. Waldmann R., Lazdunski M. H(+)-gated cation channels: neuronal acid sensors in the NaC/DEG family of ion channels // Curr. Opin. Neurobiol. — 1998. — Vol. 8. — P. 418-424.

22. Waldmann R., Champigny G., Bassilana F., Heurteaux C., Lazdunski M // Nature. — 1997. — Vol. 386, N 6621. — P. 173-177.

23. Yudin Y., Tamarova Z., Ostrovskaya O., Moroz L., Krishtal O. RFa-related peptides are algogenic: evidence in vivo and in vitro // Eur. J. Neurosci. — 2004. — Vol. 20. — P. 1419-1423.

Piotrovsky L.B., Dumpis M.A., Kulikov S.V., Litasova E.V. Acid-sensing ion channels as a new target for pain treatment // Psychopharmacol. Biol. Narcol. — 2007 — Vol. 7, N 2. — P. 1542-1547.

Institute of Experimental Medicine; 12 acad. Pavlov str., Saint-Petersburg, 197376, Russia.

Summary: Acid-sensing ion channels (ASICs) are targets for design of a new group of analgesics. Their properties and the ways of their modulation are discussed. A series of compounds were synthesized on the basis of 3D model of pharmacophore of peptide-binding site. These compounds can modulate the function of ASICs in vitro and show the analgesic activity in vivo.

Key words: acid-sensitive ion channels; ASICs; modulators; analgesics; analgesic action

электронная копия статьи — http://www.elibrary.ru, © Архив (стоимость коммерческого доступа в режиме full text — 55 руб./год)

1547