CC BY
25
IllillllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllW !111111!1111!111111111111!111111!11!1!11!11111111111||||||/Г1(16)
^J 2006
УДК 615.31:546
ПОИСК НЕПЕПТИДНЫХ БЛОКАТОРОВ ПРОТОН-ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ ИОННЫХ КАНАЛОВ
Е.В. Литасова, М.А. Думпис, С.В. Куликов, Л.Б. Пиотровский, O.A. Крышталь*
Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН, г. Санкт-Петербург *Институт физиологии им.А.А.Богомольца HAH Украины, г. Киев
SEARCH OF NON-PEPTIDE BLOCKERS OF THE PROTON-SENSITIVE ION CHANNELS
E.V. Litasova, M.A. Doumpis, S.V. Kulikov, L.B. Piotrovskii, O.A. Kryshtal
Abstract. The paper publishes the results of a search for non-peptide blockers of proton-sensitive ion channels.
Key words: non-peptide blockers.
Методами теоретического конформаци-онного анализа изучено трехмерное строение пептида FMRFa (Phe-Met-Arg-Phe-амида), ли-ганда протон-чувствительных ионных каналов. На основании этих данных предложена структура соединений, способных ингибировать эти ионные каналы. Синтез ряда дизамещенных производных аргинина и оценка их биологических свойств на изолированных нейронах спи-нальных и тригеминальных ганглиев крыс позволило сделать определенные выводы о связи химической структуры с биологической активностью в этом ряду и высказать предположение о различии механизмов влияния соединений на пиковую амплитуду тока и на десенситизацию.
В сенсорных нейронах млекопитающих как в центральной нервной системе (ЦНС), так и на периферии, широко распространены протон-чувствительные ионные каналы ASICs (Acid-Sensing Ionic Channels), принадлежащие к семейству амилорид-чувствительных натриевых каналов/дегенеринов (NaC/DEG) [7]. Возникающие при активации рецепторов ASICs протон-активируемые токи представляют собой механизм реагирования нервных клеток, в частности (и организма в целом) на слабые изменения кислотности окружающих тканей. Физиологическая роль этих рецепторов до конца еще не ясна, однако предполагается их участие в широком спектре функций: в механорецепции, в восприятии боли, в синаптической пластичности, в процессах обучения и памяти [6].
Группа лигандов протон-чувствительных ионных каналов сравнительно немногочисленна. Наиболее известные среди них - эндогенный тетрапептид беспозвоночных FMRFa (Phe-Met-Arg-Phe-NH2), проявляющий свойства агониста ASIC's, и родственные ему нейропептиды [2, 3, 5]. Эти пептиды неустойчивы при физиологических значениях рН, что значительно затрудняет изучение роли этих каналов в опытах in vivo. Исклю-
чением является амилорид, неспецифический блокатор Na-зэвисимых ионных каналов, основным биологическим эффектом которого, к тому же, является диуретическое действие [4]. Поэтому поиск непептидных лигандов ASIC's является в настоящее время чрезвычайно актуальным как с теоретической, так и практической точек зрения.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Найти непептидные аналоги FMRFa, проявляющие, в отличие от него, ингибирующее влияние на ASIC's и устойчивые в физиологических условиях.
Анализ связи структура-активность в ряду аналогов FMRFa показывает, что все известные в настоящее время лиганды ASIC's содержат в молекуле гуанидиновую группу, замена которой на тетраалкиламмониевую группу приводит к исчезновению активности [10] Второй особенностью лигандов ASIC's является запрет на наличие в молекуле свободной кислотной функции - карбоксильная функция на С-конце пептидных лигандов ASIC's заменена амидной группой. К исчезновению активности приводит также появление свободной карбоксильной группы и в других частях молекулы [3, 9].
Изучение строения молекулы FMRFa методами компьютерного конформационного анализа показало, что одна из наиболее энергетически выгодных конформаций может быть представлена в виде "пальца" (цепочка трех - СН2-групп аргинина) с положительно заряженным "хвостом" (гуанидиновая группа), выступающего из липо-фильного облака, образованного двумя бензиль-ными группами и метилтиоэтильным радикалом (рис. 1).
Поэтому нами был синтезирован ряд дизамещенных производных аргинина общей формулы (I-XIX) и проведена первичная оценка их биологических свойств на изолированных нейронах спинальных и тригеминальных ганглиев крыс (табл. 1).
^6)|||||||||||||||||||||||||||||||||||Ш lillllllllll!lllllll!l!lllll!lllll!ll!ll!lll!llllllll!lll!llllll!ll!ll
WJ2005
*
Рис. 1. Наиболее стабильная конформация пептида РМРЯа (ортогональная проекция, темным отмечена гуанидиновая группа)
Таблица 1
Дизамещенные производные аргинина общей формулы (1-Х1Х)
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Теоретический конформационный анализ был проведен с использованием программ PCModel (поле ММ2) и HyperChem (поле Amber), расчет зарядов по методу Хюккеля.
Синтез производных аргинина проводили по известным методикам исходя из тризащищенно-го аргинина с последовательным введением заместителей в карбоксильную группу и к атому азота аминогруппы аргинина [1].
Биологическое тестирование проводили методом "patch-clamp" в конфигурации "целая клетка" и внутриклеточной перфузии на изолированных нейронах спинальных заднекорешковых и триге-минальных ганглиев крыс линии Вистар возраста 5-10 дней (виварий института физиологии человека им. A.A. Богомольца, Киев). Детальное описание методики приведено в работе [13].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Как уже отмечалось выше, необходимым структурным элементом соединений, способных взаимодействовать с ASIC's, является высокоосновная гуанидиновая группа (рКа 12.5). Можно предположить, что именно она обеспечивает взаимодействие молекулы с отрицательно заряженными аминокислотными остатками внутри ионного канала. Существенной ее особенностью является также и то, что эта группа плоская, ее толщина практически равна диаметру атома углерода. Если при этом вспомнить, что подавляющее большинство известных каналоблокаторов имеют в молекуле объемную тетраалкиламмониевую группу сферической формы, то можно предположить, что структура протон-чувствительного ионного канала существенно отличается от большинства других ионных каналов, во всяком случае, в области связывания лигандов.
R. Waldmann с соавт. [11] была экспрессиро-вана и выделена в клетках COS субъединица про-тон-чувствительного натриевого канала, характерная для сенсорных нейронов. В клетках COS она формирует натриевый канал, который отвечает на снижение внеклеточного рН как быстро инактивирующейся, так и неактивирующейся натриевой компонентой, поэтому общий ток, протекающий через ASICs, зависит от двух параметров -пиковой амплитуды и времени десенситизации. Сам FMRFa увеличивает оба параметра более чем в два раза [8]. Поэтому оценка действия новых соединений проводилась нами по изменениям двух параметров - пиковой амплитуды (l/l0) и времени десенситизации (k/k0) (табл. 2).
Все незамещенные амиды аргинина (R = H, соед. I-V) практически не оказывали влияния на протон-активируемые токи (табл. 2), что свидетельствует, в первую очередь, о важной роли ли-пофильности молекулы. Из сравнения данных по биологической активности и рассчитанного коэффициента распределения октанол/вода (clog Р) видно, что в рядах соединений, содержащих одинаковый заместитель при атоме азота аминогруппы аргинина (R-0, увеличение липофильности заместителя при амидном атоме азота (R) приводит к снижению пиковой амплитуды тока (например, соединения II, VII, XI или IV, VIII, XII или V, IX, XVII).
Интересные изменения активности исследуемых соединений можно наблюдать, варьируя заместитель при атоме азота аминогруппы аргинина (Ri) в рядах различных его амидов. Как уже было отмечено, увеличение заместителя в амид-ной части молекулы, приводящее к общему увеличению липофильности молекулы, приводит к повышению активности. Поэтому неудивительно, что в наших экспериментах незамещенные аци-ламиды аргинина (соединения l-V) слабее всего влияют на протон-активируемые токи. В ряду замещенных анилидов (соединения VII—IX) происходит увеличение длины цепочки в заместителе, но при этом в молекуле появляется карбонильная группа, что снижает липофильность и, одновременно, активность соединений (VII-VIII).
№ R R,
I н PhCO
II н PhCH2CO
III н Ph(CH2)2CO
IV н PhCO(CH2)2CO
V н t-BuOCONHCH2CH(Ph)CH2CO
VI CH2Ph PhCO
VII Ph PhCH2CO
VIII Ph PhCO(CH2)2CO
IX Ph t-BuOCONHCH2CH(Ph)CH2CO
X 2-СюНв PhCO
XI 2-СюНб PhCH2CO
XII 2-СюНв Ph(CH2)2CO
XIII 2-СюНв PhCO(CH2)2CO
XIV 2-СюН8 PhCONH(CH2)2CO
XV 2-СюНв PhCH2OCONH(CH2)2CO
XVI 2-СюНв Ph(CH2)2CONH(CH2)2CO
XVII 2-СюНв t-BuOCONHCH2CH(Ph)CH2CO
XVIII PhCO p-PhN02
XIX PhCO p-PhNH2
11111111111111111111111111111111111111111111111111Н||||Шпв)
2005
Таблица 2
Действие на изолированные нейроны (1/10-пиковая амплитуда, k/ko - время десенситизации) и рассчитанный коэффициент распределения (clog. Р) соединений (I-XIX)
№ ИЭМ R Ri l/l0±SD K/K0±SD CLOG Р
I 2052 -Н PhCO- 94,0±2,2 6.И.* -0,15
II 2050 -Н PhCH2CO- 96,5±6,2 б.и. -0,22
III 2051 -Н PhCH2CH2CO- 93,4±2,1 б.и. 0,18
IV 2054 -Н PhCO(CH2)2CO- 89,4±4,5 б.и. -0,75
V 2060 -Н t-BuOCONHCH2CH(Ph)CH2CO- 99,4±5,8 б.и. 0,37
VI 2066 -CH2-Ph PhCO- 86,3±6,2 б.и. 1,87
VII 2080 Ph- PhCH2CO- 72,2±1,9 б.и. 1,71
VIII 2079 Ph- PhCO(CH2)2CO- 87,1±3,2 1,40±0,10 1,18
IX 2081 Ph- t-BuOCONHCH2CH(Ph)CH2CO- 94,2±0,3 б.и. 2,30
X 2039 2-СюНв- PhCO- 80,3±0,6 1,50+0,18 2,78
XI 2036 2-СюНе- PhCH2CO- 70,0±1,3 б.и. 2,71
XII 2037 2-СюНв- Ph(CH2)2CO- 77,1±0,8 б.и. 3,11
XIII 2047 2-СЮН8- PhCO(CH2)2CO- 65,3±6,1 1,69±0,23 2,18
XIV 2048 2-СюНВ- PhCONH(CH2)2CO- 94,9±7,0 б.и. 1,88
XV 2049 2-СюНв- PhCH2OCONH(CH2)2CO- 70,3+9,5 1,66+0,10 2,37
XVI 2065 2-CIOH8- Ph(CH2)2CONH(CH2)2CO- 69,5±8,3 1,65±0,34 2,21
XVII 2061 2-СЮН8- t-BuOCONHCH2CH(Ph)CH2CO- 80,2±10,2 2,50+0,17 3,30
XVIII 2067 p-PhN02- PhCO- 103,5±11,3 б.и. 1,73
XIX 2068 p-PhNH2- PhCO- 88,6±3,5 б.и. 0,99
FMRFa 224,0±21,8 2,76±1,11
Примечание. *б.и. - без изменений.
Однако резкое увеличение объема заместителя (IX), несмотря на несомненное повышение ли-пофильности молекулы, приводит к некоторому снижению активности, по-видимому, за счет сте-рических препятствий взаимодействию с ионным каналом. Аналогичная картина наблюдается и в ряду замещенных производных нафтиламида аргинина (соединения X—XVII), введение наф-тильной группы приводит к увеличению величины clog Р и пропорциональному усилению активности исследуемых соединений. По данным [12] протон-активируемые ионные каналы имеют два трансмембранных домена и длинную внеклеточную петлю, которая, по-видимому, и является фактором, лимитирующим размер и степень ли-пофильности подходящего к рецептору лиганда.
В ряду изученных нами веществ выраженное влияние на десенситизацию оказал лишь нафти-ламид (3-/77-бутилоксикарбониламино)-2-фенилбу-тирил аргинина (XVII), замедлявший кинетику десенситизации. Все остальные соединения незначительно влияли на десенситизацию (табл. 2).
Рис. 2. Наиболее стабильные конформации соединений XII и XVII (темным отмечена гуанидиновая группа)
При этом мы не наблюдали никакой корреляции clog Р с десенситизацией, в отличие от пиковой амплитуды тока. Можно предположить, что аналогично RFa-подобным пептидам, соединение (XVII) индуцирует недесенситизирующуюся компоненту протон-активируемого тока [3].
Возможно, выраженность блокирующего действия активных соединений на пиковую проводимость протон-чувствительных ионных каналов определяют форма и ориентация липофиль-ного фрагмента молекулы. Сравнение энергетически выгодных конформаций FMRFa с конфор-мациями изученных нами активных и неактивных соединений дает некоторое представление о различии в ориентации липофильного облака по отношению к плоскости, в которой расположены атомы гуанидиновой группы. Так, если молекула FMRFa представляет собой как бы "двухлепест-ковое" облако (рис. 1), то липофильное облако соединений, ингибирующих протон-активируе-мый ток, располагается у активных соединений по одну сторону от этой плоскости (рис. 2).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, среди соединений непептидной природы, представляющих собой достаточно липофильные молекулы, содержащие положительно заряженный гуанидиновый остаток, найдены вещества, ингибирующие проводимость протон-чувствительных ионных каналов нейронов спинальных и тригеминальных ганглиев крыс. Результаты тестирования этих соединений позволяют высказать предположение о различии механизмов влияния соединений на пиковую амплитуду тока и на десенситизацию.
Л"У16) !!!l!lllll!!lll!!llll!!!l!lllllllllll!lllll!ll!ll!ll!llll!!ll ЭЗС^ШИСШэшОШй? llllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll
'—J 2005
ЛИТЕРАТУРА
1. Гершкович A.A., Кибирев B.K. Синтез пептидов. Реагенты и методы. - К.: Наукова думка, 1987. - 264 с.
2. Askwith С.С., Cheng С., Ikuma М„ et al. // Neuron 2000. - Vol. 26, № 1. - P. 133-141.
3. Cottrell G.A. II EXS. - 1993. - Vol. 63 - P.279-285.
4. Cragoe E.J., Woltersdorf Jr O.W., Bickling J.B., et al. II J. Med. Chem. - 1976. - Vol. 10. - P. 66-75.
5. Greenberg M.J., Price D.A. II Prog. Brain Res. -1992. - Vol. 92. - P.25-37.
6. Krishtal O.A. II Trends Neurosci. - 2003 - Vol. 26. -№9-P. 477-483.
7. Krishtal O.A., Pidoplichko V.l. И Neuroscience. -1980.-Vol. 5.-P. 2325.
8. Ostrovskaya O.I., Moroz L.L., Krishtal O.A. II Jornal of Neurochemistry. - 2004. - Vol. 91, № 1. - P. 252-255.
9. Price D.A., Greenberg M.J. II Science. - 1977. -Vol. 197.-№ 4304. - P. 670-671.
10. Raffa R.B. II Peptides. - 1988. - Vol. 9, № 4. -P. 915-922.
11. Waldmann R., Bassilana F., de Weille J., et al. // J. Biol. Chem. - 1997. - Vol. 272, № 34. - P. 20975-20978.
12. Waldmann R., Champigny G., Bassilana F., et al. // Nature. - 1997. - Vol. 386, № 6621. - P. 173-177.
13. Yudin Y.K., Tamarova Z.A., Ostrovskaya O.I., et al. // European Jornal of Neuroscience. - 2004. - Vol. 20. -P.1419-1423.
УДК 577.352.38:615.014.425:615.244.188.221.3
ВЛИЯНИЕ ЦИКВАЛОНА И ДИБУНОЛА НА ГЕМОЛИЗ ЭРИТРОЦИТОВ, ИНДУЦИРОВАННЫЙ ИОНАМИ МЕДИ И ГИДРОПЕРОКСИДОМ
X. Диб, О.В. Островский, В,Г. Зайцев, В.Е. Веровский, А.В. Симонян
Кафедра теоретической и клинической биохимии ВолГМУ
INFLUENCE OF CYCVALOL AND DIBUNOL ON THE ERYTHROCYTE HAEMOLYSIS INDUCED BY COPPER IONS AND HYDROPEROXIDE
Kh. Dib, O.V. Ostrovsky, V.G. Zaitsev, V.E. Verovsky, A.V. Simonyan
Abstract. We compared effects of two phenolic antioxidants, cycvalonum and 2,6-di-tret-butyl-4-methylphenol using the model of haemolysis of erythrocytes induced by copper. It was found that cycvalonum has better protective effect than 2,6-di-tret-butyl-4-mehtylphenol.
Key words: erythrocyte haemolysis.
Исследование резистентности эритроцитар-ных мембран является стандартной диагностической процедурой при разнообразных патологических состояниях, связанных с эндогенной интоксикацией [3]. Было показано, что гемолиз эритроцитов под действием солей меди определяется перекисным повреждением мембран [1, 5]. Поэтому представлялось интересным исследовать влияние двух фенольных антиоксидантов циквалона (2,6-бис[(3-метокси-4-гилроксифенил)-метилен]-циклогексанон) и дибунола (2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенол) (ВИТ) на гемолиз эритроцитов в присутствии ионов меди.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Изучить влияние циквалона и дибунола на гемолиз эритроцитов, индуцированный ионами меди.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Опыты выполнены на 36 белых нелинейных крысах самцах. Их декапитировали под эфирным наркозом, эритроциты отмывали физиологическим раствором.
В моделях in vitro гемолиз проводили хлоридом меди (конечная концентрация 200 мкМ) в присутствии и отсутствии пероксида водорода (конечная концентрация 5 мМ). Суспензию инкубировали на шейкере-термостате при постоянном перемешивании в течение 2 часов при температуре 37 °С.
Фенольные антиоксиданты, растворимые в этаноле, добавляли в опытные пробы в разных
концентрациях. А в контрольную пробу добавляли этанол в таком же объеме. Для определения степени гемолиза измеряли концентрацию гемоглобина, вышедшего в инкубационную среду при разрушении клеток, прямым спектрофотометрическим методом. Конечный гематокрит в образцах составлял 1 %, при полном гемолизе образца поглощение пробы было в диапазоне величин 1,5-2,0 o.e.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Нами было доказано, что инкубация образца в отсутствии индукторов вызывала гемолиз 6-14 % эритроцитов.
Динамика процесса гемолиза эритроцитов в присутствии 200 мкМ ионов Си2+ приведена на рис. 1. Процесс характеризовался длительным (не менее 1 ч) латентным периодом. Достоверные отличия, по сравнению с динамикой гемолиза без инициаторов, отмечались только к 60-й мин, а затем следовала резкая активация процесса. К концу 2-го ч гемолизировалось около 50 % эритроцитов.
Сочетанное применение Си2+ (200 мкМ) и перекиси водорода (5 мМ) изменяло характер динамики процесса: латентный период уменьшался, а количество поврежденных клеток увеличивалось. Так, достоверное увеличение концентрации гемоглобина в надосадочной жидкости наблюдалось уже к 30-й мин, а затем скорость гемолиза увеличивалась.
