CC BY
13
5. Зыкова, С. С. Перспективы применения селенорганиче-ских минеральных добавок для собак / С. С. Зыкова, И. В. Кра-силова // Успехи современного естествознания. - 2014. - № 8. -С.59-61.
6. Зыкова, С.С. Фармако-токсикологические свойства ан-тиоксидантов, антигипоксантов и цитостатиков на основе гетероциклических соединений и обоснование их применения в служебном собаководстве / С.С. Зыкова // Автореф. ...дисс. д.б.н., Пермь - 2017.- 42с.
7. Инструкция к применению биологически активной добавки Кудесан / Электронный ресурс: http:/www.vidal.ru (дата обращения 12.02.2018).
8. Приказ ФСИН РФ от 29.04.2005 N 336 (ред. от 13.05.2008) "Об утверждении Наставления по организации кинологической службы Федеральной службы исполнения наказаний"/ www.consultant.ru (дата обращения 02.03.2018).
9. Медведева М.А. Клиническая ветеринарная лабораторная диагностика. Справочник для ветеринарных врачей. М.: Аквариум-Принт. - 2009. - 416 с.
УДК 619:616.98:578.833.3:636.2
ПРОТИВОВИРУСНАЯ АКТИВНОСТЬ КОМПЛЕКСНОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ПРЕПАРАТОВ В ПЕРСИСТЕНТНО ИНФИЦИРОВАННОЙ ВИРУСОМ ВД-БС КРС ПЕРЕВИВАЕМОЙ КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК ANTIVIRAL ACTIVITY OF THE COMPLEX USE OF DRUGS IN THE CELL CULTURE PERSISTENTLY INFECTED WITH BVDV
Никонова Анастасия Александровна Глотова Татьяна Ивановна, д-р биол. наук, Глотов Александр Гаврилович, д-р ветеринар. наук Сибирский федеральный научный центр агробиотехнологий Российской академии наук, Российская Федерация, Новосибирская обл., р.п. Краснообск Nikonova Anastasiia Aleksandrovna Glotova Tatyana Ivanovna, Dr. Bol. Sci.
Glotov Alexandr Gavrilovich, Dr. Vet. Sci. Siberian Federal Scientific Centre of Agro-BioTechnologies of the Russian Academy of Sciences, Russia, settlement Krasnoobsk, Novosibirsk district, Novosibirsk reg.
Аннотация: изучено противовирусное действие комплексного применения двух препаратов Рибавирин-липинт и Реаферон-ЕС-липинт в инфицированной нецитопатогенным биотипом вируса ВД-БС КРС культуре клеток коронарных сосудов теленка (КСТ). Установлено, что добавление этих препаратов в дозе 0,05 мг/мл и 30000 МЕ/мл соответственно к питательной среде Игла МЕМ на протяжении 12 последовательных пассажей культуры клеток приводило только к снижению инфекционной активности вируса ВД-БС КРС, но не освобождало ее от персистентной инфекции нецитопатогенным биотипом вируса.
Ключевые слова: культура клеток; противовирусные препараты; вирус вирусной диареи крупного рогатого скота.
Abstract: the antiviral effect of Ribavirin-lipint and Reaferon-EC-lipint in the KST cell culture infected with noncytopathic biotype of BVDV was studied. It was found that the addition of these drugs at a dose of 0.05 mg / ml and 30000 IU / ml, respectively, to the Eagle MEM medium for 12 consecutive passages of the cell culture reduced the infectious activity of BVDV, but did not release the cell culture from persistent infection by the noncytopathic biotype of the virus.
Key words: cell culture; antiviral drugs; bovine viral diarrhea
virus.
Вирусная диарея-болезнь слизистых оболочек крупного рогатого скота (ВД-БС КРС) - контагиозное заболевание, широко распространенное во всем мире и приносящее большие экономические убытки [1]. Заболевание имеет различные клинические формы проявления, которые могут неблагоприятно влиять на каждую стадию производства животноводческой продукции, но наиболее значимые его последствия - нарушения в репродуктивной сфере, сопровождающиеся абортами, бесплодием и врожденными уродствами плода [2].
Установлено, что нецитопатогенный (НЦП) биотип вируса ВД-БС КРС может вызывать персистентную пожизненную инфекцию (ПИ) у КРС и часто является контаминантом биологической продукции (культуры клеток, вакцины, эмбриональная сыворотка крови КРС, сперма и эмбрионы).
Инфицирование культур клеток вирусом ВД-БС КРС влияет на клеточные реакции и может искажать результаты экспериментальных и диагностических исследований, проводимых с использованием этих клеточных линий. По данным исследователей установлено, что более 30 % образцов культур клеток разного видового происхождения и до 60 % эмбриональной сыворотки крови были контаминированы вирусом ВД-БС КРС [4].
Присутствие вируса ВД-БС КРС было обнаружено во многих вакцинах, предназначенных как для медицины, так и для ветеринарии. Описан случай, когда вакцинация стельных телок привела к развитию ПИ у всех плодов и рождению ПИ телят. Кроме того, было установлено инфицирование вирусом ВД-БС КРС невакцинированных животных, содержащихся вместе с вакцинированными [6].
Таким образом, контаминация биологических продуктов вирусом ВД-БС КРС может снижать эффективность диагностических исследований, профилактических и противоэпизоотиче-ских мероприятий. Не смотря на то, что многие химические соединения показали противовирусную активность в отношении вируса ВД-БС КРС в условиях in vitro, опыты по их использованию для устранения персистентной инфекции в культурах клеток проводились редко.
Целью данной работы являлось изучение противовирусной активности комплексного использования двух препаратов, Рибавирин-липинт и Реаферон-ЕС-липинт, в инфицированной НЦП штаммом вируса ВД-БС КРС перевиваемой культуре клеток КСТ.
Методика. Перед проведением исследований культуру клеток КСТ и используемые в работе биологические препараты (химопсин, фетальная сыворотка крови) тестировали методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) для исключения их контаминации вирусом ВД-БС КРС. Затем культуру клеток инфицировали НЦП биотипом вируса
ВД-БС КРС. Из флакона с хорошо сформированным 48-часовым монослоем культуры клеток удаляли ростовую среду (среда Игла МЕМ с L-глутамином, с добавлением 5-10 % эмбриональной сыворотки крови теленка и 0,002 % антибактериального препарата канамицин), добавляли питательную среду (та же среда, но без добавления фетальной сыворотки) и 0,5 мл суспензии, содержащей штамм Бор вируса ВД-БС КРС. Инфицированную культуру клеток выращивали в обычных условиях в течение 3 пассажей, и вновь тестировали методом ОТ-ПЦР для подтверждения присутствия вируса в культуре клеток.
Препараты Рибавирин-липинт и Реаферон-ЕС-липинт разводили физиологическим стерильным раствором непосредственно перед использованием до максимально переносимой концентрации (МПК) для культуры клеток КСТ, которая составила 0,05 мг/мл для Рибавирина-липинт и 30000 МЕ/ мл для Реаферо-на-ЕС-липинт. При множественном пассировании зараженной культуры, препараты в МПК добавляли к ростовой среде, не удаляя ее на протяжении двух суток. Культуру клеток пересевали через каждые 48 часов. Таким образом, препараты в МПК воздействовали на культуру клеток весь цикл её развития. При каждом пассаже отбирали пробы культуры клеток и хранили их при минус 20оС до исследования посредством ОТ-ПЦР. Всего было проведено 12 последовательных пассажей культуры клеток в присутствии препаратов. Затем ее продолжали культивировать в обычных условиях, используя ростовую среду без добавления препаратов еще на протяжении 18 пассажей.
Готовили десятикратные разведения проб культуры клеток, отобранных после 3, 6, 9 и 12 обработок препаратами, а также - после 18 последующих пассажей после окончания обработки, которые исследовали методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени. В качестве положительного контрольного образца использовали суспензию тест-вируса, штамм ВК-1 с инфекционной активностью 6,75 log10 ТЦД50/мл, а отрицательного -неинфицированная культура клеток КСТ. Относительную вирусную нагрузку в образцах определяли пороговым методом сравнения графиков накопления продукта реакции [3].
Результаты исследований и их обсуждение. Исследование культуры клеток КСТ и используемых в работе биологиче-
ских препаратов методом ОТ-ПЦР перед проведением опыта показало отсутствие контаминации вирусом ВД-БС КРС. После заражения культуры клеток КСТ нецитопатогенным штаммом Бор вируса ВД-БС КРС и проведения трех последовательных пассажей, контаминация культуры была подтверждена методом ОТ-ПЦР.
Контроль эффективности обработки инфицированной культуры клеток препаратами осуществляли методом ОТ-ПЦР в двух вариантах: электрофорезном и в режиме реального времени. Результаты ОТ-ПЦР с проведением электрофореза показали, что все отобранные в ходе опыта пробы содержали РНК вируса ВД-БС КРС. Затем было выбрано 6 образцов обработанной препаратами культуры клеток, которые исследовали методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени. Результаты исследования представлены на рисунке.
Рисунок - Относительная вирусная нагрузка (log10 ТЦД50/мл) в пробах десятикратных разведений инфицированной вирусом вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота культуры клеток КСТ после обработки препаратами Рибавирин-липинт и Реаферон-ЕС-липинт (синий цвет -положительный контроль, культура клеток, инфицированная штаммом Бор до обработки препаратами; красный -3 пассаж культуры клеток во время обработки; зеленый - 6 пассаж; фиолетовый - 9 пассаж; голубой - 12 пассаж; оранжевый - 18 пассаж
культуры клеток после окончания обработки; серый - отрицательный контроль, неинфицированная культура клеток КСТ).
Как видно из данных, представленных на рисунке, в течение периода обработки культуры клеток, инфицированной НЦП биотипом вируса ВД-БС КРС одновременно препаратами Рибавирин-липинт и Реаферон-ЕС-липинт в концентрациях 0,05 мг/мл и 30000 МЕ/мл, соответственно, титр вируса ВД-БС КРС постепенно снижался. Однако после прекращения добавления препаратов к ростовой среде, титр вируса вернулся к перваначальному уровню. Не смотря на снижение титра вируса, его концентрация в культуре клеток оставалась высокой даже после 12 пассажей с препаратами и достигала 3,75 1о§10 ТЦД50/мл.
Ранее зарубежными исследователями при комплексном использовании одновременно двух препаратов: Рибавирин и ИНФ-а установлено также снижение вирусной нагрузки. Установлено, что одновременное применение препаратов Рибавирин и ИНФ-а в дозах 0,02 мг/мл и 100 МЕ/мл количество вирусной РНК в образцах супернатанта обработанной культуры снижалось до уровней, не выявляемых методом ОТ-ПЦР уже после второго пассажа [5].
Это не соответствует полученным нами результатам, что может быть связано с использованием препаратов разных производителей, а также с различиями биологических свойств тестируемых штаммов вируса ВД-БС КРС.
Кроме того, авторы статьи в работе исследовали только супернатант культуры клеток, что позволило им оценить снижение только внеклеточной формы вируса.
Для контроля над внеклеточной и внутреклеточной формами вируса мы определяли относительную вирусную нагрузку одновременно в супернатанте и в самой культуре клеток.
Выводы. Полученные результаты исследований свидетельствуют о том, что применение препаратов Рибавирин-липинт и Реаферон-ЕС-липинт позволяет снизить вирусную нагрузку на культуру клеток, но не приводит к ее освобождению от персистентной инфекции, обусловленной нецитопатогенным биотипом вируса ВД-БС КРС.
Список литературы
1. Глотов, А.Г. Вирусная диарея-болезнь слизистых оболочек крупного рогатого скота. Рекомендации /А.Г. Глотов, Т.И. Глотова, А.В. Нефедченко и др. - Новосибирск. - 2006. - 28 с.
2. Глотов, А.Г. Вирусная диарея: значение в патологии воспроизводства крупного рогатого скота / А.Г. Глотов, Т.И. Глотова // Ветеринария. - 2015. - № 4. - С. 3-8.
3. Ребриков, Д.В. ПЦР «в реальном времени» / Д. В. Реб-риков, Г. А. Саматов, Д. Ю. Трофимов и др. - М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009. - 215 с.
4. Урываев, Л. В. Анализ контаминации клеточных культур пестивирусом BVDV и микоплазмами / Л. В. Урываев, К.С. Ионова, А.В. Дедова и др. // Вопросы вирусологии - 2012. - № 5. - С.15-21.
5. Durantel, D. Effects of interferon, ribavirin, and iminosugar derivatives on cells persistently infected with noncytopathic bovine viral diarrhea virus / D. Durantel, S. arrouée-Durantel, N. Branza-Nichita et al. // Antimicrobial agents and chemotherapy. - 2004. -Vol. 48, № 2. - P. 497-504.
6. Palomares, R.A. Bovine viral diarrhea virus fetal persistent infection after immunization with a contaminated modified-live virus vaccine / R.A. Palomares, S.M. Marley, M.D. Givens et al. // Theri-ogenology. - 2013. - Vol. 79, № 8. - P. 1184-1195.
УДК 636.2: 619.615.1
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ТКАНЕВОГО ПРЕПАРАТА СЕЛЕТОН ПРИ БРОНХОПНЕВМОНИИ ТЕЛЯТ USE OF SELETON TISSUE PREPARATION IN BRONCHOPNEUMONIA OF CALVES
Орлов Матвей Михайлович,
Савинков Алексей Владимирович, д-р ветеринар. наук Самарская государственная сельскохозяйственная академия, Российская Федерация, г. Самара Orlov Matvey Mikhailovich
