CC BY
113
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ♦ Вирусология ♦
УДК:619:616.98:578.833.3
Патогенность изолятов различных биотипов вируса вирусной диареи -болезни слизистых оболочек для серонегативных телят
А.Г. Глотов1, доктор ветеринарных наук (glotov_vet@mail.ru), Т.И. Глотова1, доктор биологических наук, О.В. Семенова1, кандидат биологических наук, С.В. Котенева1, кандидат ветеринарных наук, А.А. Сергеев2, кандидат медицинских наук, А.Н. Сергеев2, доктор медицинских наук
1 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока» (Новосибирск).
2 Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» (Новосибирск).
Представлены результаты экспериментального заражения серонегативных телят двумя ЦП и тремя НЦП изолятами вируса ВД-БС, выделенными от КРС с различными клиническими проявлениями болезни, относящимися к типу 1 (субтипы 1а, 1b и 1d). Все тестированные изоляты обладали вирулентностью для телят 4...6-месячного возраста. Принадлежность к биотипу не влияла на способность вируса инфицировать органы лимфоидной системы и индуцировать «транзитную» лейкопению (до 2700.3800 кл/10-3 мл) в течение 8.10 суток, наступавшую у животных на 3.5-е сутки после заражения. ЦП изолят, относящийся к субтипу 1b, и НЦП изолят кластера 1d были наиболее вирулентными из изолятов, использованных для заражения, вызывали слабый респираторный синдром и кратковременную диарею. Вирулентность имела «штаммовую» зависимость.
Ключевые слова: биотипы, вирус диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота, лейкопения, полимеразная цепная реакция, субтипы, экспериментальное заражение
Сокращения: ВД-БС — вирусная диарея-болезнь слизистых оболочек, КРС — крупный рогатый скот, МТ— масса тела, МЭБ — Международное Эпизоотическое Бюро, НЦП — нецитопатогенный, ОРЗ — острое респираторное заболевание, п.з. — после заражения, ПЦР — полимеразная цепная реакция, РН — реакция нейтрализации, ТЦД — тканевая цитопатогенная доза, ЦП — цитопатогенный
Введение
Вирусная диарея - болезнь слизистых оболочек КРС широко распространена во всем мире и наносит значительный экономический ущерб молочному и мясному скотоводству.
Возбудитель болезни относится к роду Рез11у1гп8 семейства Flaviviridae [http://ictvon1ine.org/virusTaxon-ошу.аэр] и представлен двумя типами. Большинство штаммов относится к типу 1, а штаммы типа 2 более вирулентны, хотя распространены не так широко. Оба типа возбудителя вызывают одинаковую патологию, их циркуляция установлена в России [2, 3, 5, 6]. В настоящее время выделяют 15 субтипов вируса 1-го типа (от 1а до 1о) и, по меньшей мере, 4 субтипа вируса 2-го типа (от 2а до 2d). Оба типа представлены ЦП и НЦП биотипами с преобладанием НЦП [14]. Инфицированность КРС во всем мире составляет 60...85 % в зависимости от региональных особенностей [1, 2, 7, 14].
Считается, что вирус не является прямым респираторным патогеном, однако его способность вызывать иммуносупрессию значительно повышает риск воз-
никновения респираторных болезней у телят, связанный, в частности, с размножением вирусов других нозологических групп и бактерий семейства Pasteure1-1асеае [1, 2, 12, 14]. Механизм иммуносупрессивного действия вируса включает в себя лейкопению, снижение пролиферации лимфоцитов, истощение лимфоид-ной ткани, понижение хемотаксиса и фагоцитарной активности, повышение выработки простагландина Е2 и нарушение выработки провоспалительных цитоки-нов [8, 9, 11, 13, 14], которая в случае острой формы инфекции носит транзитный характер (2.3 недели). Учитывая существование вируса в виде двух биотипов, интерес исследователей всего мира вызывает определение его вирулентности и способности индуцировать развитие инфекционного процесса в организме восприимчивых животных. В доступной отечественной литературе данных о патогенности НЦП изолятов вируса для телят мы не нашли за исключением сообщения Г.К. Юрова и соавт. [7] об активной циркуляции в популяциях домашнего скота и диких животных РФ двух антигенно различающихся НЦП штаммов вируса субтипов 1а и 1ш.
Цель исследования
Определить вирулентность пяти изолятов вируса ВД-БС КРС 1-го типа, относящихся к двум биотипам, выделенных нами от больных животных в 1999-2006 гг. в Сибири, для серонегативных телят.
Материалы и методы
Подготовку проб, процедуру выделения, титрования и генотипирования изолятов вируса проводили в соответствии с методикой, описанной ранее [4, 6]. Для серологических исследований с целью установления сероконверсии к вирусу использовали микрометод РН
Патогенность изолятов вируса ВД-БС КРС двух биотипов для серонегативных телят
Изолят/источник выделения Субтип Форма проявления экспериментальной инфекции Длительность лейкопении (суток), ее значения (кл/мм3) Сероконверсия (+;-) Наличие генома вируса во внутренних органах
Цитопатогенные
Бизон-1/легкие теленка 1b Острая (ОРЗ, диарея) 3...10, до 2700 + Лимфоидные органы, эпителий кишечника и респираторные органы
Т1/легкие теленка 1b Острая (ОРЗ) 4...9, до 3200 ± Лимфоидные органы
Нецитопатогенные
Бизон/селезенка теленка 1d Острая (ОРЗ, диарея) 4.9, до 3200 + Лимфоидные и респираторные органы
Бор/сыворотка крови персистентно инфицированной нетели 1а Субклиническая 3.9, до 3600 + Лимфоидные органы
Т-2/сперма персистентно инфицированного быка-производителя 1b » 4.8, до 3500 ± Лимфоидные и респираторные органы
согласно стандарту МЭБ, а также ЦП штамм ВК-1, относящийся к типу 1. Распространение генома вируса во внутренних органах инфицированных животных изучали посредством ПЦР [6].
Изоляты вируса. Для экспериментального заражения использовали два ЦП: Бизон-1 (субтип 1b) и Т1 (1b), а также три НЦП изолята вируса ВД-БС КРС: Бизон (субтип 1d), Т-2 (1b) и Бор (1а), типированные нами ранее [6].
Подопытные животные. В эксперимент включили 18 серонегативных телят черно-пестрой породы в возрасте 4...6 месяцев, МТ 150 кг, подобранных по принципу аналогов, не содержащих в крови вирус ВД-БС, по данным ПЦР, и антител к нему Телят разделили на пять опытных и одну контрольную группы (по n=3 в каждой). Телята были выращены в условиях умеренно-пониженных температур и не подвергались воздействиям стрессов, включая транспортный и кормовой.
Экспериментальное заражение осуществляли при помощи генератора БГ-2, создающего аэрозоль с ме-дианно-массовым аэродинамическим диаметром частиц 1,1 мкм так, как это было описано ранее [4]. Суспензию вирусов вводили интраназально в дозе 4х105,5. 6,0 ТЦД50/01 мл. Контрольным животным таким же способом вводили физиологический раствор. За всеми животными наблюдали в течение 25 суток (с ежедневной термометрией, отбором проб крови для определения гематологических показателей). Пробы сыворотки крови отбирали до заражения и в момент окончания опыта для выявления сероконверсии.
На 12.13-е сутки опыта подвергали убою по одному теленку из каждой опытной группы с целью регистрации патолого-анатомических изменений во внутренних органах и обнаружения в них генома вируса. Для этого отбирали пробы слизистой оболочки носа, трахеи, носоглотки, миндалин, легочных и мезентериальных лимфатических узлов, бронхов, трахеального и бронхиального экссудатов, легких, селезенки, тонкого и толстого отделов кишечника. Для гистологических исследований пробы внутренних органов фиксировали в 10%-м растворе формалина, затем обезвоживали и заливали в парафин на аппарате Histomaster (Германия), после чего готовили срезы толщиной 7.8 мкм и окрашивали гематоксилином и эозином.
Полученные результаты обрабатывали при помощи компьютерной программы для анализа изображений «ВидиоТест-Мастер Морфология». Для обработки полученных данных использовали программу «Microsoft Excel».
Результаты и обсуждение
Результаты (табл.) экспериментального заражения показали, что наиболее вирулентный из исследованных ЦП изолятов — изолят Бизон. Он вызывал у всех инфицированных животных клинические признаки легкого респираторного заболевания, проявлявшегося в виде угнетения общего состояния на 4.5-е сутки после заражения, отказа от корма, повышения температуры тела до 41,9 оС, выделения серозного экссудата из носовой полости и глаз, кратковременной диареи с примесью крови. Уровень лейкопении находился в пределах 3200.2700 /10-3 мл. У одного подопытного теленка отмечали кратковременное увеличение предлопаточного лимфатического узла. Инфицированные животные выздоровели на 15-е сутки п.з., но у них отмечали значительное снижение МТ. Посмертные изменения во внутренних органах характеризовались скоплением пенистого экссудата в трахее и легких, увеличением регионарных лимфатических узлов, гиперемией слизистой оболочки тонкого отдела кишечника, увеличением брыжеечных лимфатических узлов. Геном вируса выявили во всех исследованных пробах внутренних органов, что свидетельствует о широком тропизме изолята к лим-фоидной ткани, а также к клеткам эпителия кишечника и респираторного тракта.
Вирулентность у изолята Т1 была ниже, чем у изолята Бизон. У инфицированных животных регистрировали кратковременные признаки острого респираторного заболевания, закончившегося их выздоровлением на 10.14-е сутки после заражения. Лейкопению регистрировали на 4.9-е сутки п.з. со значениями до 3800.3200/10-3 мл. На вскрытии вынужденно убитого теленка выявили аналогичные изменения, но выраженные слабее, чем у теленка, инфицированного изолятом Бизон. Геном вируса присутствовал только в лимфо-идных органах.
Все использованные нами в опытах НЦП изоляты вируса ВД-БС КРС, как и ЦП, индуцировали развитие инфекционного процесса в организме зараженных животных, проявлявшегося в виде легкого респираторного синдрома, либо повышения температуры тела и лейкопении.
На введение изолята Бор все инфицированные животные реагировали незначительным угнетением общего состояния, отказом от корма в период с 6-х по 10-е сутки п.з. У них на 5-е сутки регистрировали повышение температуры тела в среднем до 41,2 оС и снижение ее на 9-е сутки опыта. Количество лейкоцитов у животных этой группы также снижалось, начиная с 3-х суток п.з., достигая минимальных значений
Патогенность изолятов различных биотипов вируса вирусной диареи — болезни слизистых оболочек для серонегативных телят
(3800...3600/10-3мл) на 5.7-е сутки. Выздоровление экспериментально инфицированных животных регистрировали на 14-е сутки опыта. Патолого-анатомические изменения включали в себя незначительное увеличение мезентериальных лимфатических узлов, гиперемию слизистой тонкого отдела кишечника. Геном вируса выявили в лимфоидных органах (селезенка, легочные и мезентериальные лимфатические узлы).
Изолят Т-2, выделенный из спермы быка-производителя, вызвал у всех зараженных животных признаки, сходные с таковыми у телят, которым вводили изолят Бор. Молекулярные исследования также подтвердили широкое распространение вируса во внутренних органах экспериментально инфицированных животных, включая лимфоидные (селезенка, легочные и мезен-териальные лимфатические узлы).
Все телята, использованные в опыте, реагировали се-роконверсией к вирусу через 25 суток п.з. (срок наблюдения), что свидетельствовало о развитии у них активной инфекции. Титры вируснейтрализующих антител не превышали 1:16 и были выше у телят, инфицированных ЦП изолятами. Исключение составили телята, инфицированные изолятами вируса Т-1 и Т-2 (по одному из каждой группы), у которых в эти сроки не выявили реакции антителообразования на введение ЦП и НЦП изолятов, соответственно.
Возможно, что титры антител были бы выше при исследовании проб сыворотки этих животных в более поздние сроки. Все использованные в экспериментальных исследованиях изоляты вируса были обнаружены в лим-фоидных органах (легочные и бронхиальные, мезентериальные лимфатические узлы, селезенка).
У контрольных (неинфицированных) животных клинические и гематологические показатели находились в пределах физиологических норм.
Полученные нами результаты экспериментальных исследований показали, что несмотря на принадлежность к различным субтипам и биотипам, все использованные в опыте изоляты вируса ВД-БС КРС обладали вирулентностью для серонегативных телят в возрасте 4.6 месяцев. Клинические признаки варьировались от легкого респираторного синдрома и кратковременной диареи до субклинической формы инфекции, проявлявшейся в виде угнетения общего состояния, отказа от корма, повышения температуры тела и транзитной лейкопении, сопровождаясь диссеминацией вируса в широких пределах лимфоидной ткани, эпителиоид-ных клетках верхнего респираторного тракта и тонкого отдела кишечника.
Сроки выявления лейкопении у животных всех групп были в среднем одинаковыми — 3.5-е сутки п.з., то есть либо до развития видимой клинической реакции на введение вируса, либо одновременно с ней. Согласно данным литературы, этот показатель у инфицированных животных имеет патогенетическое и прогностическое значение, поскольку свидетельствует о развитии иммуносупрессии, способствующей суперинфицированию другими возбудителями вирусной и бактериальной природы [1, 3, 9].
Относительно низкие титры вируснейтрализующих антител у телят после выздоровления и отсутствие их у двух телят, вероятно, связаны с иммуносупрес-сивным действием вируса или ранними сроками серо-
логических исследований, поскольку, по некоторым данным [11], сероконверсия у инфицированных животных может развиваться через 3.12 недель п.з. Наши данные до некоторой степени согласуются с результатами, полученными М. Lambot et а1. [11], также выявившими низкие титры вируснейтрализующих антител при экспериментальном заражении телят различными биотипами вируса. У телят, не имеющих антител к моменту заражения вирусом, титры вирус-нейтрализующих антител достигали максимального значения 1:16.
Таким образом, тестированные нами НЦП изоляты вируса, выделенные от животных различного возраста, обладали разной вирулентностью для серонегативных к вирусу телят в возрасте 4.6 месяцев. Тяжесть проявления клинических признаков имела «штаммовую» зависимость. Принадлежность к биотипу не влияла на способность вируса инфицировать органы лимфоид-ной системы и индуцировать транзитную лейкопению (до 2700.3800/10-3 мл) в течение 8.10 суток, возникающую у животных на 3.5-е сутки п.з.
Ранее, а также в этой работе, нами была описана экспериментальная инфекция телят ЦП изолятами вируса, выделенными из легких больных животных, введение которых серонегативным к вирусу телятам 4.6-месячного возраста вызывало у них слабые признаки острого респираторного заболевания с кратковременной диарей [4]. Однако наибольший интерес представляло определение вирулентности НЦП изолятов вируса, выделенных из других источников (селезенка теленка, сыворотка крови персистентно инфицированной нетели и сперма персистентно инфицированного быка-производителя).
В данной работе мы нашли подтверждение тому, что некоторые НЦП изоляты вируса могут вызывать развитие слабого респираторного дистресса у безмолозивных телят и инфицировать органы иммунной системы организма.
Известно, что наиболее распространенной формой ВД-БС КРС является субклиническая, часто протекающая незамеченной ветеринарными специалистами. В данном случае важное биологическое свойство возбудителя — его способность вызывать состояние транзитной иммуносупрессии, в период которой животное становится восприимчивым к развитию респираторных болезней вследствие усиленного размножения коинфицирующих микроорганизмов. Роль НЦП биотипа вируса в возникновении респираторных болезней длительное время недооценивалась, и способность изолятов этого биотипа вызывать клиническую респираторную болезнь у КРС обсуждается с начала 90-х годов прошлого столетия [14]. Так, в этот период времени в США и Канаде были выделены несколько НЦП изолятов, относящихся ко второму генотипу вируса, вызывающих тромбоцитопению, геморрагии, лейкопению, лихорадку, диарею и гибель животных во время неосложненной первичной острой инфекции [13, 14], что во многом стимулировало интерес к болезни и изучению патогенности вируса для телят. Однако большинство штаммов первого генотипа способны вызывать либо субклиническую, либо «умеренную» острую форму болезни [12.14]. Впервые об экспериментальном воспро-
изведении респираторного заболевания при помощи вируса ВД-БС КРС сообщали L.N. Potgieter et al. в 1984 г. По их данным, у трех телят 6-месячного возраста, зараженных вирусом, развились признаки слабой респираторной болезни в виде лихорадки, выделений из носа и редкого кашля. При вскрытии экспериментально инфицированных животных выявляли поражения от 2 до 7 % поверхности легких.
M. Spagnuolo-Weaver et al. [15] изучали распространение НЦП биотипа вируса, выделенного из содержимого кишечника павшей коровы, во внутренних органах экспериментально зараженных телят с наличием и отсутствием колостральных антител. С помощью иммунофлуоресценции антиген вируса выявляли, в основном, в пробах тканей лимфоидной и желудочно-кишечной системы и незначительное количество в респираторных органах, в которые, возможно, вирус был занесен током крови во время транзитной виремии. К сожалению, авторы не указали тип и субтип использованного для заражения вируса. Знания о роли субтипов вируса в этиологии респираторных болезней молодняка КРС ограничены. Считается, что в этиологии респираторных болезней чаще участвуют изоляты субтипа 1b [3, 14.16].
В опытах V. Galav et al. [10] была продемонстрирована патогенность Индийского изолята вируса субтипа 1b для 7.9-месячных телят, у которых п.з. развились признаки респираторной болезни, двухфазной температурной реакции, легкой диареи, лейкопении и слабовыраженной тромбоцитопении. Виремия выявлялась с 3-х по 15-е сутки, а сероконверсия — через 15 суток п.з. Кроме этого, отмечали поражение почек в виде увеличения эндотелиальных клеток, пролиферации клеток глии и фагоцитов, приводившие к облитерации пространства гломерул. У животных наблюдали интерстициальную пневмонию, легкий гастроэнтерит, а также признаки системного распространения вируса. Авторы сделали заключение о том, что изолят вызывал развитие умеренной клинической болезни у телят, а гломерулонефрит был следствием острой формы ВД-БС КРС, что было отмечено впервые.
Наши результаты согласуются также с данными C. Baule et al., описавших первичную респираторную болезнь у иммунокомпетентных безмолозивных телят, экспериментально зараженных НЦП изолятом субтипа 1d [8].
В нашей работе вирулентность двух ЦП изолятов вируса субтипа 1b оказалась различной, аналогично трем НЦП изолятам, относящимся к разным субтипам, что подтверждает данные литературы о том, что вирулентность имеет «штаммовую» зависимость [8.14].
Выводы
Таким образом, можно заключить, что в настоящее время на территории Сибири циркулируют вирулентные ЦП и НЦП штаммы вируса ВД-БС КРС, способные вызвать развитие инфекционного процесса в организме серонегативных телят. Это говорит о необходимости целенаправленной специфической профилактики болезни.
Полученные результаты можно использовать при планировании противоэпизоотических мероприятий, предусматривающих, в том числе, комплексные диагностические исследования с целью расшифровки этиологической структуры конкретной вспышки респираторных болезней и выяснения этиологической роли каждого инфекционного агента, особенно НЦП биотипа вируса ВД-БС КРС.
Библиография
1. Глотов, А.Г. Распространение вирусных респираторных болезней крупного рогатого скота / А.Г. Глотов, Т.И. Глотова, О.Г. Петрова и др. // Ветеринария. — 2002. — № 3. — С. 17-21.
2. Гулюкин, М.И. Стратегия борьбы с вирусной диареей - болезнью слизистых крупного рогатого скота в животноводческих хозяйствах российской федерации / М.И. Гулюкин, К.П. Юров, А.Г. Глотов, Н.А. Донченко // Вопросы вирусологии. — 2013. — № 6. — С. 13-18.
3. Глотов, А.Г. Патогенность нецитопатогенных изолятов вируса вирусной диареи — болезни слизистых оболочек, для серонегативных телят / А.Г. Глотов, Т.И. Глотова, Ю.Н. Зайцев и др. // Вопросы вирусологии. — 2014. — Т. 59. — № 4. — С. 46-49.
4. Глотов, А.Г. Выделение и характеристика изолятов вируса диареи крупного рогатого скота / А.Г. Глотов, Т.И. Глотова, Е.И. Рябчикова, А.Н. Сергеев // Вопросы Вирусологии. — 2006. — Т. 51. — № 1. — С. 42-44.
5. Жидков, С.А. Роль вирусной диареи в этиологии респираторных и желудочно-кишечных болезней телят / С.А. Жидков, А.И. Лебедев, М.М. Гоголев // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. — 1995. — № 3. — С. 50-53.
6. Южаков, А.Г. Филогенетический анализ нецитопатогенных изолятов вируса диареи крупного рогатого скота / А.Г. Южаков, Г.И. Устинова, А.Г. Глотов, Т.И. Глотова, А.В. Нефед-ченко, О.В. Кунгурцева и др. // Ветеринария. — 2009. — № 6. — С. 29-32.
7. Юров, Г.К. Антигенные свойства нецитопатогенных штаммов вируса диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота / Г.К. Юров, С.В. Алексеенкова, К.А. Диас Хименес, М.П Неустроев., К.П. Юров // РВЖ.СХЖ. — 2013. — № 2. — С. 24-28.
8. Baule, C. Pathogenesis of Primary Respiratory Disease Induced by Isolates from a New Genetic Cluster of Bovine Viral Diarrhea Virus Type I / C. Baule et al. // Journal of Clinical Microbiology. — 2001. — N. 39. — P. 146-153.
9. Bruschke, C.J.M. Distribution of bovine virus diarrhoea virus in tissues and white blood cells of cattle during acute infection / C.J.M. Bruschke et al. // Vet. Microbiol. — 1998. — N. 64. — P. 23-32.
10. Galav, V. Pathogenicity of an Indian isolate of bovine viral diarrhea virus 1b in experimentally infected calves / V. Galav et al. // Res. Vet. Sci. — 2007. — N. 83 (3). — P. 364-368.
11. Lambot, M. Characterization of the immune response of cattle against non-cytopathic and cyto-pathic biotypes of bovine viral diarrhoea virus / M. Lambot et al. // Journal of General Virology. — 1997. — N. 78. — P. 1041-1047.
12. Potgieter, L.N. Experimental production of bovine respiratory tract disease with bovine viral diarrhea virus / L.N. Potgieter et al. // Am. J. Vet. Res. — 1984. — N. 45 (8). — P. 1582-1585.
13. Ridpath, J.F. Comparison of acute infection of calves exposed to a high-virulence or low-virulence bovine viral diarrhea virus or a HoBi-like virus / J.F. Ridpath et al. // American Journal of Veterinary Research. — 2013. — N. 74 (3). — P. 438-442.
14. Ridpath, J.F. Bovine viral diarrhea virus: global status. / J.F. Ridpath // Food Animal Practice. — 2010. — N. 26 (1). — P. 105-121.
15. Spagnuolo-Weaver, M. Distribution of cytopathic and noncytopathic bovine viral diarrhea virus antigens in tissues of calves following acute experimental infection / M. Spagnuolo-Weaver et al. // J. Vet Diagn Invest. — 1997. — N. 9 (3). — P. 287-297.
16. Vilcek, S. Bovine viral diarrhea virus genotype 1 can be separated into at least eleven genetic groups / S. Vilcek et al. // Arch. Virol. — 2001. — N. 146 (1). — P. 99-115.
SUMMARY
A.G. Glotov1, T.I. Glotova1, O.V. Semenova1, O.V. Koteneva1, A.A. Sergeev2, A.N. Sergeev2
11nstitute of Experimental Veterinary Science of Siberia and the Far East (Novosibirsk). 2 State Research Center of Virology and Biotechnology «Vector» (Novosibirsk).
Pathogenicity Isolates from Different Biotypes of Bovine Viral Diarrhea Virus in Experimentally Infected Seronegative Calves. The results of experimental infection of seronegative calves with two cytopathogenic (CP) and three noncytopathogenic (NCP) isolates of BVDV isolated from cattle with different clinical manifestations of the disease belonging to type 1 (subtype 1a, 1b and 1d) are submitted. All tested isolates showed the virulence for seronegative calves 4 to 6 months of age. Belonging to biotype did not correlated with the ability of the virus to infect the lymphoid tissues and to induce leucopenia. All isolates of the virus called «transiting» leukopenia (up 2700.3800 kl/10-3 ml) for 8.10 days after infection. CP isolate referred as 1b and NCP isolate from cluster 1d were more virulent and caused the development of a mild respiratory syndrome and short-term diarrhea. The virulence had «strain» dependence.
